CLSI M38-A2及M27-A3方案分析足癬36株真菌的藥敏特征

卜曉琳　范娟　胡曉莉　蔣建華　瞿子偉　顧軍

(1.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院皮膚科，上海 200135；2.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院皮膚科，上海 200433)

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CLSI M38-A2及M27-A3方案分析足癬36株真菌的藥敏特征

卜曉琳1范娟1胡曉莉1蔣建華1瞿子偉1顧軍2

(1.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院皮膚科，上海 200135；2.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院皮膚科，上海 200433)

目的探討氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑、特比萘芬、兩性霉素B、咪康唑、5-氟胞嘧啶對36株足癬致病菌的體外抑菌特征。方法對55例臨床疑似足癬患者行真菌鏡檢、培養(yǎng)和鑒定。分別應(yīng)用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M38-A2和M27-A3方案針對其中的皮膚癬菌和念珠菌，檢測8種藥物對不同真菌的最低抑菌濃度 (Minimum inhibitory concentration，MIC)。結(jié)果鏡檢及培養(yǎng)均為陽性的真菌36株，計8個菌種：紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌、絮狀毛癬菌、羊毛狀小孢子菌、白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌；屬2大類：皮膚癬菌、念珠菌。8種藥物對8種真菌的MIC值比較，抑菌效果存在顯著差異 (P<0.05)。皮膚癬菌和念珠菌2大類比較，除伊曲康唑外 (P>0.05)，其余7種藥物的抑菌效果存在顯著差異 (P<0.05)。其中，特比萘芬對皮膚癬菌的平均秩次最小。5-氟胞嘧啶對念珠菌的平均秩次最小。結(jié)論上述8種藥物的體外藥敏實(shí)驗(yàn)提示，8種藥物對8種真菌的抑菌效果存在顯著差異。除伊曲康唑外，其余7種藥物對皮膚癬菌和念珠菌的抑菌效果存在顯著差異。相對而言，特比萘芬對皮膚癬菌抑菌效果更好，5-氟胞嘧啶對念珠菌抑菌效果更好。

足癬；皮膚癬菌；念珠菌；藥敏實(shí)驗(yàn)；M38-A2；M27-A3

[Chin J Mycol，2016，11(3):169-173]

目前治療足癬的常見外用抗真菌藥主要包括唑類、多烯類和丙烯胺類，各類藥物的抗菌譜不同。根據(jù)菌株的藥敏實(shí)驗(yàn)選擇用藥最具實(shí)用性。本課題運(yùn)用全新的美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M38-A2與M27-A3方案，分別對足癬的皮膚癬菌和念珠菌進(jìn)行抗真菌藥物敏感性測定，為臨床用藥提供參考。

1　材料和方法

1.1主要試劑及儀器

沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 (SDA培養(yǎng)基) (含50 mg/L氯霉素)，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA培養(yǎng)基)、YEPD培養(yǎng)液、RPMI-1640培養(yǎng)液 (Thermo公司)、全溫振蕩培養(yǎng)箱 (HZQ-F160型，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；單人雙面凈化工作臺 (SW-CT-IF型，蘇州凈化有限公司)；生物顯微鏡 (B203LED型，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司)；酶標(biāo)檢測儀 (Multiskan MK3型，芬蘭Labsystems)；智能霉菌培養(yǎng)箱 (MJX型，寧波江南儀器廠)；酶標(biāo)板振蕩器 (IKA MTS型，德國IKA集團(tuán))；96孔培養(yǎng)板 (丹麥Nunclon公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)菌株

依據(jù)《中國臨床皮膚病學(xué)》足癬的臨床表現(xiàn)[1]，收集2014年6～12月在本科室就診的臨床疑似足癬患者55例。標(biāo)本采用10%KOH直接涂片鏡檢有無菌絲或孢子，將鏡檢陽性的菌株接種在SDA培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫箱，常規(guī)培養(yǎng)。每天觀察菌落的生長情況、顏色、形態(tài)特點(diǎn)，必要時用玻片小培養(yǎng)以鑒定到種[2]。4周后將其中的皮膚癬菌接種至PDA上，28℃恒溫箱，常規(guī)培養(yǎng)10～14 d。念珠菌接種至SDA培養(yǎng)基，28～35℃恒溫箱，培養(yǎng)2～3 d。用于菌懸液制備。質(zhì)控菌株選用CLSI推薦的近平滑念珠菌ATCC22019。

1.3抗真菌藥物

氟康唑 (FCZ)(輝瑞制藥有限公司)、伊曲康唑 (ITR)(Sigma公司)、伏立康唑 (VCZ)(Sigma公司)、酮康唑 (KETO)(Sigma公司)、特比萘芬 (TER)(齊魯公司)，兩性霉素B (AmB)(Sigma公司)，咪康唑 (MIC)(Sigma公司)、5-氟胞嘧啶 (5-FC)(中國藥科大學(xué)制藥公司)。各藥物工作濃度范圍為：氟康唑0.125～64 μg/mL，其余藥物均為0.031 2～16 μg/mL。脂溶性藥物溶于二甲亞砜 (DMSO)，且二甲亞砜濃度不超過1%。

1.4真菌菌懸液制備

皮膚癬菌取出PDA培養(yǎng)板上的皮膚癬菌，1%吐溫20洗菌，接種鉤刮取少量菌落，放入白色陶瓷研缽充分研磨，細(xì)紗布過濾。RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋，血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整菌液濃度至1×104～3×105CFU/mL，接種菌懸液。

念珠菌從SDA培養(yǎng)板上挑取少量念珠菌，接種至含1 mL YEPD培養(yǎng)液的玻璃管內(nèi)，30℃，200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。取10 μL菌液接種至含1 mL YEPD培養(yǎng)液的玻璃管內(nèi)，同樣的條件下再次活化16 h，使真菌處于指數(shù)生長期的后期。RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋，血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整菌液濃度至 (1～5)×103CFU/mL，接種菌懸液。

1.5藥敏反應(yīng)板的制備

取無菌96孔板，每排1號孔加RPMI-1640 100 μL作空白對照；3～12號孔各加新鮮配制的菌液100 μL；2號孔分別加菌液198 μL和受試藥物溶液2 μL；12號孔不含藥物，只加菌液100 μL作陽性生長對照。2～11號孔進(jìn)行倍比稀釋，使氟康唑各孔的最終藥物濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/mL，其余抗真菌藥物各孔的最終藥物濃度均分別為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5和0.031 2 μg/mL，配制過程中每一濃度梯度完成后應(yīng)更換槍頭。每次配制藥敏板的同時均制備一質(zhì)控菌藥敏板，各藥敏板于35℃恒溫保濕培養(yǎng)箱中靜止孵育48 h，其最小抑菌濃度 (Minimum inhibitory concentration，MIC)參考值如下：氟康唑的MIC值2.0～8.0 μg/mL，只有當(dāng)其MIC值界于上述范圍時，方認(rèn)為試驗(yàn)操作準(zhǔn)確可靠。如同時試驗(yàn)菌株生長良好，則可認(rèn)為試驗(yàn)成功，結(jié)果可接受。

1.6最小抑菌濃度的判定

根據(jù)M38-A2方案的判讀標(biāo)準(zhǔn),將與生長對照孔比較≥80%生長抑制的最小藥物濃度作為藥物的MIC值。M27-A3方案以生長對照孔比較≥50%生長抑制的最小藥物濃度作為藥物的MIC值。兩性霉素B以生長對照孔比較100%生長抑制的最小藥物濃度作為藥物的MIC值。采用肉眼判讀與酶標(biāo)分析儀相結(jié)合的方式進(jìn)行判定。肉眼判讀由2人在自然光線下進(jìn)行，M38-A2方案為與對照孔相比超過80%生長抑制的最低藥物濃度 (即生長顯著減少達(dá)80%)，M27-A3方案為超過50%生長抑制的最低藥物濃度 (即生長減少一半)，兩性霉素B為超過100%生長抑制的最低藥物濃度 (即看不到菌生長)。用酶標(biāo)分析儀于630 nm測各孔OD值。陽性對照孔的OD值控制在0.2左右，與陽性對照孔比較，M38-A2方案以O(shè)D值下降80%以上的最小濃度孔中的藥物濃度為MIC值，M27-A3方案以O(shè)D值下降50%以上的最小濃度孔中的藥物濃度為MIC值，兩性霉素B以O(shè)D值下降100%的最小濃度孔中的藥物濃度為MIC值。肉眼和酶標(biāo)測度雙重測定相結(jié)合，避免結(jié)果誤差。當(dāng)藥物的MIC值超過測定濃度范圍時，按以下方法進(jìn)行統(tǒng)計：MIC值高于最高濃度64 μg/mL時，計為“>64 μg/mL”；藥物MIC值為最低濃度或在最低濃度以下時，不作區(qū)別，均計為“≤0.031 2 μg/mL”。上述實(shí)驗(yàn)均平行操作2～3次，當(dāng)MIC值能準(zhǔn)確重復(fù)或只差一個濃度時才被接受，并以最低濃度作為MIC值；當(dāng)MIC值相差兩個濃度以上時，則需重新實(shí)驗(yàn)，直到符合要求為止。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同抗真菌藥物間MIC值進(jìn)行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，兩獨(dú)立菌種樣本之間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

選取的足癬疑似患者總計55例，真菌鏡檢及培養(yǎng)均為陽性的菌株36株 (65.45%)，鑒定后發(fā)現(xiàn)屬8種、2大類。其中皮膚癬菌29例 (80.56%)：紅色毛癬菌18例 (50.00%)，須癬毛癬菌4例 (11.11%)，石膏樣小孢子菌3例 (8.33%)，絮狀毛癬菌及羊毛狀小孢子菌各2例 (5.56%)；念珠菌7例 (19.44%)：白念珠菌3例 (8.33%)，光滑念珠菌2例 (5.56%)，克柔念珠菌2例 (5.56%)。

8種抗真菌藥物對36株受試菌的MIC值范圍見表1。MIC最低值為0.031 2 μg/mL，出現(xiàn)在伏立康唑作用6種真菌，紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、絮狀毛癬菌、白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌。特比萘芬作用5種真菌，紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌、絮狀毛癬菌、羊毛狀小孢子菌。酮康唑作用4種真菌，絮狀毛癬菌、白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌。MIC值最高值為>64 μg/mL，出現(xiàn)在氟康唑?qū)ρ蛎珷钚℃咦泳?/p>

表1　8種抗真菌藥物對8種真菌的MIC范圍 (μg/mL)

8種藥物對8種真菌的MIC平均秩次的比較見表2。8種抗真菌藥物對8種真菌的MIC值均存在顯著差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。平均秩次比較后發(fā)現(xiàn)，伊曲康唑?qū)ρ蛎珷钚℃咦泳囊志Ч^強(qiáng)，對石膏樣小孢子菌的抑菌效果較弱。特比萘芬對羊毛狀小孢子菌的抑菌效果較強(qiáng)，對白念珠菌的抑菌效果較弱。酮康唑?qū)ρ蛎珷钚℃咦泳囊志Ч^強(qiáng)，對石膏樣小孢子菌的抑菌效果較弱。伏立康唑?qū)ρ蛎珷钚℃咦泳囊志Ч^強(qiáng)，對石膏樣小孢子菌的抑菌效果較弱。咪康唑?qū)ρ蛎珷钚℃咦泳囊志Ч^強(qiáng)，對石膏樣小孢子菌的抑菌效果較弱。5-氟胞嘧啶對光滑念珠菌的抑菌效果較強(qiáng)，對紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌、絮狀毛癬菌、羊毛狀小孢子菌均的抑菌效果較弱。兩性霉素B對光滑念珠菌的抑菌效果較強(qiáng)，對石膏樣小孢子菌和須癬毛癬菌的抑菌效果較弱。氟康唑?qū)饣钪榫囊志Ч^強(qiáng)，對石膏樣小孢子菌的抑菌效果較弱。

8種抗真菌藥物在皮膚癬菌和念珠菌兩大類菌種間的MIC平均秩次的比較見表3。除伊曲康唑之外，其余7種抗真菌藥物對兩大類真菌的MIC均存在顯著差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。特比萘芬對皮膚癬菌的平均秩次最小。5-氟胞嘧啶對念珠菌的平均秩次最小。

表2　每種抗真菌藥物對8種真菌的MIC平均秩次的比較結(jié)果

注：表中多個獨(dú)立樣本的比較采用Kruskal-Wallis法

表3　每種抗真菌藥物在皮膚癬菌和念珠菌間的MIC平均秩次的比較結(jié)果

注：表中兩個獨(dú)立樣本的比較采用Wilcoxon法

3　討　　論

足癬是致病性皮膚癬菌在足部引起的皮膚病，該病多發(fā)。足癬治療最好根據(jù)體外藥敏結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥，在最安全、經(jīng)濟(jì)的情況下獲得最佳療效。有研究顯示，CLSI M38-A2方案操作簡便，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性[3]。胡小平等[4]運(yùn)用該方案對須癬毛癬菌進(jìn)行抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同抗真菌藥物對須癬毛癬菌的藥敏存在明顯差異。Luciana等[5]利用M38-A2方案，研究原兒茶酸協(xié)同氟康唑?qū)t色毛癬菌和須癬毛癬菌的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)氟康唑聯(lián)合原兒茶酸后，抑菌作用明顯增強(qiáng)。聶振華等[6]利用M27-A方案發(fā)現(xiàn)酮康唑和萘替芬、特比萘芬聯(lián)合應(yīng)用對淺部真菌病的致病菌具有協(xié)同抑菌作用。

本實(shí)驗(yàn)首先鑒定了足癬的致病菌種，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)陽性的36株真菌，屬8個種：紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌、絮狀毛癬菌、羊毛狀小孢子菌、白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌；兩大類：皮膚癬菌、念珠菌。目前的抗真菌藥物發(fā)展相對緩慢，我們盡量全面的選取了8種抗真菌藥物：氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑、特比萘芬，兩性霉素B，咪康唑、5-氟胞嘧啶。運(yùn)用CLSI M38-A2方案檢測皮膚癬菌 (紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌、絮狀毛癬菌、羊毛狀小孢子菌)的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用M27-A3方案檢測念珠菌 (白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌)[7-8]。

從濃度范圍看，MIC最低值為0.031 2 μg/mL，伏立康唑次數(shù)最多，為6次，針對的菌種既包括皮膚癬菌也包括念珠菌。特比萘芬5次，針對的全部為皮膚癬菌。酮康唑4次，以念珠菌為主。MIC最高值為>64 μg/mL，出現(xiàn)在氟康唑?qū)ρ蛎珷钚℃咦泳?，這一現(xiàn)象雖與氟康唑的配置濃度有一定關(guān)系，但也提示氟康唑的藥敏度不高。

8種藥物對8種真菌的MIC值比較后發(fā)現(xiàn)，8種藥物對8種真菌的藥敏存在顯著差異。同時還發(fā)現(xiàn)5-氟胞嘧啶對皮膚癬菌的抑菌效果均較弱，但對念珠菌的抑菌效果均較強(qiáng)。特比萘芬對皮膚癬菌的抑菌效果均較強(qiáng)，對念珠菌的抑菌效果均較弱。將實(shí)驗(yàn)菌種分為皮膚癬菌和念珠菌兩大類進(jìn)行比較，若平均秩次越小，則藥物對該類真菌的抑菌效果越強(qiáng)。結(jié)果，除伊曲康唑外，其余7種抗真菌藥物對兩大類真菌的MIC值均存在顯著差異。其中，特比萘芬對表皮癬菌的平均秩次值最小，對念珠菌的平均秩次值最大，提示其對表皮癬菌的抑菌效果較強(qiáng)，對念珠菌的抑菌效果較弱。相反的，5-氟胞嘧啶對念珠菌的平均秩次值最小，對表皮癬菌的平均秩次值最大，提示其對念珠菌的抑菌效果較強(qiáng)，對皮膚癬菌的抑菌效果較弱。

本實(shí)驗(yàn)提示，以氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑、特比萘芬，兩性霉素B，咪康唑、5-氟胞嘧啶在內(nèi)的8種抗真菌藥物，對取自足癬的8種真菌的藥敏存在顯著差異。對于菌種鑒定為皮膚癬菌者，特比萘芬的體外抑菌效果似乎更好[9]；對于念珠菌感染者，5-氟胞嘧啶的抑菌效果似乎更佳。由于樣本量有限，本課題的結(jié)果僅為足癬的臨床用藥提供一定參考。同時，由于5-氟胞嘧啶尚無外用劑型，本次體外試驗(yàn)結(jié)果尚有待體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

[1]趙辨.中國臨床皮膚病學(xué)[M].第1版.南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社.2009：555-556.

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[本文編輯]王飛

Antifungal susceptibilities of 36 isolates from tinea pedis evaluated with CLSI M38-A2 and M27-A3 schemes

BU Xiao-lin1,FAN Juan1,HU Xiao-li1,JIANG Jian-hua1,QU Zi-wei1,GU Jun2

(1.Desect1mentofDermatology,Gonglihospital,Shanghai200135;2.Desect1mentofDermatology,Changhaihospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433)

ObjectiveTo investigate the antifungal characteristics of fluconazole (FCZ),itraconazole (ITR),voriconazole (VCZ),ketoconazole (KETO),terbinafine (TER),amphotericin B (AmB),miconazole (MIC),5-fluorocytosine (5-FC) to thirty six isolates from tinea pedis.MethodsA total of fifty five fungal samples from suspected patients with tinea pedis were examined by microscopy,culture and identification.Minimum inhibitory concentrations (MICs)were determined by Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)M38-A2 and M27-A3 scheme.ResultsThirty six strains of pathogenic fungi were isolated,which were positive both in microscopic examination and culture.They were identified as eight species:Trichophytonrubrum,Trichophytonmentagrophytes,Microsporumflavescens,Trichophytonfloccosum,Microsporonlanosum,Candidaalbicans，Candidaglabrata，Candidakrusei,and two categories:DermatophyteandCandida.DermatophyteandCandidawere evaluated with CLSI M38-A2 scheme and M27-A3,respectively.The MICs of eight kinds of antifungal agents to eight kinds of fungi were compared.There were significant differences in MICs of eight kinds of fungi using FCZ,ITR,VCZ,KETO,TER,AMB,MIC and 5-FC (P<0.05).ComparisonoftheMICsofDermatophyteandCandida,thereweresignificantdifferencesusingFCZ,VCZ,KETO,TER,AMB,MIC,5-FC(P<0.05),except for ITR (P>0.05).The mean rank of TER againstDermatophytewas minimum.ConclusionEight antifungal agents had significant different antifungal characteristics against eight kinds of fungi.Except ITR,others had significant differences of antifungal characteristics betweenDermatophyteandCandida.Comparatively,TER showed the best effect againstDermatophyte.

tinea pedis；Dermatophyte；Candida；antifungal susceptibility；M38-A2 scheme；M27-A3 scheme

2016-04-08

浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年醫(yī)學(xué)人才培養(yǎng)計劃 (PWRq2013-02)，上海市科委生物醫(yī)藥領(lǐng)域產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目 (13DZ1930906)

卜曉琳，女 (蒙古族)，博士，主治醫(yī)師.E-mail:xiaolinbu@yeah.net

顧軍，E-mail:gujun79@163.com

R 978.5

A

1673-3827(2016)11-0169-05