2，4-二氯苯氧乙酸人工抗原合成及多克隆抗體的制備

王秋艷　張寧　秦朝秋　牛承輝

（遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局　遼寧大連　116001）

2，4-二氯苯氧乙酸人工抗原合成及多克隆抗體的制備

王秋艷張寧秦朝秋牛承輝

（遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局遼寧大連116001）

采用碳化二亞胺法，將2，4-二氯苯氧乙酸 （2，4-D）分別與牛血清白蛋白 （BSA）及卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)，得到完全免疫原2，4-D-BSA和包被原2，4-D-OVA，采用紫外掃描法判定偶聯(lián)結(jié)果；用2，4-D-BSA免疫新西蘭大耳白兔，采用間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定多抗血清效價(jià)、阻斷酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定其抑制曲線。結(jié)果表明：BSA與2，4-D偶聯(lián)后，波峰出現(xiàn)右移，且具有2，4-D特征峰，表明偶聯(lián)成功；2只新西蘭大耳白兔血清效價(jià)均達(dá)到了1∶5.12×105，且B號(hào)兔子多抗血清敏感性最好，半數(shù)抑制濃度IC50為47.64 ng/mL，表明成功獲得了高效價(jià)、特異性好、親和力較高的兔源抗2，4-D多克隆抗體血清，為2，4-D殘留免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定了良好基礎(chǔ)。

2，4-二氯苯氧乙酸；人工抗原；兔源多抗血清

1　前言

2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）是人工合成、類似于生長素的一種植物生長調(diào)節(jié)劑，分子式為C8H6C12O3，白色粉末，屬于苯氧羧酸類物質(zhì)，強(qiáng)酸性，較易溶于堿溶液、醇類和乙醚，不溶于石油和鈉鹽。2，4-D是常用的除草劑和植物生長調(diào)節(jié)劑［1］，能夠促進(jìn)細(xì)胞伸長和分裂、新器官的分化和形成，此外還可以防止果實(shí)脫落［2］。但是，2，4-D可以通過皮膚和呼吸系統(tǒng)進(jìn)入體內(nèi)，刺激人體分泌大量的雌性激素，干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)，對(duì)生殖和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響，具有潛在的致癌性和致突變性，許多國家都制定了該化合物在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留限量。目前，2，4-D殘留的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、氣-質(zhì)聯(lián)用或液-質(zhì)聯(lián)用法等［3］。色譜法具有分離速度快、檢測(cè)效率高、重現(xiàn)性好、靈敏度高等顯著優(yōu)點(diǎn)，但由于前處理比較復(fù)雜、儀器昂貴、技術(shù)難度大、檢測(cè)費(fèi)用高而且需要專業(yè)的技術(shù)人員等不足，難以應(yīng)對(duì)大批量樣品的快速檢測(cè)，大大限制了其廣泛應(yīng)用。因此，研制特異、敏感、快速、簡便的2，4-D檢測(cè)方法具有十分重要的意義。

2　材料與方法

2.1材料

2.1.1試劑

2，4-D標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于98%）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、碳化二亞胺（EDC）：購于Sigma公司；弗氏不完全佐劑（FCA）、弗氏完全佐劑（FIA）：Gibco產(chǎn)品；卵清蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）：購于Pierce公司；羊抗兔酶標(biāo)二抗：購于生工生物工程（上海）有限公司；其他相關(guān)試劑均為分析純。

2，4-D標(biāo)準(zhǔn)溶液：以無水二氧六環(huán)助溶，0.01 mol/L pH 7.4 PBS緩沖液為稀釋液，然后根據(jù)所需濃度進(jìn)行配制；包被液（CBS）：為0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液；洗液 （PBST）：為含0.05%（v/v）Tween-20的PBS；阻斷ELISA和間接ELISA所用的封閉液：為含5%豬血清（v/v）的PBST溶液；終止液：為2 mol/L的硫酸溶液。

2.1.2儀器

紫外掃描儀：日本島津公司；SpectraMax M5全自動(dòng)酶標(biāo)儀：美國美谷分子。

2.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4月齡的雌性新西蘭大白兔：購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2.2方法

2.2.1人工抗原的合成

稱取15 mg 2，4-D溶于1.5 mL無水二氧六環(huán)試劑中，分別加入90 mg 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 （EDC·HCl），53.5 mg N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），室溫下攪拌反應(yīng)6 h，即為2，4-D活化液。稱取40 mg BSA溶于6 mL碳酸鹽緩沖溶液中，即為BSA溶液。向BSA溶液中緩慢加入2，4-D活化液0.8 mL，室溫下磁力攪拌過夜；將反應(yīng)液放入透析袋，在500 mL的0.01 M的PBS中透析4次，制得2，4-D與BSA的偶聯(lián)物（2，4-D-BSA），保存在4℃的PBS中，備用。用同樣的方法偶聯(lián)雞OVA，制得包被原2，4-D-OVA。

2.2.2人工抗原的鑒定

用PBS稀釋2，4-D、BSA和2，4-D-BSA至合適溶度，在波長200-380 nm進(jìn)行紫外掃描，根據(jù)吸收峰的變化判斷偶聯(lián)是否成功。

2.2.3多克隆抗體的制備及檢測(cè)

2.2.3.1多克隆抗體的制備

取4月齡新西蘭大白兔2只，用制備好的免疫原2，4-D-BSA免疫，初免劑量為1.0 mg/只，二免、三免、四免劑量為0.5 mg/只。背部皮下多點(diǎn)注射，共免疫4次。首免，用無菌PBS稀釋2，4-D-BSA與等量弗氏完全佐劑（FCA）混合，25000 r/min充分乳化5 min；3周后加強(qiáng)免疫，用無菌PBS稀釋2，4-DBSA與等量弗氏不完全佐劑 （FIA）混合，25000 r/ min充分乳化5 min，免疫間隔2周。期間各在三免和四免后的第7天，耳靜脈采血1 mL，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)抗血清效價(jià)。4次免疫10 d后，頸動(dòng)脈采全血，用PBS稀釋100倍，3000 r/min離心15 min，棄沉淀，上層清液置于-20℃冰箱中備用。

2.2.3.2多抗血清效價(jià)測(cè)定

采用間接ELISA方法測(cè)定多抗血清效價(jià)，基本程序參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法［4］并加以改進(jìn)：2，4-D-OVA包被，包被濃度1 μg/mL，包被量100 μL/孔，4℃過夜，PBST洗板3次；5%豬血清封閉200 μL/孔，37℃溫育1 h，洗6次；加多抗血清，100 μL/孔，用封閉液倍比稀釋，設(shè)陰性對(duì)照（NC）和空白對(duì)照（BC），37℃溫育1 h，洗6次；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（用封閉液按1∶8000稀釋），100 μL/孔，37℃溫育45 min，洗6次；加酶底物TMB顯色100 μL/孔，室溫反應(yīng)15 min；加入100 μL/孔2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，讀OD450值；結(jié)果判斷：以待測(cè)孔OD450值≥NC OD450值的2.5倍（P/N≥2.5），判為陽性。

2.2.3.3多抗血清抑制曲線測(cè)定

采用阻斷ELISA鑒定其敏感性。步驟和效價(jià)測(cè)定相似，不同處在于第1步加OD450值為1.0的兔多抗血清50 μL和不同濃度的2，4-D標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μL作為抑制劑，即測(cè)定兔多抗血清對(duì)不同濃度2，4-D的抑制率。以吸光率 （B/B0）（B0為2，4-D標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0時(shí)吸光值，B為2，4-D標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度的吸光值）為縱坐標(biāo)，以不同濃度2，4-D 以10為底的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，進(jìn)行相關(guān)回歸分析，計(jì)算多抗血清對(duì)2，4-D 的IC50。

3　結(jié)果

3.1人工抗原的鑒定結(jié)果

利用紫外掃描儀在200-380 nm波長范圍進(jìn)行掃描，BSA的最大吸收峰為278 nm，2，4-D的最大吸收峰為281 nm。BSA與2，4-D偶聯(lián)后，波峰出現(xiàn)右移，且具有2，4-D特征峰（圖1），結(jié)果表明偶聯(lián)成功。

3.2多抗血清的制備及其效價(jià)測(cè)定結(jié)果

間接ELISA法檢測(cè)四免后兔血清的效價(jià)，見圖2。結(jié)果顯示 2只兔血清在四免后抗體效價(jià)均達(dá)到了1∶1.28×105以上，說明2，4-D-BSA獲得了較好的免疫效果，其中B號(hào)兔子最高血清效價(jià)為1∶2.56×105。

圖1　BSA、2，4-D和2，4-D-BSA的紫外掃描光譜

圖2　四免后兔血清效價(jià)

間接ELISA檢測(cè)終放后抗血清效價(jià)（圖3），結(jié)果顯示，2只兔血清抗體效價(jià)均達(dá)到了1∶5.12×105以上，表明成功獲得了高效價(jià)的2，4-D抗血清。

圖3　終放后兔血清效價(jià)

3.3多抗血清抑制曲線測(cè)定結(jié)果

由圖4可知，B兔子多抗血清標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的線性回歸方程為y＝-36.397logx＋61.579，回歸系數(shù)R2=0.9918，根據(jù)回歸方程可以計(jì)算出多抗血清對(duì)2，4-D的IC50為47.64 ng/mL，表明本實(shí)驗(yàn)所獲得的2，4-D抗血清對(duì)2，4-D具有較高的敏感性。

圖4　阻斷ELISA檢測(cè)抗血清的IC50

4　討論

由于2，4-D分子量很小，只有221.04，自身不具有免疫原性，因此需要和載體蛋白質(zhì)連接起來合成人工免疫原，才能刺激動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，從而制備抗體。對(duì)于小分子物質(zhì)制備人工抗原時(shí)，本身含有NH2、COOH、OH等活性基團(tuán)，可以利用待測(cè)物活性基團(tuán)加入間隔臂，然后聯(lián)入載體蛋白就可以成功合成人工抗原，制備特異性良好的抗體。如果自身不含有活性基團(tuán)或活性基團(tuán)對(duì)藥物的特異性和極性影響很大，半抗原要經(jīng)過改造或從頭合成。本研究中2，4-D具有COOH活性基團(tuán)，為此可以采用碳化二亞胺法，將2，4-D在合適的條件下分別與BSA和OVA偶聯(lián)，得到完全抗原2，4-D-BSA和2，4-D-OVA。

5　結(jié)論

本研究成功合成了2，4-D人工抗原，并以此免疫2只新西蘭大白兔，兔子的多抗血清效價(jià)均能達(dá)到1∶5.12×105，說明成功免疫誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。2只兔子的多抗血清均對(duì)2，4-D有抑制，其中B兔子抑制效果最好，IC50為47.64 ng/mL，成功的獲得了高效價(jià)、特異性好的兔源抗2，4-D的多抗血清，這為2，4-D單抗的制備和免疫學(xué)快速檢測(cè)方法的研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

［1］劉芯，李德紅，李玲.2，4-二氧苯氧乙酸的研究進(jìn)展［J］.生命科學(xué)研究，2004，8（4）：71-75.

［2］莊榮玉.菌毒清與2，4-D混用對(duì)溫州蜜柑保鮮貯藏的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27（12）：31-34.

［3］Giannarellia S，Muscatelloa B，Boganib P，et al.Comparative determination of some phytohormones in wild-type and genetically modified plants by gas chromatography-mass spectrometry and high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Analytical Biochemistry，2010，398（l）：60-68.

［4］ Engvall E，Perlmann P.Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.Quantitative assay of immunoglobulin G［J］.Immunochemistry，1971，8（9）：871.

Synthesis of 2，4-D Artificial Antigen and Preparation of its Polyclonal Antibody

WANG Qiuyan，ZHANG Ning，QIN Zhaoqiu，NIU Chenghui
（Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dalian，Liaoning，116001）

2，4-D separately coupling in carrier protein BSA and OVA by using EDC method.The conjugates of 2，4-D-BSA and 2，4-D-OVA were used as a immunogen and coating antigen respectively. UV was used to identify artificial antigen.New Zealand white rabbits were immunized with 2，4-D-BSA. The titers of polyclonal antiserum was detected by indirect ELISA，the sensitivity of polyclonal antiserum was identified by blocking ELISA.The animal immunization results showed that it was successfully coupled when the wave moved to the right after BSA and 2，4-D was coupling.Two rabbits indirect ELISA titers against 2，4-D were above 1∶5.12×105and the IC50of B rabbit was 47.64 ng/mL，This test was synthesized successfully 2，4-D artificial antigens，2，4-D polyclonal antiserum with high sensibility and specificity was gotten.This polyclonal antibody may lay a foundation for the further 2，4-D monoclonal antibody preparation and the immunology fast detection methods.

2，4-D；Artificial Antigen；Polyclonal Antiserum

Q819

E-mail：lndlwqy@163.com

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013IK167）

2015-10-27