LRRC3B在非小細(xì)胞肺癌中下調(diào)并與肺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力相關(guān)

闞亮 張萌 何平

近年來肺癌發(fā)病率持續(xù)升高，已躍然成為惡性腫瘤死因的第一位[1-3]。盡管對于表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、鼠肉瘤病毒（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog,K-RAS）和間變性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphoma kinase,ALK）等基因突變的病例可選用靶向藥物進(jìn)行治療，然而這些基因的突變僅存在于肺腺癌當(dāng)中的部分病例中。另一方面，各種遺傳、表觀和微環(huán)境因素的相互復(fù)雜作用也顯著影響腫瘤細(xì)胞的生存和侵襲[4,5]。因此，揭示肺癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子或靶點(diǎn)，對于開發(fā)治療肺癌的新的靶向藥物具有重要的理論和臨床意義。

富含亮氨酸重復(fù)序列（leucine rich repeat-containing,LRR-containing）蛋白是具有保守亮氨酸序列的跨膜蛋白。該蛋白參與許多重要的生命進(jìn)程，包括動(dòng)植物免疫、細(xì)胞粘附、激素受體作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控以及凋亡等過程[6,7]。幾項(xiàng)人類癌癥微陣列的研究顯示LRRC3B在乳腺癌和結(jié)腸直腸癌表達(dá)下調(diào)，表明LRRC3B參與致癌作用[8]。據(jù)報(bào)道，LRRC3B mRNA在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，在裸鼠胃癌細(xì)胞中引入LRRC3B則會(huì)抑制集落的形成以及腫瘤的發(fā)生[9]。但是目前還沒有報(bào)導(dǎo)人類非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中LRRC3B相關(guān)蛋白的表達(dá)模式以及臨床作用。其在肺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能也仍然是未知的。我們猜想它可能在肺癌細(xì)胞中也是低表達(dá)，并抑制一些細(xì)胞功能的發(fā)揮。我們通過Western blot和Realtime RT-PCR檢測了LRRC3B在NSCLC中的表達(dá)情況，并采用轉(zhuǎn)染的方法增加LRRC3B的表達(dá)，后通過集落形成實(shí)驗(yàn)，MTT方法以及侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲的作用以及其可能機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞中LRRC3B表達(dá)下調(diào)，并且它能夠抑制癌癥細(xì)胞的增殖和侵襲?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 本課題研究所用人類NSCLC細(xì)胞系H460和A549以及H3255購于美國模式培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）。本課題研究所用肺癌細(xì)胞系用含有10%熱滅活新鮮胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）的RPMI-1640（Gibco, Invitrogen, NY,USA）在5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染 pCMV6-LRRC3B質(zhì)粒和對照空pCMV6從Origene（Origene, Rockville, MD, USA）購買。采用attractene轉(zhuǎn)染試劑（Qiagen, Hilden, Germany）進(jìn)行轉(zhuǎn)染。siLRRC3B序列和對照siRNA序列從Dharmacon（ThermoFisher, USA）購買。采用DharmaFECT 1試劑進(jìn)行干擾。

1.3 Real-time RT-PCR Real-time PCR采用ABI（Applied Biosystems）SYBR Green mastermix試劑盒。使用ABI 7500快速實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)，目的基因的相對表達(dá)量通過2-ΔΔCt方法計(jì)算。引物序列如下：LRRC3B Forward：5'TCCAATCATGAGACAGCCCAC 3'，LRRC3B Reverse：5'TCTGCCAGCATGTTCATCCAA 3'；β-actin Forward：5' AT AGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC 3'，β-actin Reverse：5' CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG 3'。

1.4 Western blot 總蛋白使用Pierce裂解液（ThermoFisher,USA）提取。Bradford方法進(jìn)行蛋白定量。上樣蛋白量為60 μg。電泳、轉(zhuǎn)?。?0 V, 120 min）、5%脫脂奶粉封閉，抗LRRC3B（1：800, Sigma, USA） 抗cyclinD1、MMP9（1：1,000, Cell Signaling, USA），4 ℃孵育過夜，分別與對應(yīng)的二抗（1：2,500, Santa Cruz, USA）37 ℃孵育2 h，ECL顯色，結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀（DNR, Jerusalem,Israe）采集[10]。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染后將單個(gè)細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔約2,000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，每孔加入20 mL 3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽 （3-[4,5-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT）溶液（5 mg/mL, Sigma, USA）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO, Sigma, USA），振蕩10 min，490 nm波長下測定各孔光吸收值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)基作對照。繪制細(xì)胞生長曲線[11]。

1.6 集落形成實(shí)驗(yàn) 集落形成實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)染48 h后接種1,000個(gè)細(xì)胞在6 cm培養(yǎng)皿中2周后用吉姆薩染色液（Giemsa）染色。以50個(gè)細(xì)胞計(jì)為是1個(gè)克隆。

1.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)使用有8 μm孔徑膜的24-well Transwell（Costar, Cambridge, MA）膜被20 μL膠（1：3, BD Bioscience, San Jose, CA, USA）覆蓋。轉(zhuǎn)染48 h后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，含3×105個(gè)細(xì)胞的100 μL無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到人工基底膜室上部并孵化16 h。中途補(bǔ)充10%FBS到下室作為引誘物。培養(yǎng)后，上室表面未侵襲的細(xì)胞用棉花擦除，通過孔徑的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定并用蘇木精染色。在顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野統(tǒng)計(jì)入侵細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在肺癌細(xì)胞系中LRRC3B下調(diào)并抑制細(xì)胞增殖和侵襲 肺癌細(xì)胞系中通過Western blot和Real time RT-PCR分析LRRC3B的相對表達(dá)水平。與組織樣本一致，與正常NHBE細(xì)胞系相比，NSCLC細(xì)胞系中LRRC3B蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，特別是H460、H358、HCC827以及A549（圖1A）。選用A549和H460細(xì)胞系進(jìn)行LRRC3B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染來上調(diào)LRRC3B水平。通過Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率（圖1B）。

在A549和H460細(xì)胞系中上調(diào)LRRC3B水平顯著地抑制細(xì)胞增殖率（ControlvssiRNA at day 5, A549： 0.783±0.032vs0.568±0.028,P＜0.05; H460： 1.397±0.051vs1.076±0.056,P＜0.05）和集落形成能力（ControlvssiRNA, A549：426±37.3vs135±26.8,P＜0.05; H460： 257±35.5vs118±20.3,P＜0.05）（圖2A和圖2B）。為了驗(yàn)證LRRC3B對細(xì)胞侵襲的影響，使用A549和H460細(xì)胞進(jìn)行基底膜基質(zhì)侵襲實(shí)驗(yàn)。圖2C顯示，與對照組相比，細(xì)胞轉(zhuǎn)染LRRC3B后侵襲能力明顯降低（A549： 59.7%; H460： 65.1%）。

2.2 LRRC3B抑制細(xì)胞周期進(jìn)程并調(diào)控cyclin D1和MMP9表達(dá) 之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LRRC3B導(dǎo)致細(xì)胞增殖和侵襲能力的降低。我們進(jìn)一步分析LRRC3B在細(xì)胞周期進(jìn)程中的角色，如圖3A所示，在H460和A549細(xì)胞系中LRRC3B上調(diào)能夠抑制細(xì)胞G1期到S期的推進(jìn)。為了了解可能的機(jī)制，我們檢測了一系列與生長和侵襲相關(guān)的蛋白。如圖3B所示，轉(zhuǎn)染LRRC3B明顯抑制細(xì)胞周期蛋白cyclin D1以及與侵襲相關(guān)的蛋白MMP9的表達(dá)。

2.3 LRRC3B抑制細(xì)胞的增殖和侵襲 在肺癌細(xì)胞系H3255中通過siRNA敲除LRRC3B，進(jìn)一步分析LRRC3B的生物學(xué)功能。如圖4A-圖4D所示，LRRC3B敲除后提高了H3255的增殖率，提升了細(xì)胞的集落形成能力以及侵襲能力。另外，在LRRC3B敲除的細(xì)胞中，MMP9和cyclin D1的表達(dá)略微上調(diào)（圖4E）。

3 討論

圖1 LRRC3B在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)以及轉(zhuǎn)染效率。A：通過Western blot以及Real-time RT-PCR檢測NHBE和幾株肺癌細(xì)胞系中LRRC3B的表達(dá)，與NHBE相比，A549，H358，H460和HCC827中LRRC3B的表達(dá)明顯下調(diào)。B：Western blot 分析顯示：與對照組相比，在A549和H460細(xì)胞中，LRRC3B轉(zhuǎn)染顯著增加了LRRC3B的水平。Fig 1 The expression of LRRC3B in lung cancer cells and transfection efficiency of LRRC3B in A549 & H460. A: The expression of LRRC3B is detected in NHBE and several lung cancer cells through western blot and Real-time RT-PCR. The expression of LRRC3B is downregulated in A549, H358, H460 and HCC827 cells; B: The analysis result indicates that LRRC3B transfection upregulates the expression of protein LRRC3B in A549 and H460 cells.

圖2 恢復(fù)LRRC3B表達(dá)抑制細(xì)胞增殖和侵襲。A：轉(zhuǎn)染LRRC3B質(zhì)粒的A549和H460細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)；B：轉(zhuǎn)染LRRC3B質(zhì)粒以及空白對照的細(xì)胞進(jìn)行集落形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示恢復(fù)LRRC3B表達(dá)明顯降低集落形成能力；C：惡性侵襲實(shí)驗(yàn)顯示A549和H460細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LRRC3B后降低細(xì)胞侵襲能力。*P＜0.05。Fig 2 Upregulating the expression of LRRC3B inhibits cell growth and invasion. A: MTT assays of A549 and H460 cells transfected with LRRC3B; B:Colony formation assays of A549 and H460 cells transfected with LRRC3B; C: Transwell result shows that LRRC3B transfection weakens the activity of invasion of A549 and H460 cells. *P＜0.05.

圖3 轉(zhuǎn)染LRRC3B抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，下調(diào)cyclin D1和MMP9表達(dá)量。A：細(xì)胞周期分析顯示轉(zhuǎn)染LRRC3B降低S期細(xì)胞比率，增加G1期細(xì)胞比率；B：Western blot分析顯示恢復(fù)LRRC3B的水平可以減少cyclin D1和MMP9蛋白的表達(dá)。Fig 3 LRRC3B transfection inhibits the process of cell cyle and downregulates the expression of cyclin D1 & MMP9. A: The analysis of cell cycle reveals that LRRC3B transfection decreases the rate of S phase and increases the rate of G1 phase; B: The analysis of Western blot shows that LRRC3B downregulates the expression of cyclin D1 and MMP9.

通過對一些癌癥患者的調(diào)查表明，LRRC3B失活是由甲基化或去甲基化導(dǎo)致的。在胃癌，結(jié)直腸癌和透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)LRRC3B mRNA表達(dá)降低且LRRC3B的啟動(dòng)子區(qū)域去甲基化。在胃癌細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)染上調(diào)LRRC3B的表達(dá)水平能夠抑制集落形成[12,13]。然而，截至目前還沒有研究涉及LRRC3B蛋白在肺癌組織中的表達(dá)水平及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。另外，LRRC3B在人類NSCLC中的生物學(xué)功能尚不明確。我們的研究顯示與正常支氣管細(xì)胞NHBE相比，9株肺癌細(xì)胞系中有4株細(xì)胞系其LRRC3B的表達(dá)水平偏低。通過LRRC3B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，在LRRC3B表達(dá)較低的NSCLC細(xì)胞株中恢復(fù)內(nèi)源性表達(dá)，結(jié)果顯示LRRC3B能夠顯著抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展。LRRC3B在腎細(xì)胞癌中也可以抑制集落的形成[14]。我們的結(jié)果與這些研究保持一致，提示LRRC3B在肺癌細(xì)胞中是一種重要的腫瘤抑制基因。至今為止，LRRC3B在細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞侵襲活動(dòng)中的作用研究尚不透徹。LRRC3B作為一個(gè)腫瘤抑制基因的機(jī)制尚未闡明。因此，我們調(diào)查細(xì)胞周期進(jìn)程及其相關(guān)蛋白并發(fā)現(xiàn)LRRC3B上調(diào)能夠降低S期百分比和cyclinD1表達(dá)量。CyclinD1在細(xì)胞周期進(jìn)程G1到S期的過程中發(fā)揮重要作用。許多研究[15,16]證明cyclinD1在NSCLC中過表達(dá)并與惡性增殖和預(yù)后不良相關(guān)。這些結(jié)果表明LRRC3B可以通過調(diào)節(jié)cyclinD1的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程。LRRC3B在細(xì)胞侵襲過程中的作用之前還沒有報(bào)導(dǎo)。在本次課題研究中，我們發(fā)現(xiàn)LRRC3B能夠抑制肺癌細(xì)胞的侵襲能力。LRRC3B轉(zhuǎn)染能夠下調(diào)MMP9的表達(dá)，MMP9在許多類型的癌癥中是入侵的一個(gè)重要中介[17-20]。因此，LRRC3B抑制細(xì)胞侵襲的功能可能是通過下調(diào)MMP9的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，這項(xiàng)研究證明在NSCLC中LRRC3B蛋白水平下調(diào)，恢復(fù)肺癌細(xì)胞系中LRRC3B的表達(dá)可以抑制細(xì)胞增殖和侵襲，作用機(jī)制可能是通過調(diào)控cyclinD1和MMP9表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)的。綜合這些發(fā)現(xiàn)，我們推斷LRRC3B是NSCLC中非常重要的腫瘤抑制基因，通過抑制細(xì)胞增殖以及侵襲的方式來調(diào)控腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。進(jìn)一步研究其分子機(jī)制，分析他與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，可能會(huì)為腫瘤治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

圖4 LRRC3B抑制細(xì)胞生長侵襲并下調(diào)cyclin D1和MMP9的表達(dá)。A：Western blot分析顯示，與對照組相比，LRRC3B siRNA明顯降低H3255細(xì)胞中LRRC3B的水平；B：MTT實(shí)驗(yàn)顯示LRRC3B抑制細(xì)胞生長；C：集落形成實(shí)驗(yàn)顯示LRRC3B減少細(xì)胞集落形成數(shù)目；D：侵襲實(shí)驗(yàn)顯示LRRC3B抑制H3255細(xì)胞侵襲；E：Western blot分析顯示，LRRC3B敲除略微上調(diào)cyclin D1和MMP9的表達(dá)。*P＜0.05。Fig 4 LRRC3B inhibits cell growth & invasion and downregulates the expression of cyclin D1 & MMP9. A: The analysis of Western blot reveals that LRRC3B siRNA downregulates the expression of LRRC3B in H3255 cells; B: MTT assays shows that LRRC3B inhibits cell growth; C: Colony formation assays shows that LRRC3B reduces the quantity of cell colony; D: Transwell assays reveals that LRRC3B inhibits cell invasion; E: The analysis of Western blot shows that LRRC3B siRNA upregulates the expression of cyclin D1 and MMP9 tinily. *P＜0.05.