尼古丁誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移

侯艷須 李雪冰 潘振華 祖玲玲 范亞光 尤嘉琮 王玉麗 王岷 陳沛銳 沈旺 周清華

肺癌是人類(lèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是對(duì)人群健康和生命威脅最大的腫瘤，并成為癌癥相關(guān)疾病首要死亡原因[1-3]。世界上每年有近兩百萬(wàn)人罹患肺癌，約占所有新患癌患者的13%，同時(shí)每年又有一百多萬(wàn)人死于肺癌，約占癌癥總死亡人數(shù)的20%[2-4]。美國(guó)國(guó)家癌癥研究所從2004年-2010年登記的數(shù)據(jù)顯示，處于局限期肺癌患者（18%）5年生存率是53.5%，而確診為晚期的患者（55%）生存率只有3.9%[5]。由于肺癌患者早期癥狀并不典型，多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期，導(dǎo)致總體的5年生存率只有約15%[6]。80%的肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC），吸煙與NSCLC的發(fā)生緊密相關(guān)，是肺癌的首要相關(guān)因素。尼古丁作為香煙中的重要活性成分，可以誘導(dǎo)多種人類(lèi)癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移[7]。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是一個(gè)高度程序化的過(guò)程，細(xì)胞間粘連缺失而導(dǎo)致細(xì)胞極性消失，并且獲得間充質(zhì)特性，被認(rèn)為與包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8,9]。腫瘤臨床治療成敗的關(guān)鍵在于患者治療后的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這是導(dǎo)致死亡的主要原因，約有80%患者的死亡與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此探討轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制對(duì)治療及改善患者預(yù)后具有重要的臨床意義。E-鈣粘蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）分別是上皮和間質(zhì)表型的重要標(biāo)志物，肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，上皮細(xì)胞表型表達(dá)減少，間質(zhì)表型則表達(dá)增強(qiáng)，造成細(xì)胞間連接下降，使得肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)[10,11]。E-鈣粘蛋白作為表皮狀態(tài)的關(guān)鍵因素，它的部分缺失與多種腫瘤的進(jìn)展和不良預(yù)后緊密相關(guān)[12]。β-鏈蛋白（β-catenin）同樣也是一種主要存在于細(xì)胞膜的粘連蛋白，與E-鈣粘蛋白構(gòu)成復(fù)合體，共同組成細(xì)胞間粘附分子的重要部分，在抑制肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]。已有的研究[14]表明：腫瘤細(xì)胞膜β-catenin蛋白的減少，常常導(dǎo)致細(xì)胞核蛋白積累，這個(gè)過(guò)程同樣伴隨著E-cadherin表達(dá)減少和Vimentin蛋白表達(dá)增多，證明β-catenin蛋白的核轉(zhuǎn)移同樣發(fā)生了EMT。本研究主要是探討尼古丁誘導(dǎo)的EMT對(duì)肺癌侵襲潛能的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑 本次實(shí)驗(yàn)所使用A549肺癌細(xì)胞株由天津市肺癌研究所提供；尼古丁、FITC標(biāo)記二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；β-actin、E-cadherin和Vimentin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；β-catenin一抗購(gòu)自Abcam公司；HRP標(biāo)記的二抗、細(xì)胞蛋白提取試劑購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；RNA提取試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR GREEN試劑盒購(gòu)自日本TAKARA公司；24孔Transwell侵襲小室培養(yǎng)板購(gòu)自Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；每2 d-3 d胰酶消化細(xì)胞傳代，每1 d-2 d更換1次培養(yǎng)基；取生長(zhǎng)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，藥物處理前一般要先無(wú)血清饑餓處理細(xì)胞24 h，尼古丁處理濃度分別為0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L。

1.3 Western blot 提取尼古?。? μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L）處理后各組細(xì)胞蛋白，蛋白樣品100 ℃煮沸5 min，使蛋白充分變性，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；裁剪后的膜用含5%脫脂牛奶封閉液室溫封閉2 h，加入稀釋后的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；次日用TBST緩沖液洗膜3次，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h；再用TBST緩沖液洗膜3次，配置化學(xué)發(fā)光試劑，孵育2 min，暗室中曝光30 s-5 min，自動(dòng)洗片機(jī)洗片。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，應(yīng)用Imaje軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度分析。

1.4 Real-time PCR 應(yīng)用Trizol法提取處理后各組細(xì)胞總RNA，根據(jù)TAKARA公司提供說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)復(fù)孔并至少重復(fù)兩次。GAPDH基因表達(dá)量作為內(nèi)參對(duì)照，使用2-ΔΔCt法行相對(duì)定量分析。引物（由華大基因合成）序列如下：GAPDH F： AACCTGCCAAATATGATGAC，R： ATACCAGGAAATGAGCTTGA；E-cadherin F：T G C C C A G A A A A T G A A A A A G G，R：GTGTATGTG G C A ATG CGTTC；Viment in F：G G A A A T G G C T C G T C A C C T T C G T，R：AGAAATCCTGCTCTCCTCGCCT。

1.5 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于覆有蓋玻片的6孔板，制備細(xì)胞爬片，尼古丁處理前細(xì)胞饑餓24 h，處理濃度為0 μmol/L和1 μmol/L；繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，PBS清洗爬片，-20 ℃條件下無(wú)水甲醇固定20 min；0.5%Triton X-100室溫通透細(xì)胞20 min，5%BSA室溫孵育細(xì)胞30 min；滴加β-catenin免疫熒光一抗，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜；次日FITC-標(biāo)記二抗室溫避光孵育1 h，DAPI復(fù)染細(xì)胞核；最后抗熒光淬滅劑封片，顯微鏡玻片觀察采集圖像并拍照記錄。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)密度達(dá)到80%，無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h，使用無(wú)菌的200 μL黃槍頭垂直六孔板均勻劃2條橫線(xiàn)，PBS洗滌脫落細(xì)胞；添加不同濃度尼古?。? μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，分別于0 h、24 h和48 h時(shí)在倒置光學(xué)顯微鏡下拍攝照片，測(cè)量劃痕區(qū)域面積變化。

1.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 取無(wú)血清饑餓處理24 h后的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL，分別用含0 μmol/L和1 μmol/L尼古丁的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將Transwell小室置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，上室中加入100 μL細(xì)胞懸液，下室中加入500 μL含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，擦凈上室內(nèi)殘余的細(xì)胞和基質(zhì)膠，甲醛室溫固定細(xì)胞20 min，PBS 洗滌3次，結(jié)晶紫染色洗凈后，顯微鏡下隨機(jī)取3個(gè)-5個(gè)不同視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)，取平均值，計(jì)算遷移細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目，每組平行設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以Mean±SD表示，應(yīng)用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪圖；兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較時(shí)采用LSD檢驗(yàn)法或Dunnett-t法。雙側(cè)界值P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尼古丁處理后EMT相關(guān)分子標(biāo)志物表達(dá)水平變化提取各處理組細(xì)胞總蛋白，使用Western blot方法檢測(cè)E-cadherin、Vimentin基因和內(nèi)參基因β-actin蛋白表達(dá)。本研究觀察到尼古丁誘導(dǎo)后EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)水平發(fā)生明顯變化。尼古丁處理肺癌細(xì)胞后Vimentin蛋白表達(dá)水平明顯升高，不同濃度尼古丁處理組間Vimentin蛋白表達(dá)水平經(jīng)F檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）； 兩兩比較：對(duì)照組與0.1 μmol/L尼古丁處理組間Vimentin蛋白表達(dá)水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），對(duì)照組與1.0 μmol/L和10.0 μmol/L尼古丁處理組間Vimentin表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（圖1），1.0 μmol/L與10.0 μmol/L尼古丁處理組間Vimentin表達(dá)水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（圖1）。尼古丁處理肺癌細(xì)胞后E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯降低，不同濃度尼古丁處理組間E-cadherin蛋白表達(dá)水平經(jīng)F檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）； 兩兩比較：對(duì)照組與0.1 μmol/L尼古丁處理組間E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），對(duì)照組與1.0 μmol/L和10.0μmol/L尼古丁處理組間E-cadherin表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（圖1），1.0 μmol/L與10.0 μmol/L尼古丁處理組間E-cadherin表達(dá)水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（圖1）。1 μmol/L尼古丁處理肺癌細(xì)胞24 h、48 h和72 h后Vimentin蛋白表達(dá)水平明顯升高，不同時(shí)間尼古丁處理組間Vimentin蛋白表達(dá)水平經(jīng)F檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）； 兩兩比較：對(duì)照組與24 h、48 h和72 h尼古丁處理組間Vimentin蛋白表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）， 24 h與48 h和72 h尼古丁處理組間Vimentin蛋白表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），48 h與72 h尼古丁處理組間Vimentin蛋白表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（圖2）。1 μmol/L尼古丁處理肺癌細(xì)胞24 h、48 h和72 h后E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯降低，不同時(shí)間尼古丁處理組間E-cadherin蛋白表達(dá)水平經(jīng)F檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）； 兩兩比較：對(duì)照組與24 h、48 h和72 h尼古丁處理組間E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）， 24 h與48 h和72 h尼古丁處理組間E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），48 h與72 h尼古丁處理組間E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（圖2）。尼古丁處理肺癌細(xì)胞株后Vimentin和E-cadherin蛋白表達(dá)水平變化具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性（圖1，圖2）。

2.2 尼古丁處理肺癌細(xì)胞后EMT相關(guān)分子標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平變化 應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)E-cadherin、Vimentin基因和內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用2-ΔΔct值進(jìn)行相對(duì)定量分析，本研究觀察到：尼古丁處理肺癌細(xì)胞后Vimentin mRNA表達(dá)水平明顯升高，不同濃度尼古丁處理組間Vimentin mRNA表達(dá)水平經(jīng)F檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）； 兩兩比較：對(duì)照組與0.1 μmol/L、1.0 μmol/L和10.0 μmol/L尼古丁處理組間Vimentin mRNA表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（圖3），0.1 μmol/L 與1.0 μmol/L和10.0 μmol/L尼古丁處理組間Vimentin mRNA表達(dá)水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），1.0 μmol/L和10.0 μmol/L尼古丁處理組間Vimentin mRNA表達(dá)水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（圖3）。尼古丁處理肺癌細(xì)胞后E-cadherin mRNA表達(dá)水平明顯降低，不同濃度尼古丁處理組間E-cadherin mRNA表達(dá)水平經(jīng)F檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）； 兩兩比較：對(duì)照組與0.1 μmol/L、1.0 μmol/L和10.0 μmol/L尼古丁處理組間E-cadherin mRNA表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（圖3）， 0.1 μmol/L與1.0 μmol/L和10.0 μmol/L尼古丁處理組間E-cadherin mRNA表達(dá)水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），1.0 μmol/L與10.0 μmol/L尼古丁處理組間E-cadherin mRNA表達(dá)水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（圖3）。尼古丁處理肺癌細(xì)胞株后Vimentin和E-cadherin mRNA表達(dá)水平變化具有劑量依賴(lài)性（圖3）。

圖1 不同濃度尼古丁處理細(xì)胞24 h后EMT標(biāo)志物變化及其灰度比值柱形圖（*P＜0.05, **P＜0.01）Fig 1 The expression levels of epithelial-mesenchymal transition (EMT) related protein makers in cells treated with different concentration of nicotine (0 μmol/L, 0.1 μmol/L, 1 μmol/L, 10 μmol/L) for 24 h and the bar chart of gray ratio value (*P＜0.05, **P＜0.01)

2.3 尼古丁處理后肺癌細(xì)胞 β-catenin蛋白表達(dá)水平變化β-catenin蛋白主要位于細(xì)胞膜，與E-cadherin結(jié)合為復(fù)合體共同為介導(dǎo)細(xì)胞間粘附。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生EMT之后細(xì)胞膜E-cadherin表達(dá)減少，β-catenin與其分離，從而β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核。β-catenin蛋白表達(dá)的核轉(zhuǎn)移間接證明EMT的發(fā)生。此次免疫熒光實(shí)驗(yàn)選用濃度為0 μmol/L和1 μmol/L的尼古丁兩組進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，1 μmol/L處理組細(xì)胞與對(duì)照組比較，β-catenin蛋白明顯發(fā)生核轉(zhuǎn)移，提示尼古丁處理的細(xì)胞發(fā)生EMT（圖4）。

2.4 尼古丁處理后肺癌細(xì)胞遷移潛能變化 尼古丁處理肺癌細(xì)胞24 h、48 h后，進(jìn)入劃痕區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量發(fā)生明顯變化，劃痕區(qū)域面積明顯縮小。本研究觀察到：0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L尼古丁處理組肺癌細(xì)胞進(jìn)入劃痕區(qū)域細(xì)胞數(shù)量較0 μmol/L組明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。結(jié)果提示不同濃度尼古丁能夠增強(qiáng)A549細(xì)胞遷移能力，并呈現(xiàn)濃度和時(shí)間相關(guān)性（圖5）。

2.5 尼古丁處理后肺癌細(xì)胞體外侵襲潛能變化 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)設(shè)置尼古丁濃度為0 μmol/L、 1 μmol/L兩組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究觀察到：1 μmol/L尼古丁處理組肺癌細(xì)胞穿過(guò)小室基底膜肺癌細(xì)胞數(shù)目（106±2）與0 μmol/L尼古丁處理組肺癌細(xì)胞穿過(guò)小室基底膜肺癌細(xì)胞數(shù)目（67±2）比較，明顯增多，侵襲能力明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）（圖6）。

3 討論

吸煙是引起包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤相關(guān)性疾病死亡的首要危險(xiǎn)因素之一[3]。已知香煙中存在著超過(guò)4,000多種化學(xué)物質(zhì)，其中至少有45種被認(rèn)為可能是致癌物質(zhì)[15]。大多數(shù)的香煙致癌物也是強(qiáng)誘變劑，能夠與DNA形成加合物，從而激活原癌基因，而使抑癌基因失活[16]。雖然戒煙對(duì)腫瘤治療相關(guān)并無(wú)太大影響，但是持續(xù)的吸煙可能降低治療療效甚至增加患者死亡率。癌癥成功治療后的戒煙卻能降低新癌癥的罹患風(fēng)險(xiǎn)率，非吸煙患者與以前吸煙和現(xiàn)吸煙患者比較有更長(zhǎng)的生存期。已有的研究表明：尼古丁誘導(dǎo)的侵襲和EMT作用，可能是乳腺癌和肺癌進(jìn)展的重要機(jī)制。尼古丁本身雖然沒(méi)有強(qiáng)致癌作用，但它能促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成以及抗細(xì)胞凋亡，還能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生EMT，這種作用主要發(fā)生在吸煙者尼古丁血漿濃度為10-8M-10-6M的患者[17,18]。然而每吸完一支香煙，人體肺泡液中尼古丁含量便可高達(dá)6 μmol/L-60 μmol/L，而1 μmol/L的尼古丁濃度便可以誘導(dǎo)細(xì)胞抗凋亡，促進(jìn)增殖及產(chǎn)生EMT[7,19]。

圖2 1 μmol/L尼古丁處理細(xì)胞不同時(shí)間后EMT標(biāo)志物的變化及其灰度比值柱形圖（**P＜0.01）Fig 2 The expression levels of EMT related protein makers in lung cancer cells treated with 1 μmol/L of nicotine for different times (0 h, 24 h, 48 h,72 h) and the bar chart of gray ratio value (**P＜0.01)

圖3 Real-time PCR 檢測(cè)不同濃度尼古丁處理肺癌細(xì)胞24 h后EMT相關(guān)標(biāo)志物mRNA水平變化（**P＜0.01）Fig 3 The expression levels of EMT related makers in lung cancer cells treated with different concentration of nicotine (0 μmol/L, 0.1 μmol/L, 1 μmol/L, 10 μmol/L) for 24 h and the bar chart of gray ratio value (**P＜0.01)

EMT是一個(gè)高度保守的細(xì)胞程序化過(guò)程，上皮來(lái)源的細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞上皮表型缺失并獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型，固定的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為能動(dòng)的間充質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程。上皮細(xì)胞侵襲和遷移的能力主要是依賴(lài)于細(xì)胞骨架的重塑，從而導(dǎo)致細(xì)胞EMT，促進(jìn)腫瘤獲得轉(zhuǎn)移能力[20]。EMT主要的特征是細(xì)胞E-鈣粘蛋白分子表達(dá)的減少和波形蛋白的獲得，并且同時(shí)獲得間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。E-鈣粘蛋白屬于鈣依賴(lài)的粘附分子的鈣粘蛋白家族，在細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用的調(diào)控中起至關(guān)重要的作用[21]。作為保持表皮狀態(tài)的關(guān)鍵因素，它表達(dá)降低和缺失與腫瘤不良預(yù)后緊密相關(guān)[12]。它與許多類(lèi)型的腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，并參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和治療抵抗性[22]。重要的是除了參與腫瘤的轉(zhuǎn)移，還與細(xì)胞的耐藥性和腫瘤干細(xì)胞的產(chǎn)生有關(guān)。EMT是上皮來(lái)源的惡性腫瘤獲得侵襲和遷移能力的重要生物學(xué)過(guò)程，上皮細(xì)胞通過(guò)惡性轉(zhuǎn)化獲得遷移能力，允許其侵入周?chē)?xì)胞基質(zhì)，并通過(guò)血液和淋巴系統(tǒng)進(jìn)行遠(yuǎn)處播散和轉(zhuǎn)移。

圖4 1 μmol/L尼古丁處理肺癌細(xì)胞24 h后β-catenin蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)移（×200）Fig 4 The β-catenin protein translocated to the cell nucleus after treating with 1 μmol/L nicotine for 24 h (×200)

圖5 不同濃度尼古丁處理A549細(xì)胞24 h、48 h后遷移能力的變化（×40）Fig 5 The ability of migration was increased in cells treated with different concentration of nicotine (×40) (0 μmol/L, 0.1 μmol/L, 1 μmol/L, 10 μmol/L) for 24 h and 48 h

圖6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)（×200）。A：對(duì)照組；B：尼古丁處理組。Fig 6 The ability of invasion was increased in cancer cells treated with 1 μmol/L nicotine (×200). A: Control group; B: Group of cells treated with 1 μmol/L nicotine.

本研究結(jié)果表明：香煙中重要的化合物質(zhì)尼古丁處理后的肺癌細(xì)胞，無(wú)論是從蛋白水平還是mRNA水平均表現(xiàn)出明顯的E-cadherin表達(dá)降低和Vimentin表達(dá)增強(qiáng)，提示尼古丁能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞EMT。EMT是一個(gè)多步驟的過(guò)程，多種信號(hào)因子、轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路參與其中。參與的轉(zhuǎn)錄因子包括Snail家族（Snail1、Snail2/Slug和Snail3）、Twist、β-catenin、鋅指結(jié)合蛋白（ZEB1和ZEB2）和TCF3/E47/E12等[23,24]。尼古丁還可以通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)人呼吸道上皮細(xì)胞EMT，并能在體外環(huán)境下誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞和肺癌A549細(xì)胞發(fā)生EMT[25]。腫瘤細(xì)胞核β-catenin蛋白的積累表明其同樣經(jīng)歷了EMT，這些細(xì)胞E-鈣粘蛋白的表達(dá)逐漸喪失，但間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)卻反向增高[14]。NSCLC晚期患者的E-鈣粘蛋白基因沉默，表明E-鈣粘蛋白表達(dá)下降參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[26]。相比之下，N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達(dá)的上調(diào)同樣也與NSCLC的轉(zhuǎn)移相關(guān)，而抑制其表達(dá)可以減弱NSCLC的增殖和侵襲能力[27,28]。雖然大多數(shù)肺癌EMT相關(guān)標(biāo)志物間質(zhì)表型存在高表達(dá)，尤其是在鱗狀細(xì)胞癌中，但無(wú)論E-鈣粘蛋白的降低或是N-鈣粘蛋白的過(guò)度表達(dá)都預(yù)示著NSCLC患者的預(yù)后不良[29]。本研究免疫熒光結(jié)果提示細(xì)胞膜表達(dá)的β-catenin蛋白，經(jīng)尼古丁處理后發(fā)生了明顯的細(xì)胞核聚集，即所謂的膜蛋白核轉(zhuǎn)移，間接證明了尼古丁可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞EMT。另外，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，同樣證明了肺癌細(xì)胞經(jīng)尼古丁處理后，細(xì)胞遷移侵襲能力明顯增強(qiáng)，這與肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT緊密相關(guān)。

已有的研究證明：手術(shù)目前仍然是NSCLC的主要治療手段，然而治療后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，仍然是肺癌治療失敗的主要因素。尼古丁作為煙草中重要化學(xué)物質(zhì)，與NSCLC的發(fā)生緊密相關(guān)，它能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞EMT，還能促進(jìn)肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞增多。腫瘤細(xì)胞獲得EMT后，其遷移和侵襲的能力明顯增強(qiáng)，并獲得干細(xì)胞樣特征和細(xì)胞耐藥性，通過(guò)抑制EMT，可以降低肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，阻斷EMT表型和信號(hào)通路，還可以增強(qiáng)化療敏感性[27,28,30,31]?？紤]EMT在癌癥的發(fā)展過(guò)程中的重要作用，針對(duì)涉及EMT而提供的治療策略，可能對(duì)防止腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、耐藥性產(chǎn)生至關(guān)重要。因此，研究和開(kāi)發(fā)肺癌EMT相關(guān)的分子靶點(diǎn)及分子靶點(diǎn)小分子藥物，對(duì)改善NSCLC吸煙的患者的臨床治療效果及預(yù)后具有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。