電針聯(lián)合穴位注射單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用*

黃萍 郭俐宏陳少秀（湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北十堰442000）

·實(shí)驗(yàn)報(bào)告·

電針聯(lián)合穴位注射單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用*

黃萍 郭俐宏△陳少秀
（湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北十堰442000）

目的觀察電針聯(lián)合穴位注射單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。方法SD大鼠40只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、電針組、穴位注射組及聯(lián)合組，4組大鼠均采用右側(cè)頸動(dòng)脈線栓大腦中動(dòng)脈Willis環(huán)，阻斷血流45min后再灌注45min，并反復(fù)3次的方法，建立大鼠腦缺血/再灌注損傷的動(dòng)物模型。電針組施平補(bǔ)平手法，取風(fēng)池、百會(huì)、四神聰、腎俞、三陰交為主穴電針刺激30min；穴位注射組穴位注射單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液；聯(lián)合組治療方法為電針組加穴位注射組；觀測(cè)0min、4 h及1 d、7 d、14 d、21 d局部腦血流量（RCBF）、腦電圖病理性棘波波幅（EEG）；取腦組織TTC染色后記數(shù)頂葉皮質(zhì)層幸存神經(jīng)元，并分別測(cè)定腦梗死率、血漿肌酸激酶同工酶BB（CK-BB）。結(jié)果聯(lián)合組在第7日、14日、21日顯著提高RCBF及幸存神經(jīng)元密度值、降低CK-BB、EEG病理性棘波波幅及梗死率，與模型組、電針組及穴位注射組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論其作用機(jī)制應(yīng)與電針刺激以疏通經(jīng)絡(luò)、激發(fā)經(jīng)氣，松弛缺腦血管平滑肌、改善微循環(huán)而增加RCBF，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉營(yíng)養(yǎng)、再生與重構(gòu)中樞神經(jīng)細(xì)胞，電針與穴位注射共同促進(jìn)缺血腦能量代謝而起到保護(hù)作用有關(guān)。

電針聯(lián)合穴位注射單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉腦缺血/再灌注損傷局部腦血流血漿肌酸激酶同工酶BB

【Abstract】Objective:To observe the protective effect of electroacupuncture combined with acupoint injection of sodium monosialotetrahexosylganglioside on cerebral ischemia/reperfusion in rats.M ethods:40 SD ratswere randomly divided into the model group，electro acupuncture group，acupoint injection group and the combined group.Four groups of rats received the right carotid artery occlusion of middle cerebral artery occlusion Willis ring，45minutes after reperfusion for another 45minutes，and repeating 3 times to establish the animalmodel of brain injury ischemia/reperfusion in rats.Electro acupuncture group took reinforcing technique，taking Fengchi，Baihui，Sishencong，Shenshu，Sanyinjiao acupoints electroacupuncture for 30 min.Acupoint injection group took acupoint injection of sodium monosialotetrahexosylganglioside.The combined group took electro acupuncture and acupoint injection.The data of 0min，4 hours and 1st day，7thday，14thday and 21stday was observed，such as regional cerebral blood flow（RCBF），EEG pathologic spines；popo（EEG）from the brain tissue TTC staining.The number of survival neurons in parietal cortex，and the cerebral infarction rate were measured，as well as serum creatine kinase isoenzyme BB（CK-BB）.Results:On 7thday，14thday，21stday，surviving neuron density and RCBF obviously rose，and CK-BB，pathological spike wave amplitude of EEG and rate of infarction dropped. Compared with the other groups，the differenceswere statistically significant（P《0.05）.Conclusion:Themechanism may be related to the stimulation of electroacupuncture，which can dredge the channels，promote themovementof the channel Qi，relax cerebral vascular smoothmuscle，and improvemicrocirculation to increase RCBF.At the same time，sodium monosialotetrahexosylganglioside can nourish，regenerate and reconstruct the central ner-vous system.Electroacupuncture combined with acupoint injection can promote cerebral energy metabolism in cerebral ischemia，so as to play a protective role.

【Key words】Electroacupuncture combined with acupoint injection；Sodium monosialotetrahexosylganglioside；Cerebral ischemia/reperfusion injury；Local cerebral blood flow；Plasma creatine kinase isoenzyme BB

腦梗死（ACI）即急性缺血性腦卒中，是血管粥樣硬化脫落斑塊栓塞腦血管而引起急性血流障礙，造成局灶性腦缺血梗死，并最終導(dǎo)致腦功能障礙的一類急性腦功能缺損疾?。?］。其起病急促，致殘率及病死率極高，是臨床嚴(yán)重威協(xié)人類健康的疾病。根據(jù)中醫(yī)“正氣存內(nèi)，邪不可干”的觀點(diǎn)［2］，尋找有效的防治急性缺血性腦卒中方法、減輕腦缺血/再灌注對(duì)神經(jīng)元損害、促進(jìn)神經(jīng)元功能恢復(fù)成為當(dāng)務(wù)之急。筆者應(yīng)用大鼠缺血再灌注損傷模型，采用“風(fēng)池、百會(huì)、四神聰、腎俞、三陰交”電刺激并聯(lián)合穴位注射單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉路注射液，觀察其對(duì)大鼠缺血/再灌注后局部腦血流量（RCBF）及葉皮質(zhì)層幸存神經(jīng)元等的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物及分組SD大鼠40只，體質(zhì)量160～200 g，雌雄不拘，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證：SYXK（鄂）2011-0031；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（鄂）2011-0008。采用隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)，隨機(jī)分為模型組、電針組、穴位注射組及聯(lián)合組，每組10只。術(shù)后每日碘伏消毒，頭孢哌酮0.2 g/（kg·d）肌肉注射，動(dòng)物房溫度保持18～25℃，濕度保持50%～75%，大鼠應(yīng)單籠飼養(yǎng)，12 h交替光照，蘇醒后自由飲水、喂養(yǎng)，每日觀察動(dòng)物進(jìn)食情況，稱體質(zhì)量，及時(shí)清理糞便［3］。

1.2試藥及儀器BL-420L生物信號(hào)采集記錄系統(tǒng)（成都市泰盟公司）。FM-600科研型倒置數(shù)碼熒光系統(tǒng)（上海普丹光學(xué)儀器有限公司，型號(hào)FM-600）；電解式組織血流計(jì)（日本松下，F(xiàn)BR-1）；精密電子天平（上海精密電子天平醫(yī)療儀器公司，F(xiàn)A-1004）；醫(yī)學(xué)影像分析儀（日本SNOY，X52-H）。栓線（將釣魚線剪成長(zhǎng)約50 mm，并在18 mm處作標(biāo)記，酒精消毒后置于生理鹽水中備用）。SDZ-II型電子針療儀（上海坤弘，型號(hào)SDZ-II）；單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉（長(zhǎng)春翔通藥業(yè)有限公司，批號(hào)H20066833）；弗氏完全佐劑（上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司）；0.9%氯化液注射液；TTC染色劑（上海日初生物科技有限公司）。

1.3模型制備參考文獻(xiàn)［4］，將動(dòng)物用3%戊巴比妥鈉（10mg/100 g）經(jīng)腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，頸部正中切口，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈并找到頸總動(dòng)脈入顱之翼腭動(dòng)脈起始部，分離翼腭動(dòng)脈并用微動(dòng)脈夾夾閉，置另一微動(dòng)脈夾同時(shí)夾閉右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈主干遠(yuǎn)心端。在頸外動(dòng)脈近心端剪一T字小口，用制備好的栓線緩慢插入，此時(shí)將頸外動(dòng)脈殘端處絲線的松結(jié)拉緊，除去頸內(nèi)動(dòng)脈的動(dòng)脈夾，繼續(xù)將絲線沿著頸內(nèi)動(dòng)脈插入18 mm或有阻力感即阻塞了大腦中動(dòng)脈Willis環(huán)，阻斷血流30 min后再灌注30min并反復(fù)3次后即可抽出絲線并除去微動(dòng)脈夾。分層關(guān)閉頸部肌肉及皮膚，術(shù)后共有39只大鼠存活，術(shù)后24 h以局部腦血流量及腦電圖幅度急劇下降，左側(cè)前肢內(nèi)收，提尾懸空不能伸展左側(cè)前爪，行走向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為入選標(biāo)準(zhǔn)，挑選其中32只大鼠符合腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型入選標(biāo)準(zhǔn)，模型成功率為80%。電針組手術(shù)同上但不插入栓線阻塞了大腦中動(dòng)脈Willis環(huán)。

1.4干預(yù)方法參照大鼠穴位圖譜文獻(xiàn)［5］，電針組取“風(fēng)池、百會(huì)、四神聰、腎俞、三陰交”為正極，施平補(bǔ)平手法用一次性無菌針灸針齊刺至針感，旁開5～8 mm為負(fù)極，接SDZ-Ⅱ型電子針療儀，連續(xù)波，頻率10 Hz，留針30 min；穴位注射組取“百會(huì)、足三里、血?！毖ㄎ蛔⑸鋯瓮僖核崴募禾巧窠?jīng)節(jié)苷脂鈉注射液（0.1mL）；聯(lián)合治療組先給予電針組相同治療，在電針治療后休息1 h，取“百會(huì)、足三里、血?！毖ㄎ蛔⑸鋯瓮僖核崴募禾巧窠?jīng)節(jié)苷脂鈉注射液；模型組每日僅作對(duì)照觀察。以上治療每日1次，7 d為1個(gè)療程，連續(xù)治療3療程。

1.5標(biāo)本采集與檢測(cè)1）腦梗死率及幸存神經(jīng)元測(cè)定。4組大鼠于治療21 d后斷頭處死，參照大鼠穴位圖譜文獻(xiàn)［6］，迅速分離腦組織后濾紙吸干稱重，-20℃冰凍30 min，37℃的1%TTC避光染色30 min后用4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋、將視交叉平面至乳頭體后部平面切成2mm厚腦片，由于梗死區(qū)著色加深，精確剝離梗死部位，精密電子天平精確稱量并記錄重量，計(jì)算梗死率［腦梗死率（%）=（梗死部位質(zhì)量/腦總質(zhì)量）×100%］。光鏡下記數(shù)觀察幸存神經(jīng)元密度值，采用C5 0.5網(wǎng)形目鏡尺分號(hào)別對(duì)各組大鼠頂皮質(zhì)Ⅰ區(qū)進(jìn)行記數(shù)，記數(shù)與任一測(cè)點(diǎn)外上角和測(cè)線（橫線）上緣交叉的幸存神經(jīng)元，每片腦片取3個(gè)視野，每鼠共42個(gè)視野，累加記數(shù)取均值，即為該鼠幸存神經(jīng)元密度值。2）局部腦血流量（RCBF）、生物信號(hào)采集記錄系統(tǒng)記錄及腦電圖（EEG）及血漿肌酸激酶同工酶（CK-BB）測(cè)定。RCBF（mL/100 g/min）采用日本生物醫(yī)藥公司生產(chǎn)的電解式組織血流計(jì)（FBR-1）測(cè)量。在大鼠的顱頂右側(cè)皮下安置銀絲電極，采用EEG棘波波幅，大鼠缺血/再灌注0min、4 h及1 d、7 d、14 d、21 d EEG波幅（參數(shù)設(shè)置為速度12mm/div；波寬0.05 s；電壓2 mV；頻率100 Hz）。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。RCBF及EEG的影響采用重復(fù)測(cè)量方差分析，CKBB、梗死率及幸存神經(jīng)元密度值比較采用兩兩比較t檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠CK-BB、梗死率及幸存神經(jīng)元密度值比較見表1。電針組及穴位注射組CK-BB、梗死率有一定程度降低，幸存神經(jīng)元密度值明顯提高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），電針組及穴位注射組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；聯(lián)合組CK-BB、梗死率明顯降低，幸存神經(jīng)元密度值明顯提高，與電針組及穴位注射組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1　各組大鼠腦缺血梗死率、CK-B B及幸存神經(jīng)元密度值比較

表1　各組大鼠腦缺血梗死率、CK-B B及幸存神經(jīng)元密度值比較

與模型組比較，*P＜0.05；與電針組比較，△P＜0.05；與穴位注射組比較，▲P＜0.05。

組別幸存神經(jīng)元（個(gè)/100mm2）梗死率（%）模型組1.12±0.15 33.18±2.74 n CK-BB（IU/L）8 531.18±45.74電針組1.52±0.18*25.01±2.35*8 450.01±43.35*穴位注射組8 422.32±37.62*2.17±0.21*27.33±2.42*聯(lián)合組8 341.17±26.97△▲3.10±0.27△▲18.54±1.75△▲

2.2各組大鼠RCBF比較見圖1。BL-420L記錄顯示，4組大鼠采用右側(cè)頸動(dòng)脈線栓大腦中動(dòng)脈Willis環(huán)后，RCBF立即急劇下降，在4 h時(shí)降至最低點(diǎn)，治療至第7日時(shí)，模型組維持在低水平，電針組、穴位注射組及聯(lián)合組均有不同程度升高，其中電針組、穴位注射組組間比較無差異，聯(lián)合組升高明顯優(yōu)于電針組、穴位注射組，且于第14日已恢復(fù)至正常水平。

圖1　各組大鼠RCB F比較

2.3各組大鼠EEG比較如圖2。4組大鼠腦缺血再灌注0 min、4 h及1 d、7 d、14 d、21 d EEG圖形變化情況。各組大鼠在阻塞了大腦中動(dòng)脈Willis環(huán)術(shù)后EEG棘波波幅即刻均急劇上升，于4 h達(dá)峰值。治療7 d時(shí)電針組、穴位注射組降低并持續(xù)到21 d，聯(lián)合組降低更明顯，與電針組、穴位注射組比較降低更明顯。

圖2　各組大鼠E EG比較

3　討論

缺血性腦卒中時(shí)，實(shí)驗(yàn)室檢查常見RCBF降低及出現(xiàn)異常EEG，血漿CK-BB在腦損傷極為敏感［7］，此時(shí)腦組織因缺血缺氧，能量供應(yīng)不足，細(xì)胞Na-K+-ATP酶大量釋放，導(dǎo)致線粒體的結(jié)構(gòu)及功能破壞，細(xì)胞能量代謝發(fā)生障礙，加速神經(jīng)細(xì)胞凋亡。單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液主要成分為單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉，系自豬腦中提取制得的對(duì)神經(jīng)細(xì)胞功能損傷具有修復(fù)和保護(hù)作用的物質(zhì)。其與神經(jīng)細(xì)胞膜結(jié)合，改善細(xì)胞膜酶的活性減輕腦細(xì)胞水腫，對(duì)損傷后繼發(fā)性神經(jīng)退化有保護(hù)作用，可治療腦萎縮腦梗死、脊髓損傷、腦出血、新生兒缺氧缺血性腦病顱神經(jīng)病變［8］。

在治療21 d時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，測(cè)得值顯示，聯(lián)合組在第7日、14日、30日3個(gè)時(shí)點(diǎn)顯著提高RCBF及幸存神經(jīng)元密度值、降低CK-BB、EEG病理性棘波波幅及梗死率，且這種改變明顯優(yōu)于電針組及穴位注射組。本實(shí)驗(yàn)表明，電針“風(fēng)池、百會(huì)、四神聰、腎俞、三陰交”穴，針刺穴位能激發(fā)經(jīng)氣，疏通經(jīng)絡(luò)，符合“治未病”中醫(yī)的觀點(diǎn)［9］，治療當(dāng)以調(diào)補(bǔ)肝腎、益精生髓、醒腦開竅、舒經(jīng)通絡(luò)為治法［10］。風(fēng)池、百會(huì)、四神聰、腎俞、三陰交等穴位是歷代中醫(yī)治療腦癱的經(jīng)驗(yàn)穴，其中百會(huì)、四神聰位于頭部，頭為諸陽之首，是臟腑經(jīng)絡(luò)匯聚之所，針刺二穴具有通調(diào)督脈、醒腦益智，激發(fā)人體陽氣之功效；風(fēng)池為祛風(fēng)要穴，配以腎俞及三陰交，可舒經(jīng)通絡(luò)、補(bǔ)益氣血、強(qiáng)筋健骨，從而糾正患兒肢體畸形及異常姿勢(shì)，促進(jìn)肢體功能的恢復(fù)［11］。故電針以上穴位時(shí)，擴(kuò)張局部腦血管，增加RCBF，進(jìn)而減少了其腦梗死面積。經(jīng)穴位注射單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液吸收后，該藥具有生理作用是促進(jìn)“神經(jīng)重塑”［12］。幸存神經(jīng)元密度值增高提示該藥物可能具有改善細(xì)胞膜系統(tǒng)的鈣運(yùn)轉(zhuǎn)能力，減少鈣離子在線粒體內(nèi)過多的堆積，促進(jìn)細(xì)胞的能量代謝以恢復(fù)缺血再灌注受損的腦組織功能。單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液可穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能、恢復(fù)細(xì)胞Na-K+-ATP酶活性，促進(jìn)缺血性腦卒中時(shí)受損中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞代謝，抑制損傷神經(jīng)細(xì)胞異常放電，降低EEG病理性棘波波幅，增加幸存神經(jīng)元密度值［13］。大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的增強(qiáng)劑，具有增加RCBF，促進(jìn)受損神經(jīng)軸突生長(zhǎng)與重構(gòu)，提高缺血缺氧神經(jīng)細(xì)胞存活率、調(diào)節(jié)突觸的信號(hào)傳導(dǎo)與腦電活動(dòng)，對(duì)神經(jīng)中樞系統(tǒng)起到良好的保護(hù)作用［14-15］。

綜上所述，電針聯(lián)合穴位注射單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷具有明確的保護(hù)作用。這與單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液改善腦組織的能量代謝，促進(jìn)腦神經(jīng)細(xì)胞功能恢復(fù)，減輕缺血再灌注后腦組織損傷，電針疏通經(jīng)絡(luò)，增加RCBF，改善病灶缺血、水腫，減少腦梗死面積而對(duì)腦組織起到保護(hù)作用相關(guān)。

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Protective Effect of Electroacupuncture Combined w ith Acupoint Injection of Sodium M onosialotetrahex-osylganglioside on Cerebral Ischem ia/Reperfusion in Rats

HUANG Ping，GUO Lihong，CHEN Shaoxiu.Department of Dermatology，Taihe Hospital Affiliated Hospital of Hubei Medical College，Hubei，Shiyan 442000，China.

R245．9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

1004-745X（2016）07-1335-04

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湖北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)項(xiàng)目（2012Z-B06）
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（電子郵箱：chends1226@163.com）

2015-11-18）