應(yīng)用FR靶向PCR法檢測CTC在肺癌診斷中的臨床價值：初步研究

連歡歡 丁志丹 袁東風(fēng) 馬杰 秦建軍

肺癌是目前全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，并且在我國的發(fā)病率和死亡率高居榜首。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌總數(shù)的80%，是最為常見的肺癌，主要包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌即肺鱗癌、大細(xì)胞未分化癌三類。NSCLC的治療要根據(jù)肺癌的臨床分期來進(jìn)行。對I期、II期、IIIa期主要以手術(shù)切除為主，淋巴轉(zhuǎn)移顯著者于手術(shù)前可輔以化療或放療。經(jīng)手術(shù)后，I期患者5年生存率約70%，II期5年生存率約50%，III期能做手術(shù)或不能手術(shù)化放療聯(lián)合治療者5年生存率15%-30%[1,2]?；颊咧滤赖闹饕蚴荖SCLC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]。腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)是腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一[4]，因此對NSCLC患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell, CTC）檢測的研究已受到越來越多的重視。

CTC檢測將有助于NSCLC的早期診斷[5-7]、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測[8,9]、判斷患者預(yù)后和化療療效評估[10]。與淋巴結(jié)、骨髓相比，外周血標(biāo)本易獲得、創(chuàng)傷性小、可反復(fù)采集，是臨床上常規(guī)檢測較為理想的標(biāo)本來源。由于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT），目前利用CTC上皮表型（EpCAM）檢測惡性腫瘤患者CTC的方法有局限性[11]。NSCLC患者的CTC經(jīng)常不表達(dá)上皮細(xì)胞表型[12]。一個前瞻性的研究[13]顯示只有32%的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC患者（19/60）CTC計數(shù)大于CellSesrch檢測系統(tǒng)的基線值。

在一些癌癥中葉酸受體（folate receptors, FRs）表達(dá)量很高，特別是在卵巢癌和肺癌中，然而在正常組織中極少存在[14]。因此，F(xiàn)R可以作為一個用于肺癌患者CTC的檢測靶點。已有文獻(xiàn)[15]報道，基于FR靶向PCR CTC檢測方法的診斷肺癌的敏感度80%，特異性為88%。該方法尤其對I期NSCLC患者的診斷靈敏度達(dá)到67.2%[6]。

由于CTC可以評估腫瘤的發(fā)生發(fā)展?fàn)顟B(tài)[16]，而且手術(shù)切除原發(fā)灶后，血液中CTC數(shù)量應(yīng)該為陰性。因此，理論上而言，在術(shù)后監(jiān)測過程中，CTC數(shù)量陽性，可能提示腫瘤存在復(fù)發(fā)的可能性。目前僅有少數(shù)研究在這方面進(jìn)行了探索，Sawabata等[8]對9例接受肺葉切除術(shù)的NSCLC患者進(jìn)行了術(shù)前術(shù)后的CTC檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1例患者術(shù)前在外周血中檢出CTC，而有3例患者在手術(shù)后即刻檢測中在外周血中發(fā)現(xiàn)了CTC，所有患者在術(shù)后10天以后均無法檢出CTC。對于CTC在復(fù)發(fā)監(jiān)測中的作用，仍需更多研究來探索。

本研究的目的是驗證通過FR靶向PCR檢測CTC的方法用于肺癌特別是早期患者診斷的有效性和可行性及進(jìn)一步探究CTC在肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值。

1 材料與方法

1.1 樣本入組 2015年1月-2016年5月，研究共入組了97例即將接受治療的肺癌患者（包括但不限于肺鱗癌與肺腺癌）。入組樣本由河南省腫瘤醫(yī)院胸外科提供。所有患者已經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)確診。在研究之前，患者均未接受抗腫瘤治療或患有其他的腫瘤史。腫瘤分期根據(jù)第七版美國癌癥聯(lián)合委員會關(guān)于癌癥分期指南。此外，入組18例經(jīng)影像學(xué)或組織病理學(xué)確診為肺部良性疾病的患者?；颊咛卣饕姳?。

1.2 血液樣本處理 抽取4 mL外周血樣本，采用6 mL抗EDTA采血管（BD Diagnostics, Sparks, MD）收集。樣本儲存在4 ℃，并且在24 h內(nèi)完成血液處理。血液樣本取自即將做手術(shù)治療患者的肘前靜脈血。CTC檢測人員不知道檢測樣本的分組（單盲）。在檢測人員獲得樣本的時候，所有樣本已經(jīng)被“去標(biāo)識”了。

1.3 CTC檢測 CytoploRare?葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測試劑盒由格諾思博生物科技（上海）有限公司提供。試劑盒的原理如前所述[5-7]，且經(jīng)過改良用于肺癌患者的CTC檢測。簡單說，方法由兩部分組成：①免疫磁珠法負(fù)向富集葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細(xì)胞；②通過配體-靶向PCR定量檢測CTC。引物序列為：反轉(zhuǎn)錄（RT）引物（一段寡核苷酸用來偶聯(lián)腫瘤特異性葉酸配體），5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGTTCTAA-3′；前引物，5′-TATGATTATGAGGCATGA-3′；后引物，5′-GGTGTCGTGGAGTCG-3′；TaqMan探針，5′-FAM-CAGTTGAGGGTTC-MGB-3′[17]（圖1）。

根據(jù)試劑盒說明書，3 mL全血樣本中加入紅細(xì)胞裂解液（體積:體積=1:4），在4 ℃裂解15 min，去除紅細(xì)胞；然后，加入150 μL抗CD45磁珠和50 μL抗CD14磁珠，4 ℃孵育30 min，分別去除白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。之后，富集的CTC加入10 μL含有腫瘤特異性葉酸配體-寡核苷酸偶合物的探針標(biāo)記液，室溫孵育40 min。接著，這些樣品加入1 mL洗滌緩沖液，4 ℃，500g，離心10 min，重復(fù)三次，去除未結(jié)合的探針。最后，加入120 μL洗脫緩沖液，4 ℃孵育2 min，洗脫下已結(jié)合的探針，離心收集，加入24 μL中和緩沖液，用于熒光定量PCR擴增分析。在PCR分析階段，PCR信號與數(shù)據(jù)的收集都是通過ABI7300（Life Technologies, Carlsbad, CA）完成。ABI7300儀器反應(yīng)條件為：95 ℃變性2 min，40 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，8 ℃冷卻5 min；40個循環(huán)，95 ℃變性10 s，35 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s[18]。

研究中，我們設(shè)定一個自我定義的測量單位“Folate Unit”，即3 mL血液中檢測到的CTC水平。如果3 mL血液中檢測到1個CTC，就定義為1 Folate Unit。含有寡核苷酸的一系列標(biāo)準(zhǔn)品（從10-14到10-9，對應(yīng)濃度為2到2×105Folate Unit）用于CTC的定量分析。所有的血液樣本都是復(fù)孔檢測，且有6個標(biāo)準(zhǔn)品，3個質(zhì)控品（表1）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 Folate Unit通過中位值及四分位數(shù)間距描述。兩組之間CTC水平比較采用Mann-Whitney U檢驗分析，多組之間CTC水平比較采用Kruskal-Wallis檢驗。區(qū)別癌癥與非癌癥患者的最佳截域值（cutoff）是通過受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve,ROC）分析得到，并計算得到每個指標(biāo)的ROC曲線下面積（area under curve, AUC）。所有統(tǒng)計P值都是雙側(cè)檢測，且統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0 （SPSS Inc, Chicago, IL）或Prism 5.0（GraphPad Software Inc, San Diego, CA）處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 患者特征Tab 1 Characteristics of lung cancer and benign diseases

2 結(jié)果

2.1 患者臨床樣本CTC水平 良性疾病和肺癌患者CTC中位值分別為8.08（4.19-11.99）、16.57（2.81-44.65），肺癌患者CTC水平高于良性疾病患者（P＜0.001，圖2A）。

我們通過分析I期肺癌患者CTC的診斷價值來進(jìn)一步評估通過FR檢測CTC方法在早期診斷中應(yīng)用的實用性和可能性。良性疾病患者和I期肺癌患者CTC中位值分別為8.08（4.19-11.99）、15.39（2.81-39.09）（P＜0.001；圖2B）。

為探索肺癌患者CTC水平的意義，從受試者臨床和病理特征（如確診時患者的年齡（≤60歲vs＞60歲）、性別（男性vs女性）、吸煙史、腫瘤分級（G1vsG2vsG3）、TNM分期（I期-II期vsIII期-IV期）、病理亞型（ADCvsSCC）比較CTC的水平，結(jié)果如表2所示，年齡、性別、吸煙史、腫瘤分級及病理亞型與CTC無關(guān)，但TNM分期中III期-IV期患者CTC水平高于I期及II期患者CTC水平（P＜0.05），其中II期患者CTC水平略低于I期患者可能與前者入組樣本量較少有關(guān)。

2.2 ROC分析 ROC曲線是用來確定CTC對NSCLC（ADC和SCC）患者的診斷有效性，CytoploRare?葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測試劑盒對肺癌診斷的cutoff值為8.70 Folate Unit/3 mL，靈敏度為82.5%，特異度為72.2%，AUC為0.849（95%CI: 0.777-0.922）。該方法對I期肺癌患者的診斷靈敏度達(dá)到86.8%（33/38）。II期、III期、IV期肺癌患者陽性檢出率分別為70.6%（12/17）、84.6%（22/26）、76.9%（10/13）。

2.3 與其他腫瘤標(biāo)志物比較分析 我們通過比較CTC與目前臨床上普遍使用的肺癌腫瘤標(biāo)志物（NSE, CEA, CYFRA21-1），進(jìn)一步驗證FR靶向PCR CTC檢測方法對肺癌診斷的有效性。這些腫瘤標(biāo)志物檢測由Elecsys免疫分析儀（Roche Diagnostics, Bavaria, Germany）完成。

表2 肺癌患者CTC水平Tab 2 The CTC level of lung cancer

圖1 CytoploRare葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測試劑盒簡易流程圖Fig 1 The Flowchart of cytoplorare folate receptor-positive cell detection kit.CTC: circulating tumor cell.

如圖3A，通過FR靶向PCR檢測到的CTC較其他腫瘤標(biāo)志物有更大的AUC（0.859; 95%CI: 0.779-0.939），且更易去辨別患者是肺癌還是良性病，甚至該方法可以應(yīng)用于早期的肺癌患者診斷，如圖3B，通過FR靶向PCR檢測到的CTC對I期肺癌患者相較其他腫瘤標(biāo)志物有更大的AUC（0.912; 95%CI: 0.829-0.994）。

2.4 術(shù)后監(jiān)測 7例患者分別檢測術(shù)前、術(shù)后2周內(nèi)CTC水平，其中5例仍高于正常值，但其中僅1例在術(shù)后2周內(nèi)CTC水平明顯上升，其余均下降（圖4），手術(shù)后即時檢測CTC可發(fā)現(xiàn)術(shù)后升高患者，可能存在未被發(fā)現(xiàn)的隱匿病灶。

圖2 肺癌、I期肺癌及肺部良性疾病患者CTC水平。A：肺部良性疾病患者、肺癌患者CTC水平；B：肺部良性疾病患者、I期肺癌患者CTC水平。Fig 2 The CTC level in lung cancer, I stage of lung cancer and benign disease.A: The CTC level in lung cancer and benign disease; B: The CTC level in I stage of lung cancer and benign disease.

圖3 ROC分析比較CTC與肺癌一般腫瘤標(biāo)志物對肺癌的診斷能力。A：比較CTC與肺癌一般腫瘤標(biāo)志物曲線下面積（肺癌）；B：比較CTC與肺癌一般腫瘤標(biāo)志物曲線下面積（I期肺癌）。Fig 3 The diagnostic efficiency of CTC and investigating clinical biomarkers in lung cancer.A: AUC of CTC and investigating clinical biomarkers in lung cancer; B: AUC of CTC and investigating clinical biomarkers in I stage of lung cancer.AUC: area under curve.

圖4 肺癌術(shù)后患者CTC水平較術(shù)前變化趨勢圖Fig 4 The change of CTC level in lung cancer pre-operation and postoperation

3 討論

NSCLC患者的CTC檢測的敏感性和特異性仍然存在困難；盡管如此，這仍是一個需要發(fā)展的領(lǐng)域，目前還沒有通用的檢測方法適合所有類型的腫瘤[12]。CellSearch系統(tǒng)（Veridex, Raritan, NJ）是CTC的檢測建立標(biāo)準(zhǔn)評估系統(tǒng)的先驅(qū)者，該系統(tǒng)已經(jīng)獲得了美國食品藥品管理局批準(zhǔn)作為晚期乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌CTC的檢測[19]。該技術(shù)是依賴上皮細(xì)胞標(biāo)記物來識別CTC，然而，在肺癌EMT中丟失這些標(biāo)記物而致使該檢測方法無效[12,20]。另外，同理也很難通過EpCAM微流體CTC芯片檢測到NSCLC患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞。另外可以通過上皮腫瘤細(xì)胞大小分離檢測CTC，該技術(shù)基于細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，而不利用細(xì)胞表面免疫標(biāo)記物。之前有研究發(fā)現(xiàn)在肺癌患者中，通過上皮腫瘤細(xì)胞大小分離法檢測CTC的陽性率要高于CellSearch檢測系統(tǒng)[21]。然而，捕獲的細(xì)胞缺少后續(xù)的常規(guī)細(xì)胞學(xué)驗證，假陽性率高需要采用免疫表型特征學(xué)去改進(jìn)此方法[22]。

FR是一種細(xì)胞表面受體糖蛋白，它主要是在卵巢癌和肺癌腫瘤中高表達(dá)，目前是NSCLC患者藥物治療的一個潛在的重要靶點[23]。一項研究[24]表明在大約75.7%NSCLC患者中FR是過量表達(dá)的，而且在肺腺癌中的表達(dá)水平更高于肺鱗癌。盡管一些正常組織包括肺部正常組織也能表達(dá)FR，但在血液中除了活性巨噬細(xì)胞亞群外其他沒有非正常細(xì)胞能夠表達(dá)功能性FR。然而這些活性巨噬細(xì)胞在健康志愿者或者肺部良性疾病患者中很難被檢測到。在本研究中，我們將FR靶向PCR CTC檢測方法應(yīng)用于肺癌，發(fā)現(xiàn)肺部良性疾病患者中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的水平低于肺癌組（P＜0.001）。FR靶向PCR法是我們CTC檢測方法中另一個核心技術(shù)，該方法通過負(fù)向篩選CTC，后經(jīng)葉酸配體-寡核苷酸標(biāo)記富集的CTC，最后通過RT靶向PCR定量分析。Parker等[14]通過使用定量放射配體結(jié)合分析法得出NSCLC樣本每毫克溶解膜蛋白表達(dá)的FR平均水平為6.11 pmol，這意味著在一個NSCLC細(xì)胞表面大約有多余10萬的FR。在NSCLC患者外周血中每一個循環(huán)腫瘤細(xì)胞就能增加10萬個數(shù)量級的連接葉酸的寡核苷酸和葉酸受體。通過這兩級放大，可以檢測到3 mL血液樣本中極少量的CTC。

循環(huán)中檢測出CTC并不一定意味著患者已經(jīng)存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移是個相對復(fù)雜的過程。CTC侵襲入原發(fā)灶以外的第二器官（如骨髓等），可稱之為DTC（disseminated tumor cells）[25]。一般而言，具有干細(xì)胞特征的DTC聚集成團(tuán)，并且形成微轉(zhuǎn)移灶，同時該轉(zhuǎn)移灶可以逃避免疫系統(tǒng)的識別，腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移才可能發(fā)生[26,27]。在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞會表現(xiàn)出更多的間葉表型特征，失去正常情況下細(xì)胞間的相互作用，即存在EMT過程，從而使其更容易侵入血管內(nèi)皮而進(jìn)入血循環(huán)[28]。在EMT過程中，腫瘤細(xì)胞下調(diào)了上皮組織特定標(biāo)記物如CK和上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）的表達(dá)，上調(diào)了間葉組織標(biāo)記物如波形蛋白的表達(dá)[29,30]。但是，EMT并不是一個“全或無”的過程，很多CTC可以同時表達(dá)間葉組織標(biāo)記物和上皮組織。這對現(xiàn)行的一些CTC的檢測方法有著重要的影響。例如針對上皮組織標(biāo)記物的檢測方法就無法檢測到發(fā)生EMT的CTC。

另外一個重要的問題是，早期腫瘤外周循環(huán)中是否可以檢測到CTC，也就是說CTC遷移入血的過程是發(fā)生在腫瘤早期還是晚期？理論上講，腫瘤大小超過2 mm左右時便可誘導(dǎo)血管生成進(jìn)入腫瘤，提供血供，從而為腫瘤細(xì)胞遷移入血提供基礎(chǔ)。Husemann等[31]通過研究證實了，在轉(zhuǎn)基因小鼠種植后約17周-18周，循環(huán)中即可檢出CK與HER2同時陽性表達(dá)的細(xì)胞，而此時原發(fā)腫瘤體積還小于1 mm3。另有研究的結(jié)果也再次印證了上述結(jié)果[32,33]，其中He等[33]將表達(dá)中等量FR的M109鼠肺癌細(xì)胞通過皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部側(cè)面。移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分鐘可以檢測到大約1.4個CTC細(xì)胞。而到了移植后的第3周和第4周，則每分鐘可分別檢測7個和18個CTC。隨著腫瘤逐漸增大，CTC的數(shù)量呈指數(shù)級別上升。在腫瘤移植的前4周內(nèi)，沒有在任何組織切片中發(fā)現(xiàn)存在轉(zhuǎn)移性癌癥的跡象。因此，理論上而言，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期，循環(huán)中即可檢出CTC。最近有研究表明，胰腺癌模型在腫瘤進(jìn)展的早期階段，甚至在惡化之前就能夠檢測到CTC，這意味著CTC可以作為癌癥的早期診斷的一個潛在的生物標(biāo)志物。我們的研究結(jié)果同樣表明，通過FR靶向PCR檢測CTC的方法在I期肺癌患者中檢測靈敏度達(dá)到86.8%。在我們研究中的受試者同樣需要接受肺癌腫瘤標(biāo)志物的檢測，如NSE、CEA、CYFRA21-1，比較他們與CTC的診斷能力。與這些腫瘤標(biāo)志物相比，F(xiàn)R靶向PCR CTC檢測方法具有最高的AUC。

本研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者術(shù)后兩周內(nèi)檢測CTC水平明顯升高，既往文獻(xiàn)也發(fā)現(xiàn)，手術(shù)中或術(shù)后即時檢測CTC，會發(fā)現(xiàn)CTC水平的升高，可能原因：手術(shù)擠壓導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞入血（非轉(zhuǎn)移性）或者肺部創(chuàng)傷，導(dǎo)致大量肺上皮細(xì)胞入血。在術(shù)后一個月檢測CTC如果水平升高，可能存在未被發(fā)現(xiàn)的隱匿病灶。我們研究中入組的部分樣本在持續(xù)隨訪中。

總之，F(xiàn)R陽性CTC可以作為肺癌有效的生物診斷標(biāo)記物，甚至應(yīng)用于早期腫瘤診斷。進(jìn)一步探索肺癌患者術(shù)前CTC水平和預(yù)后的相關(guān)性及術(shù)后的實時監(jiān)測復(fù)發(fā)是必要的。