Amorphigenin聯(lián)合順鉑對(duì)人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞的協(xié)同抗腫瘤作用

鐘紅珍 左瑜芳 巫鑫 彭艷 何會(huì)萍 楊俊 官成濃 徐祖敏

目前肺癌發(fā)病率、死亡率居首位[1]。臨床上通常將肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌占85%[2]。而肺癌的化學(xué)治療主要采用順鉑聯(lián)合吉西他濱、紫杉醇等當(dāng)中的一種[3]。雖然化療在肺癌的治療中取得了一定的進(jìn)展，但5年總生存率仍較差，低于16%[4]。順鉑耐藥是影響肺癌化療療效的重要因素之一。因此，克服肺癌對(duì)順鉑的耐藥具有重要的意義。Amorphigenin是從紫穗槐的種子中提取得到的一種魚藤酮類化合物[5]。研究[6-8]發(fā)現(xiàn)amorphigenin有多種生物活性，如抗增殖作用、護(hù)肝作用、抑制神經(jīng)氨酸酶的作用及抑制肺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、口腔癌，白血病、前列腺癌、乳腺癌等細(xì)胞的生長。雖然amorphigenin可抑制人肺腺癌細(xì)胞A549[7]和人肺癌細(xì)胞Lu-1[8]的生長，但amorphigenin對(duì)耐順鉑肺腺癌A549/DDP細(xì)胞的作用及抗腫瘤作用的機(jī)制目前在國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究的目的是研究amorphigenin對(duì)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP的抗腫瘤作用并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Amorphigenin由廣東醫(yī)科大學(xué)天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，純度＞95%[5]。順鉑購于江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，二甲亞砜（DMSO）從美國MP Biomedicals LLC公司購買，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購買于美國Gibco公司，胰酶購于吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，碘化丙錠（PI）和FITC Annexin V 凋亡檢測(cè)試劑盒購自于美國BD公司，兔抗人PARP、caspase-3、LRP抗體購買于Sigma公司。辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、鼠抗人GAPDH多克隆抗體均購買于碧云天公司。Amorphigenin用DMSO溶解，配制成50 μmol/L的儲(chǔ)存液，-20 ℃冰箱貯存。實(shí)驗(yàn)前用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，將DMSO的終濃度控制在＜0.1%。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP和A549細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存并常規(guī)傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 U/mL）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞每2天-3天常規(guī)傳代一次，所有實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均使用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.3 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞懸液，按5.0×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中孵育過夜后，分別加入終濃度為0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L的amorphigenin或終濃度為2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的順鉑。于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h、48 h后，棄去原來的培養(yǎng)液，然后每孔加入按說明書新配制的100 μL CCK-8試劑，再于培養(yǎng)箱孵育2 h后，用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測(cè)吸光值。按照下列公式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的存活率：存活率%=實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值×100，并計(jì)算48 h的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration, IC50）。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，消化成單個(gè)細(xì)胞懸浮液，500個(gè)細(xì)胞/孔接種于6 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長穩(wěn)定時(shí)，加入終濃度為0.062,5 μmol/L、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L的amorphigenin，空白對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)基。放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 d，當(dāng)形成肉眼可見的細(xì)胞克隆后終止培養(yǎng)，用PBS洗2次，再用甲醇固定，然后用結(jié)晶紫染色，洗凈晾干，在顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。克隆形成率%=（實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/對(duì)照組克隆數(shù)）×100%。

1.5 聯(lián)合指數(shù)計(jì)算 我們使用Chou-Talalay方法研究藥物組合的協(xié)同的可能性[9]。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞懸液，按5.0×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中孵育過夜后，除去原來的培養(yǎng)基；先用濃度為0.5 μmol/L、1 μmol/L的amorphigenin處理人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP 24 h后；再用濃度為2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的順鉑處理24 h；棄去原來的培養(yǎng)液，然后每孔加入按說明書新配制的100 μL CCK8試劑，再于培養(yǎng)箱孵育2 h后，用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測(cè)吸光值。按照下列公式計(jì)算細(xì)胞的存活率：存活率%=實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值×100。使用CompuSyn軟件自動(dòng)計(jì)算出兩藥的聯(lián)合指數(shù)及描繪出兩藥等效圖，在等效圖中（D1/Dx1）為橫坐標(biāo)，（D2/Dx2）為縱坐標(biāo)，D1、D2為兩藥合用產(chǎn)生x效應(yīng)時(shí)兩藥各種所需的濃度，而Dx1、Dx2則為兩藥單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生x效應(yīng)時(shí)兩藥各自的濃度；根據(jù)Chou-Talalay定理規(guī)定CI＜1則兩藥聯(lián)合為協(xié)同作用，CI=1則為相加作用，CI＞1，則為拮抗[10]。

1.6 細(xì)胞凋亡測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，消化成單個(gè)細(xì)胞懸液，8×103個(gè)細(xì)胞/ 孔，接種于6孔板，置于培養(yǎng)箱孵育過夜，加入終濃度為0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L的amorphigenin，聯(lián)合組amorphigenin濃度為0.5 μmol/L和順鉑濃度為10 μg/mL，處理48 h后，消化收集細(xì)胞，用PI和FITC Annexin V染色，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，未處理組細(xì)胞為對(duì)照組。

1.7 免疫印跡實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔的密度接種于6 cm培養(yǎng)皿中，孵育過夜后按以下方法加入藥物：amorphigenin組（0.5 μmol/L)、順鉑組（10 μg/mL)、amorphigenin聯(lián)合順鉑組，處理48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度，取12 μg總蛋白上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗于4 ℃冰箱孵育過夜，辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，洗膜后辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光顯色法對(duì)膜進(jìn)行顯色曝光。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行單因素方差分析或t檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以Mean±SD表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Amorphigenin對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549及耐順鉑株A549/DDP的生長抑制作用 CCK-8結(jié)果顯示順鉑能抑制A549/DDP和A549細(xì)胞的生長，A549/DDP的48 h的IC50為（16.91±1.60）μmol/L，而A549的48 h的IC50為（2.84±0.18）μmol/L，A549/DDP的耐藥倍數(shù)約為9.7倍（圖1A），表明A549/DDP對(duì)順鉑具有明顯的耐藥性。此外，amorphigenin呈濃度依賴性地抑制耐順鉑株A549/DDP的生長（圖1B），其48 h的IC50為（2.19±0.92）μmol/L。這些結(jié)果表明amorphigenin對(duì)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP有明顯的增殖抑制作用。

2.2 Amorphigenin抑制人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP的克隆形成 分別用0.062,5 μmol/L、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L的amorphigenin處理人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP 15 d，形成的克隆數(shù)目隨濃度增加而逐漸減少（圖2A）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)0.062,5 μmol/L、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L的amorphigenin作用于A549/DDP細(xì)胞時(shí)，克隆形成率分別為（84.31±4.46）%、（42.49±8.65）%和（9.94±5.89）%（圖2B）。這提示amorphigenin能以濃度依賴方式抑制人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP的克隆形成。

圖1 Amorphigenin對(duì)肺腺癌耐順鉑細(xì)胞A549/DDP的增殖抑制作用。A：不同濃度的順鉑作用于A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞48 h；B：Amorphigenin作用于A549/DDP細(xì)胞24 h或者48 h。**：P＜0.01，與對(duì)照組比較。Fig 1 Amorphigenin could significantly inhibit the proliferation in cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma A549/DDP cells.A: A549 and A549/DDP cells were treated with increasing concentrations of cisplatin for 48 h; B: A549/DDP was treated with increasing concentrations of amorphigenin for 24 h or 48 h.**: P＜0.01, compared with the control group.

圖2 Amorphigenin抑制肺腺癌耐順鉑細(xì)胞A549/DDP的克隆形成。A：細(xì)胞培養(yǎng)15天后，用結(jié)晶紫染色。B：在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)細(xì)胞克隆數(shù)目。*：P＜0.05，**：P＜0.01，與對(duì)照組比較。Fig 2 Amorphigenin inhibits the colony formation of cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma A549/DDP cells.A: Colonies were stained with crystal violet at 15 days after culture; B: The number of colonies was counted under microscope.*: P＜0.05, **: P＜0.01,compared with the control group.

2.3 Amorphigenin誘導(dǎo)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP凋亡 我們采用了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了amorphigenin處理后A549/DDP細(xì)胞的凋亡率。用0.5 μmol/L-16 μmol/L濃度的amorphigenin處理人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP 48 h，采用PI和FITC Annexin V雙染法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果顯示amorphigenin呈濃度依賴性地誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞的凋亡，當(dāng)amorphihenin濃度為0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L時(shí)，凋亡率分別為（7.50±1.70）%、（9.20±0.56）%、（13.13±2.24）%、（13.7±4.62）%、（28.93±8.17）%和（69.53±10.52）%（圖3A，圖3B）。為了更進(jìn)一步說明凋亡途徑的激活可能與amorphigenin誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)，我們采用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白PARP的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著amorphigenin濃度的升高，PARP的蛋白表達(dá)水平逐漸減少，而cleaved PARP的蛋白表達(dá)水平逐漸增加，提示amorphigenin可能是通過激活PARP通路從而誘導(dǎo)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP細(xì)胞凋亡（圖3C，圖3D）。這些結(jié)果證明了amorphigenin能誘導(dǎo)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP凋亡。

圖3 Amorphigenin誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞株A549/DDP凋亡。A、B：Amorphigenin處理A549/DDP細(xì)胞48 h；C、D：Amorphigenin對(duì)PARP和cleaved PARP蛋白的影響。*：P＜0.05，**：P＜0.01，與對(duì)照組比較。Fig 3 Amorphigenin could induce apoptosis in A549/DDP cells.A and B: A549/DDP cells were treated with increasing concentrations of amorphigenin for 48 h; C and D: The levels of PARP and cleaved PARP.*: P＜0.05，**: P＜0.01, compared with the control group.

2.4 Amorphigenin聯(lián)合順鉑對(duì)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP具有協(xié)同的抗腫瘤作用 我們先用濃度為0.5 μmol/L、1 μmol/L的amorphigenin處理人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP 24 h后，再用濃度為2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的順鉑處理24 h，然后采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)順鉑與0.5 μmol/L、1 μmol/L的amorphigenin聯(lián)合處理后，順鉑的24 h的IC50分別為（15.86±2.91）μg/mL、（5.18±1.94）μg/mL，較單獨(dú)應(yīng)用順鉑時(shí)（37.99±10.63）μg/mL明顯減低（圖4）。這表明amorphigenin能增強(qiáng)順鉑對(duì)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP的生長抑制作用。且根據(jù)等效線圖分析示: Amorphigenin和順鉑10個(gè)組合濃度中，9個(gè)組合的濃度的CI＜1，1個(gè)組合濃度CI＞1；具體CI值：當(dāng)濃度為0.50 μmol/L的amorphigenin聯(lián)合2.5 μg/mL的順鉑時(shí)CI為1.31，提示拮抗作用；0.50 μmol/L的amorphigenin聯(lián)合5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的順鉑時(shí)CI分別為0.97、0.77、0.75、0.82，提示是協(xié)同作用；同樣濃度為1.00 μmol/L的amorphigenin聯(lián)合5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的順鉑時(shí)CI分別為0.60、0.52、0.58、0.60、0.66，提示是協(xié)同作用（圖5A， 圖5B）。這提示兩藥聯(lián)合呈協(xié)同作用。

2.5 Amorphigenin增強(qiáng)順鉑對(duì)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP的凋亡作用 我們采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了兩藥聯(lián)合時(shí)對(duì)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP凋亡的作用，單用amorphigenin時(shí)凋亡率為（10.40±1.77）%，單用順鉑時(shí)凋亡率為（43.90±6.22）%，兩藥聯(lián)合時(shí)凋亡率則達(dá)到（75.27±8.29）%（圖6A， 圖6B）。此外我們還采用了免疫印跡技術(shù)檢測(cè)caspase-3、PARP蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，amorphigenin聯(lián)合順鉑與單用amorphigenin或順鉑相比，pro-caspase-3、PARP的蛋白表達(dá)明顯減少，cleaved PARP和cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)明顯增加（圖6C-圖6F）。總之，amorphigenin增強(qiáng)順鉑對(duì)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP的凋亡作用。

圖4 Amorphigenin聯(lián)合順鉑增強(qiáng)對(duì)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP的增殖抑制作用Fig 4 Combination of amorphigenin with cisplatin enhances the inhibition effects on cisplatin-resistant lung cancer cells

圖5 Amorphigenin聯(lián)合順鉑對(duì)人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞的協(xié)同抗腫瘤作用。濃度為0.5 μmol/L（A）和1 μmol/L（B）的amorphigenin聯(lián)合濃度為2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的順鉑的CI值。根據(jù)Chou-Talalay定理規(guī)定CI＜1則兩藥聯(lián)合為協(xié)同作用，CI=1則為相加作用，CI＞1，則為拮抗。Fig 5 Synergistic antitumor effect of amorphigenin combined wih cisplatin in human lung adenocarcinoma cell A549/DDP.CI values for amorphigenin at 0.5 μmol/L (A) and 1 μmol/L (B) in combination with 2.5 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 40 μg/mL cisplatin against A549/DDP cells.CI is a quantitative definition for synergism where CI＜1, additive effect where CI=1 and antagonism where CI＞1.

圖6 Amorphigenin增強(qiáng)順鉑對(duì)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP的凋亡作用。A、B：分別用amorphigenin或/和順鉑處理A549/DDP細(xì)胞48 h；C、E和G：Caspase-3、PARP和LRP的Western blot檢測(cè)結(jié)果； D、F和H：Caspase-3、PARP和LRP含量變化的柱狀分析圖。*：P＜0.05，**：P＜0.01，與對(duì)照組比較。Fig 6 Combination of amorphigenin with cisplatin enhances the antitumor effects on A549/DDP cells.A and B: A549/DDP cells were treated with amorphigenin or cisplatin alone or combined with amorphigenin (0.5 μmol/L) and cisplatin (10 μg/mL) for 48 h; C, E and G: The expression of caspase-3, PARP and LRP detected by Western blot; D, F and H: The densitometric analysis of caspase-3、PARP and LRP.**: P＜0.01, compared with the control group.

2.6 Amorphigenin降低LRP蛋白的表達(dá) 分別用amorphigenin，順鉑或amorphigenin聯(lián)合順鉑處理A549/DDP細(xì)胞48 h，采用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)LRP蛋白的表達(dá)。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，amorphigenin聯(lián)合順鉑與單用amorphigenin或順鉑相比，LRP蛋白的表達(dá)明顯減少，而單用順鉑組或amorphigenin組與對(duì)照組比較相差不大（圖6G和圖6 H）。這提示了amorphigenin通過下調(diào)LRP蛋白的表達(dá)聯(lián)合順鉑對(duì)肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP的協(xié)同抗腫瘤作用。

3 討論

Amorphigenin是一種魚藤酮類化合物糖苷類紫穗槐苷的糖基苷元，早期的研究[11-13]發(fā)現(xiàn)其具有抑制破骨細(xì)胞的分化和溶解、保護(hù)肝臟、抑制細(xì)菌神經(jīng)氨酸苷酶的作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，amorphigenin可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖作用，如肺腺癌細(xì)胞A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8、黑色素瘤細(xì)胞RPMI-7951、人乙酰膽堿受體細(xì)胞TE671、人口腔表皮樣癌細(xì)胞KB、鼠白血病細(xì)胞P388，它們的半數(shù)有效量（50% effective dose, ED50）分別為0.05 μg/mL、0.03 μg/mL、0.05 μg/mL、＜0.01 μg/mL、0.04 μg/mL、0.04 μg/mL[7]。人肺癌細(xì)胞Lu-1、人激素依賴型前列腺癌細(xì)胞LNCaP、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，其ED50分別為4.8 μg/mL、7.9 μg/mL和＞20 μg/mL[8]。而我們的研究首次發(fā)現(xiàn)amorphigenin以濃度依賴性方式抑制人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP細(xì)胞的生長，其48 h的IC50為（2.19±0.92）μmol/L，并且誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究的發(fā)現(xiàn)amorphigenin誘導(dǎo)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過激活PARP途徑。

為了明確amorphigenin能否聯(lián)合順鉑對(duì)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP有協(xié)同的抗腫瘤作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)順鉑與amorphigenin聯(lián)合處理后，amorphigenin能顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)A549/DDP的生長抑制作用，且amorphigenin能增加順鉑對(duì)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP的凋亡率。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，與amorphigenin或順鉑處理組相比，amorphigenin聯(lián)合順鉑組pro-caspase-3、PARP蛋白的表達(dá)明顯降低，而cleaved caspase-3和cleaved PARP蛋白表達(dá)明顯增加，提示amorphigenin可能通過激活caspase-3、PARP蛋白從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

目前的研究認(rèn)為肺癌順鉑耐藥機(jī)制主要是以下幾個(gè)方面：①細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降；②細(xì)胞解毒功能增強(qiáng)；③DNA損傷修復(fù)功能異常；④逃避細(xì)胞凋亡[14]。細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降主要與藥物耐藥蛋白相關(guān)；一些報(bào)道的耐藥蛋白有肺耐藥蛋白（lung resistance protein, LRP）、乳腺癌耐藥蛋白（breast cncaer resistance protein, BCRP）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance-associated protein,MRP）；此外，切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（excision repair cross-completion 1,ERCC1）與順鉑的耐藥也密切相關(guān)。MRP，是一個(gè)ATP依賴的膜運(yùn)輸?shù)鞍祝?dāng)抗腫瘤藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞時(shí)，MRP使用ATP水解的能量把藥物泵出細(xì)胞，從而減少細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度增加藥物的耐藥性。LRP又叫主穹窿蛋白，主要參與細(xì)胞內(nèi)毒性藥物的分布而增加耐藥，多項(xiàng)研究[15,16]表明肺LRP的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致對(duì)順鉑的耐藥。ERCC1、DNA修復(fù)核酸內(nèi)切酶，具有5′DNA核酸內(nèi)切酶活性，在DNA切除修復(fù)過程中能夠識(shí)別和清除鉑類藥物誘導(dǎo)的DNA絡(luò)合物，從而導(dǎo)致對(duì)順鉑的耐藥。BCRP，屬于ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，也是依賴ATP將化療藥物泵出細(xì)胞，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而增加藥物的耐藥性[17]。Gyemant等[18]研究發(fā)現(xiàn)amorphigenin通過降低MDR的表達(dá)水平來抑制多藥耐藥的人乳腺癌細(xì)胞HTB-26和多藥耐藥的小鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178Y的細(xì)胞增殖，并且amorphigenin聯(lián)合表柔比星對(duì)多藥耐藥的小鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178Y有協(xié)同的抗腫瘤作用。而amorphigenin對(duì)其他腫瘤的作用機(jī)制目前國內(nèi)外均未見報(bào)道。但我們的研究首次發(fā)現(xiàn)amorphigenin通過降低LRP蛋白表達(dá)的水平來抑制人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP的生長，并且amorphigenin聯(lián)合順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞有協(xié)同的抗腫瘤作用。本研究我們發(fā)現(xiàn)amorphigenin可通過誘導(dǎo)凋亡抑制A549/DDP細(xì)胞增殖及增強(qiáng)順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞的生長抑制作用。且amorphigenin可通過下調(diào)LRP蛋白表達(dá)的水平來抑制人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP的生長。然而，amorphigenin能否通過影響其他耐藥蛋白和/或DNA損傷修復(fù)等信號(hào)通路，仍需進(jìn)一步的探索。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)amorphigenin可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP的生長。Amorphigenin可能是通過抑制耐藥蛋白LRP蛋白表達(dá)，進(jìn)而與順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用，這為amorphigenin用于順鉑耐藥肺癌的治療提供了科學(xué)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。