鎖核酸探針多重?zé)晒釶CR快速檢測肉制品中4種動物肉摻假的研究

許如蘇　周廣彪魏霜　段建發(fā)　劉中勇　陳冠武

（汕頭出入境檢驗檢疫局　廣東汕頭　515031）

鎖核酸探針多重?zé)晒釶CR快速檢測肉制品中4種動物肉摻假的研究

許如蘇周廣彪*魏霜段建發(fā)劉中勇陳冠武

（汕頭出入境檢驗檢疫局廣東汕頭515031）

應(yīng)用鎖核酸探針技術(shù)建立同時檢測肉制品中牛、豬、雞、鴨4種動物肉摻假的方法。針對動物線粒體基因組的保守序列，設(shè)計特異性引物和Taqman-LNA探針，建立同時檢測肉制品中牛、豬、雞、鴨源性成分的多重Taqman-LNA熒光PCR方法，用于市售肉制品的檢測，同時采用標(biāo)準(zhǔn)方法進行驗證。結(jié)果顯示，建立的多重Taqman-LNA熒光PCR方法可同時檢測肉制品中上述動物源性成分，檢測限均達到肉含量的0.01%。將樣品Ct≤30，且｜樣品Ct-純?nèi)釩t｜≤7判為肉摻假；將樣品Ct≤30，且｜樣品Ct-純?nèi)釩t｜＞7判為肉污染。對200份市售肉制品檢測發(fā)現(xiàn)，有42份樣品摻入標(biāo)簽標(biāo)示以外肉種，有22份樣品存在肉污染，其中2份樣品暨摻假又污染。多重方法對肉源性成分的檢測結(jié)果與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法符合率達99%。本研究建立的方法可同時檢測肉制品中牛、豬、雞、鴨4種動物源性成分，具有特異、快速、經(jīng)濟、高通量等優(yōu)點，設(shè)定的肉摻假和肉污染判定標(biāo)準(zhǔn)合理，可有效避免肉污染導(dǎo)致的摻假誤判。

動物源性成分；摻假；鎖核酸探針；多重Taqman-LNA熒光PCR；肉制品

1　前言

因利益驅(qū)使，導(dǎo)致肉制品“摻假使假”事件頻發(fā)。2013年歐洲馬肉丑聞席卷了瑞典、英國、法國等多個國家，引起國際關(guān)注；在國內(nèi)，肉制品“摻假使假”時有報道，常見用豬肉、鴨肉等低價位肉摻入甚至代替高價位的牛羊肉［1，2］，并出現(xiàn)多肉種摻假趨勢［3］。打擊肉制品摻假已成為肉制品監(jiān)管的一項重要任務(wù)，因此急需解決肉種的高通量快速鑒別。

關(guān)于肉種鑒別已有很多研究報道，有基于蛋白質(zhì)的ELISA方法和基于核苷酸序列的分子生物學(xué)方法。其中，PCR技術(shù)以穩(wěn)定、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)勢而得到廣泛應(yīng)用［4-6］，并逐步成為肉種鑒別的標(biāo)準(zhǔn)方法［7-9］。但除了SN/T 2051-2008及SN/T 2980-2011采用多重實時PCR法同時檢測不同肉種外，其他標(biāo)準(zhǔn)均為單一肉種檢測，顯然，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法尚難以滿足肉制品打假的高通量快速鑒別需要。此外，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)［7，8］多數(shù)采用Ct≤35作為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，達到痕量檢測水平，然而肉制品生產(chǎn)、加工、銷售過程無法完全避免肉污染，因此存在因肉污染引起摻雜誤判導(dǎo)致執(zhí)法糾紛的可能。

本研究利用Taqman-LNA熒光探針可提升Tm值和雜交的特異性［10］，增加探針設(shè)計靈活性［11］等優(yōu)點，建立同時檢測肉制品中的牛、豬、雞、鴨成分的多重Taqman-LNA熒光PCR方法，實現(xiàn)高通量快速篩查，為打擊肉制品摻假使假提供高效檢測手段，并且通過合理設(shè)置摻假檢測限，可排除肉污染引起的摻假誤判。

2　材料與方法

2.1材料

2.1.1樣品

肉制品購自農(nóng)貿(mào)市場和超市，詳見表1。

表1　樣品信息

2.1.2儀器

熒光定量PCR儀（LightCycler?480）：Roche公司；高速離心機：Beckman公司；恒溫干熱器：Eppendorf公司。

2.1.3試劑

Probes Master 2×conc.：購自Roche公司；核酸提取（離心柱法）試劑盒：購自達安公司。

2.2方法

2.2.1DNA提取

參照文獻［12］進行。

2.2.2引物探針的設(shè)計與合成標(biāo)記

從GenBank上查找并下載牛、豬、雞、鴨線粒體基因組全序列，并參考近5年文獻發(fā)表的相關(guān)序列，使用ClustalX軟件進行序列比對，篩選出種屬相關(guān)的保守序列，使用Primer Express軟件設(shè)計引物探針，交上海輝睿生物科技有限公司合成。序列見表2。

表2　引物探針序列

2.2.3多重Taqman-LNA熒光PCR方法的建立

先將引物和探針分組配對，分別建立檢測牛、豬、雞、鴨的單重Taqman-LNA熒光PCR方法。在此基礎(chǔ)上組建多重方法，通過優(yōu)化各引物探針濃度和退火溫度并建立顏色補償曲線，減少相鄰熒光通道的干擾，最后確定多重方法的反應(yīng)體系為25 μL，其中Probes Master 2×conc.溶液12.5 μL，牛、豬、雞、鴨的引物終濃度分別為0.6 μmol/L、0.6 μmol/L、0.3 μmol/L、0.8 μmol/L，探針終濃度分別為0.3 μmol/L、0.3 μmol/L、0.1 μmol/L、0.4 μmol/L，DNA模板2 μL。反應(yīng)條件為95℃ 8 min，95℃ 8 s，59℃ 25 s；40個循環(huán)。

2.2.4摻假與污染閾值確定

在制備純牛肉樣本后將制樣設(shè)備簡單沖洗處理，再制備豬肉樣本，模擬肉污染樣本5份；另在制備純牛肉樣本后徹底清潔設(shè)備，精確制備含量為99%豬肉+1%牛肉的混合樣本5份；將上述樣本各自提取并檢測牛源性成分，設(shè)2次重復(fù)試驗，分析純牛肉、人為摻雜1%牛肉與模擬污染樣品的檢測結(jié)果。

采集繼加工牛肉丸后加工的豬肉丸 （疑似污染樣品）5份，檢測牛源性成分，分析檢測結(jié)果。

基于對模擬肉污染和對實際生產(chǎn)線的調(diào)查，以及方法的檢測限、摻假目的和方便判定考量，確定摻假和污染判定閾值。

2.2.5對市售肉制品的檢測及與標(biāo)準(zhǔn)方法的比較

用多重方法對市售肉制品進行檢測，同時采用SN/T 2051-2008、SN/T 2978-2011和SN/T 3731.5-2013對樣品進行檢測驗證。

表3　多重Taqman-LNA熒光PCR方法敏感性試驗結(jié)果

3　結(jié)果

3.1特異性試驗

與馬、牛、羊、豬、雞、鴨、鵝、驢、鹿、兔、蝦等動物源性DNA試驗結(jié)果，多重方法和單重方法的特異性一致，相應(yīng)通道僅與對應(yīng)的肉種出現(xiàn)特異性擴增，與其他肉種無典型擴增。

擴增產(chǎn)物經(jīng)送上海輝睿生物科技有限公司測序，結(jié)果與預(yù)期相符。

3.2敏感性試驗

牛、豬、雞、鴨單重方法的檢測限為0.01%-0.001%；多重方法的檢測限與單重方法一致或低1個數(shù)量級，但仍可檢測到肉含量的0.01%。結(jié)果詳見表3，多重方法的敏感性試驗擴增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線分別見圖1和圖2。

圖1　多重Taqman-LNA熒光PCR敏感試驗擴增曲線

圖2　多重Taqman-LNA熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3摻假和加工污染閾值的確定

純牛肉、1%牛肉、模擬污染樣品和疑似污染樣品的檢測結(jié)果見表4。

表4　摻雜與污染樣品牛源性成分檢測結(jié)果

按照現(xiàn)行檢測標(biāo)準(zhǔn)進行判定，表4中的模擬污染樣品和疑似污染樣品均可判為摻假。雖然按標(biāo)準(zhǔn)曲線推算，其肉含量不足0.01%，顯然為肉污染引起的摻假誤判。為避免該類誤判發(fā)生，基于上述數(shù)據(jù)分析、線性方程定量結(jié)果，考量摻雜利益需求情況，在方便判定的原則下，將樣品Ct≤30，有典型擴增曲線，且|樣品Ct-純?nèi)釩t|≤7判為肉摻假；將樣品Ct≤30，有典型擴增曲線，且|樣品Ct-純?nèi)釩t|＞7判為肉污染。

3.4對市售樣品的檢測結(jié)果及與標(biāo)準(zhǔn)方法檢測符合性比較

用多重方法共檢測市售樣品200份，檢出肉種成分與標(biāo)簽標(biāo)示成分不符樣品62份，樣品不合格率為31%。其中摻假42份，摻假率為21%，摻假成分為豬肉20份，鴨肉20份，同時摻入豬、雞、鴨肉2份；檢出肉污染22份，污染率為11%，其中污染鴨肉14份，雞肉4份，牛肉2份，豬肉2份；有2份樣品既摻假又有污染。從肉種看，摻假率較高的樣品為羊肉制品、牛肉制品和多肉種制品；從加工方式看，摻假率較高的樣品為丸類制品、調(diào)味較重的肉串和五香麻辣制品；從樣品來源看，農(nóng)貿(mào)市場和超市銷售的樣品摻假率較高，而餐飲店相對較低。

采用SN/T 2051-2008、SN/T 2978-2011和SN/ T 3731.5-2013對本次抽取的200份市售肉及肉制品進行相應(yīng)肉種檢測。其中采用SN/T 2051-2008 對200份樣品的牛、豬源性成分的檢測結(jié)果與多重方法對牛、豬源性成分的檢測結(jié)果完全相符，SN/T 2978-2011對樣品的雞源性成分的檢測結(jié)果與多重方法的檢測結(jié)果也完全相符，SN/T 3731.5-2013對樣品的鴨源性成分的檢測結(jié)果與多重方法的檢測結(jié)果99%相符，只有香酥牛肉丁和麻辣牛肉各1份檢測結(jié)果不符，為多重方法檢出鴨源性成分污染，而SN/T 3731.5-2013未檢出鴨源性成分。

4　討論

目前用于動物源性成分檢測的PCR方法都相當(dāng)敏感，DNA檢測的靈敏度達到了pg級［6，13］，相當(dāng)于含肉量的0.01%，甚至達到含肉量的0.001%。對于動物源性成分檢測研究以及檢測標(biāo)準(zhǔn)多采用方法的檢測限，以Ct≤35［6，8］，甚至以Ct＜40［14］作為判定標(biāo)準(zhǔn)。然而，由于肉及肉制品在加工、銷售過程存在肉污染風(fēng)險而易引發(fā)摻假誤判。本研究采用SN/T 2978-2011和SN/T 3731.5-2013對市售肉制品檢測發(fā)現(xiàn)，一些產(chǎn)品的檢測結(jié)果30＜Ct＜35，與純?nèi)怅栃詫φ障嗖?個循環(huán)以上，但按標(biāo)準(zhǔn)仍判為陽性。而按線性方程推算，陽性成分含肉量低于0.1%，甚至0.01%，這樣的人為摻假顯然不存在。為解決摻假誤判問題，本研究基于肉含量在100%-0.1%時，其DNA含量與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，100%肉與1%肉的DNA含量的Ct值理論上相差7左右，而摻假肉類的含量低于1%沒有經(jīng)濟效益的考慮，將|樣品Ct-純?nèi)釩t|≤7作為摻假檢測項，使方法更具實用性。

以多重PCR為基礎(chǔ)的肉類成分鑒別技術(shù)，具有檢測通量高、快速且節(jié)省檢測費用等優(yōu)點，但由于其需要在同一PCR體系里加入多對特異性引物和探針，復(fù)雜的PCR體系易造成方法靈敏度降低，對不同目標(biāo)序列擴增效率不一致和相鄰熒光通道的干擾，從而使得相關(guān)方法的推廣與標(biāo)準(zhǔn)化受到限制。本研究利用熒光PCR和LNA探針的優(yōu)點，設(shè)計了序列較短，擴增目的產(chǎn)物較小，長度為100 bp左右，但特異性強的引物探針，最大限度減少了不同引物探針對間的相互干擾，降低肉品加工過程加熱、加壓等處理對PCR擴增反應(yīng)的影響。

如采用PCR儀（Roche，LightCycler?480）進行檢測，尚需建立顏色補償曲線，消除相鄰熒光通道的熒光干擾，方可同時檢測肉制品中的牛、豬、雞、鴨等4種動物成分；如采用PCR儀（BIO-RAID，CFX96）進行檢測，則相鄰?fù)ǖ啦淮嬖跓晒飧蓴_，建立的多重方法敏感度與單重?zé)o差別，可直接同時檢測肉制品中的牛、豬、雞、鴨等4種動物成分。與何瑋玲等［15］應(yīng)用多重 PCR同時鑒定豬、牛、羊、雞相比，本多重方法可免去電泳，無需觸毒，可疑樣品無需酶切和測序等確證實驗，操作更簡便，也更快速、安全。與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法相比，本多重方法大大提高了檢測效率，降低檢測成本。

對市售肉制品檢測發(fā)現(xiàn)，鴨肉和豬肉是主要的摻假肉種，國內(nèi)一些大品牌產(chǎn)品，同樣存在摻假行為。一些商家鉆了標(biāo)簽標(biāo)準(zhǔn)的空子，對于多肉種的肉制品，往往以高價肉作為品名，而實際卻以低價肉為主，這應(yīng)引起監(jiān)管部門和標(biāo)準(zhǔn)制定者的重視。建議在對標(biāo)簽標(biāo)準(zhǔn)修訂時，應(yīng)明確標(biāo)簽需列明肉種及其含量，并僅限以主肉種作為品名，避免誤導(dǎo)消費者。

5　結(jié)論

本研究選用線粒體的保守序列設(shè)計特異性引物和Taqman-LNA探針，建立的多重Taqman-LNA熒光PCR方法具有良好的特異性和敏感性，設(shè)置的摻假檢測限符合肉制品摻假實際，可避免肉制品生產(chǎn)、加工過程中無意的肉污染引起的摻假誤判。本方法適用于肉制品摻假的快速檢測，具有操作簡便、快速、經(jīng)濟、高通量等優(yōu)點。

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Development of Multiplex Taqman-LNA Real-time PCR for Rapid Detecting Four Meat Adulteration in Meat and Meat Products

XU Rusu，ZHOU Guangbiao*，WEI Shuang，DUAN Jianfa，LIU Zhongyong，CHEN Guanwu
（Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shantou，Guangdong，515031）

To develop a multiplex taqman-LNA real-time PCR for the rapid detection of bovine，pork，chickenandduckadulterationinmeatandproductssimultaneously，species-specificprimersand taqman-LNA probes were designed based on the COI gene sequence of bovine，pork，chicken and duck.A multiplex taqman-LNA real-time PCR was developed for the rapid detection of the animals-derived ingredients in meat and products after optimization of the reaction conditions.The assay and standard method were simultaneously used to detect 200 samples from markets.The results showed that the assay coulddetect0.01%eachtargetmeatoffourmeatfromtheaboveanimalsinmeatproducts simultaneously.There was positive of adulteration for sample with the result|Ct（sample）-Ct（meat）|≤7，and positive of pollution for sample with the result|Ct（sample）-Ct（meat）|＞7&Ct（sample）≤30.42 of 200 samples from markets were found adulteration，21 of 200 meat products were found pollution by other meat.The results for detecting the samples by the assay were 99%consistent with the results of the standard methods.The assay was economic，high-throughput，rapid and specific，fit to detect bovine，pork，chicken and duck adulteration in meat and meat products simultaneously.There was a rational criterion for the result to avoid mistaking contamination to adulteration of meat effectively.

Aminal-DerivedIngredients；Adulteration；LockedNucleicAcidProbe；Multiplex taqman-LNA PCR；Meat and Products

TS207.3

E-mail：xurs64@126.com；*通訊作者E-mail：312480317@qq.com

廣東出入境檢驗檢疫局科技計劃項目（2014GDK24）

2015-10-20