天然產(chǎn)物TS抗念珠菌作用研究

夏曉萍　葉紅　鄭彩虹　俸春紅　劉龍孝

(1.浙江大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310058；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，杭州 310006；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，杭州 310008)

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天然產(chǎn)物TS抗念珠菌作用研究

夏曉萍1,2葉紅2鄭彩虹2俸春紅3劉龍孝1

(1.浙江大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310058；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，杭州 310006；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，杭州 310008)

目的探討天然產(chǎn)物TS體外抗念珠菌作用。方法采用微量液基稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度 (MIC)，瓊脂稀釋法測(cè)定最低殺菌濃度 (MFC)，透射電鏡觀察TS對(duì)念珠菌超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果TS抗白念珠菌的MIC范圍0.08～0.32 mg/mL，抗光滑念珠菌MIC范圍0.08～0.16 mg/mL，抗熱帶念珠菌MIC范圍0.32～0.64 mg/mL,抗近平滑念珠菌MIC 0.32 mg/mL，抗克柔念珠菌MIC 0.32 mg/mL。對(duì)白念珠菌具有殺菌作用，MFC 0.64 mg/mL。透射電鏡下可見(jiàn)：細(xì)胞壁皺縮、破裂；細(xì)胞核異常；細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)較多空泡狀結(jié)構(gòu)；細(xì)胞中無(wú)完整細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。結(jié)論TS具有明確的抗念珠菌作用，可使其形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯

三萜皂苷；抗真菌；念珠菌

[Chin J Mycol，2016，11(3):149-152]

基于環(huán)境、氣候因素，尤其近30 a來(lái)，臨床上廣譜抗生素、皮質(zhì)類(lèi)固醇、免疫抑制劑的廣泛使用，器官移植技術(shù)的開(kāi)展，艾滋病患者和糖尿病患者的增加，導(dǎo)致念珠菌感染臨床高發(fā)，甚至成為免疫受損患者的重要死亡原因。念珠菌屬 (Candida)屬于子囊菌亞門(mén)、子囊菌綱、酵母菌目、酵母菌科。該屬中最常見(jiàn)的致病性念珠菌是白念珠菌 (Candi-daalbicans)，其他還有光滑念珠菌 (Candidaglabrata)、近平滑念珠菌 (Candidaparasilosis)、熱帶念珠菌 (Candidatropicalis)、克柔念珠菌 (Candidakrusei)、乳酒念珠菌 (Candidakefyr)等。白念珠菌最為多見(jiàn)，致病力最強(qiáng)，約占臨床分離株的50%～70%不等。但流行病學(xué)資料顯示：白念珠菌引起的感染近年有逐漸下降的趨勢(shì)，而非白念珠菌的比例在逐漸升高[1-2]。

伴隨著不斷問(wèn)世的人工合成抗真菌藥，真菌的耐藥問(wèn)題日漸嚴(yán)重，因此從天然產(chǎn)物中篩選抗真菌藥成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

本文將探討天然產(chǎn)物TS：來(lái)自山茶科 (Theaceae)山茶屬 (Camellia)植物茶 (Camellia sinensis L)的三萜皂苷的抗念珠菌作用。

1　材料和方法

1.1受試藥物

天然產(chǎn)物TS由課題組提取。原料由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所提供，采用醇提取法，再經(jīng)重結(jié)晶得到。

1.2試驗(yàn)材料和儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基 (含L-谷酰胺而不含碳酸氫鈉，含pH指示劑)(上海生工生物)；嗎啉基丙磺酸 (MOPS)(上海生工生物)；科瑪嘉顯色培養(yǎng)基 (鄭州博賽生物技術(shù)有限公司)；改良沙氏培養(yǎng)基 (青島海博生物技術(shù)有限公司)；YPD液體培養(yǎng)基 (青島海博生物技術(shù)有限公司)；生物安全柜 (The Baker Company)；全自動(dòng)微生物分析儀 (VITEK-Compact,法國(guó)生物梅里埃)；漩渦混合器 (VORTEX-GENIE2)；生化培養(yǎng)箱 (上海精實(shí)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；透射電鏡 (JEM-1200EX，日立)。

1.3受試菌株

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株6株：白念珠菌4株 (ATCC64548,ATCC90029,ATCC64550,ATCC10231)；近平滑念珠菌1株 (ATCC22019)；克柔念珠菌1株 (ATCC6258)。(標(biāo)準(zhǔn)菌種均由中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供)；臨床分離株50株：其中白念珠菌32株；光滑念珠菌12株；熱帶念珠菌4株；近平滑念珠菌1株；克柔念珠菌1株。臨床分離株均由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科醫(yī)院臨床分離得到，分別來(lái)自于陰道、腸道、口腔、表皮，經(jīng)顯色培養(yǎng)基鑒定為念珠菌。

1.4微量液基稀釋法測(cè)定TS體外抗念珠菌活性 (MIC)[3-4]

供試藥品的稀釋先配制高濃度貯存液。實(shí)驗(yàn)時(shí)，再以RPMI液體培養(yǎng)基稀釋成終濃度的2倍。其終濃度分別為2.56 mg/mL、1.28 mg/mL、0.64 mg/mL、0.32 mg/mL、0.16 mg/mL、0.08 mg/mL、0.04 mg/mL、0.02 mg/mL、0.01 mg/mL。

菌懸液的制備將受試菌株在沙氏培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)種2次，以確保純度和活力。經(jīng)35℃培養(yǎng)24 h,取5個(gè)直徑大于1 mm的菌落于5 mL無(wú)菌生理鹽水中震蕩15 s，制成菌懸液。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板將其濃度調(diào)至菌濃度為 (1～5)×106CFU/mL。然后用RPMI液基1∶50稀釋后再1∶20稀釋 (即共稀釋1 000倍)，至菌濃度 (1～5)×103CFU/mL。

試驗(yàn)培養(yǎng)基RPMI-1640粉 (含L-谷酰胺而不含碳酸氫鈉，含pH指示劑)10.4 g，MOPS (嗎啉基丙磺酸)34.53 g，加入去離子水900 mL，用1 M NaOH調(diào)pH7.0 (25℃),定容至1 L。使MOPS終濃度為0.165 mol/L,最后用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

接種取微孔96孔板，1～9列孔中由高濃度至低濃度分別加0.1 mL藥液，再加0.1 mL菌懸液。11號(hào)孔加0.2 mL菌懸液 (陽(yáng)性孔)，12號(hào)孔加0.2 mL空白對(duì)照 (不加藥物的液基)。

培養(yǎng)藥敏板用塑料包裹后，35℃不搖動(dòng)培養(yǎng)48 h。觀察結(jié)果。

結(jié)果判定按照CLSI制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀。最小抑菌濃度 (MIC)為肉眼直接觀察到的真菌生長(zhǎng)的完全被抑制時(shí)的藥物濃度。在一批實(shí)驗(yàn)中，所有被測(cè)菌株得到的MIC值為MIC范圍；能抑制50%或80%受試菌所需的MIC值，分別為MIC50值和MIC80值。

1.5最低殺菌濃度 (MFC)測(cè)定[5-6]

選取白念珠菌菌株試驗(yàn)管。依次將未見(jiàn)白念珠菌生長(zhǎng)的各管培養(yǎng)物各吸取0.1 mL涂布于沙氏培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)7 d，平板上菌落數(shù)小于5個(gè)的最小稀釋度的藥物濃度即為最低殺菌濃度。

1.6透射電鏡觀察TS對(duì)白念珠菌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[7]

將白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在沙氏培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)種2次，以確保純度和活力。取白念珠菌接種于YPD培養(yǎng)液中，150 r/min震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。以和培養(yǎng)液1∶1的比例加入供試品 (試驗(yàn)終濃度0.64 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)10 h，1 000 r/min離心10 min，PBS (pH=7.2)漂洗3次，至上清液無(wú)色。

去上清液，加3%戊二醛5 mL于4℃固定過(guò)夜；再以PBS漂洗3次，1%鋨酸固定；分別以乙醇、丙酮脫水；再以丙酮與包埋劑按不同比例混合后浸透樣品。

包埋劑包埋樣品，烘烤、聚合、定位、切片、鉛鈾染色，在透射電鏡 (JEM-1200EX，日立)下觀察。

2　結(jié)　　果

2.1TS體外抗念珠菌作用的微量液基稀釋法試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1

2.2最低殺菌濃度 (MFC)

將1～4號(hào)管培養(yǎng)液各取0.1 mL涂布于沙氏培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后，可見(jiàn)2.56 mg/mL、1.28 mg/mL、0.64 mg/mL濃度的3個(gè)平板無(wú)菌生長(zhǎng)，0.32 mg/mL有大于5個(gè)的菌落生長(zhǎng)。

結(jié)果顯示MFC為0.64 mg/mL，MFC/MIC=2。因?yàn)镸FC/MIC<4，顯示供試品藥物有殺菌作用。

表1TS微量液基稀釋法抗念珠菌作用

Tab.1Antifungal activity of TS againstCandidaspecies by microdilution antifungal susceptibility test

致病菌MIC范圍(mg/mL)MIC50(mg/mL)MIC80(mg/mL)白念珠菌0.08～0.320.160.32光滑念珠菌0.08～0.160.080.08熱帶念珠菌0.32～0.640.320.32近平滑念珠菌0.320.320.32克柔念珠菌0.320.320.32

2.3電鏡下白念珠菌在TS作用前后的變化

白念珠菌的正常細(xì)胞在電鏡下觀察顯示：細(xì)胞形狀規(guī)則；細(xì)胞壁完整，厚薄均勻；細(xì)胞基質(zhì)均勻，細(xì)胞器豐富；細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)清晰完整的細(xì)胞核、線(xiàn)粒體等 (見(jiàn)圖1)。

經(jīng)供試品作用過(guò)的白念珠菌在電鏡下顯示：細(xì)胞壁皺縮、破裂；細(xì)胞核異常；細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)較多空泡狀結(jié)構(gòu)；細(xì)胞中無(wú)完整細(xì)胞器結(jié)構(gòu) (見(jiàn)圖2)。

3　討　　論

抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)是測(cè)定病原真菌對(duì)抗真菌藥物的敏感性的體外試驗(yàn)方法。常用最低抑菌濃度 (minimal inhibitory concentration,MIC)表示，即藥物完全抑制真菌生長(zhǎng)的最低濃度。常用MIC范圍、MIC50、MIC80等數(shù)值來(lái)評(píng)判[6]。

液基法是根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所 (Clinical and Laboratory Institute,CLSI)推出的方法，即“酵母菌液基稀釋法抗真菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)參考方案文件”(M27-P)，此后經(jīng)修改至目前的M27-A2。該方法是針對(duì)酵母菌的抗真菌藥敏實(shí)驗(yàn)方法，主要包括念珠菌和隱球菌。此法是用液體培養(yǎng)基配制一系列稀釋度的藥液，然后接種受試菌的菌懸液。經(jīng)一定溫度孵育后，測(cè)定藥物在體外抑制真菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度。微量液基法是采用一次性使用的無(wú)菌微量稀釋板 (96孔板)進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，將一系列稀釋的藥物液基加入每個(gè)小孔，再加入菌懸液，經(jīng)培養(yǎng)后，觀測(cè)MIC值。由于此法在微量孔中進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便，成本低，因此成為國(guó)內(nèi)外抗真菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)的最常用方法。但缺陷是結(jié)果判定以肉眼觀察是否澄清為主要標(biāo)準(zhǔn)，會(huì)有一定誤差。

圖1正常的白念珠菌超微結(jié)構(gòu)電鏡圖譜 (對(duì)照組)(25 000×)圖2TS作用后的念珠菌超微結(jié)構(gòu)電鏡圖譜 (供試品組) (25 000×)

Fig.1Ultra microstructure ofCandidaalbicansby transmission electron microscope (25 000×)Fig.2Ultra microstructure ofCandidaalbicanswith Theasaponins action by transmission electron microscope (25 000×)

測(cè)定藥物在體外對(duì)病原微生物 (真菌)有無(wú)殺滅作用，常用最低殺菌濃度 (minimal fungicidal concentration,MFC)表示，即殺死真菌所需的最低藥物濃度。當(dāng)藥物濃度在稍高于MIC值濃度下的抑菌作用是不可逆的，稱(chēng)為殺菌作用。MFC值與MIC值之比，反應(yīng)了抗菌藥物殺菌能力的強(qiáng)弱。通常，當(dāng)比值≤4時(shí)，認(rèn)為該藥具有殺菌作用，當(dāng)比值>4時(shí)，則表示為抑菌藥[1,6]。液基法由于菌體和藥物能在液體里充分接觸，結(jié)果更具精確性和重復(fù)性；且可進(jìn)行再培養(yǎng)從而確定MFC。故本試驗(yàn)采用微量液基稀釋法先測(cè)定MIC，再確定MFC。

體外藥敏試驗(yàn)中，培養(yǎng)基、菌株等因素皆可影響試驗(yàn)結(jié)果。固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基所得到的MIC可能會(huì)有一定差異。菌株的來(lái)源不同，對(duì)藥物的敏感性會(huì)有差異。故本試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株測(cè)定MFC。

真菌 (fungus)系真核生物，具有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞器等。透射電鏡 (transmission electron microscope，TEM)是觀察念珠菌的斷面、橫斷的差別、各種細(xì)胞器、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁等超微結(jié)構(gòu)的理想工具。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)過(guò)TS作用的念珠菌，其細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，為進(jìn)一步的研究提供了理論依據(jù)。

[1]溫海，李若瑜.醫(yī)學(xué)真菌學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2012:13-21,116-120.

[2]賈戰(zhàn)生，陳智.臨床微生物學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2010.165-190.

[3]王文莉，鄭瑋清，李若瑜,等.采用NCCLS M27-A方案微量法檢測(cè)念珠菌對(duì)抗真菌藥物的敏感性[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2001,24(2)：107-108.

[4]李若瑜，劉偉.抗真菌藥物體外藥敏試驗(yàn)的應(yīng)用前景[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，30(1)：6-8.

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[本文編輯]王飛

Invitroactivity of triterpene saponins from tea plant (Theaceae) againstCandidaspecies

XIA Xiao-ping1,2,YE Hong2,ZHENG Cai-hong2,FENG Chun-hong3,LIU Long-xiao1

(1.ZhejiangUniversity,Instituteofpharmaceutics,Hangzhou310058,China;2.ZhejiangUniversity,Women'sHospital,Hangzhou310006,China;3.TeaResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310008,China)

ObjectiveTo explore the antifungtal activity of TS from Camellia sinensis L.againstCandida.MethodsThe minimal inhibitory concentration (MIC) was tested by broth microdilution method based on CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute).The minimal fungicidal concentration (MFC) was tested by agar plate dilution assay.The ultrastructure ofCandidaalbicanstreated with TS was observed by transmission electron microscopy.ResultThe range of inhibitory concentration of the antifungal activity againstCandidaalbicanswere from 0.08 mg/mL to 0.32 mg/mL.The minimal fungicidal concentration againstCandidaalbicanswas 0.64 mg/mL.Candidaalbicanstreated with TS showed that the cell wall shrinked and ruptured,the cell nucleus had the abnormal morphology and the cell organelles were imcomplete as well as vacuoles were formed under TEM.ConclusionTS has antifungal activity againstCandidaspeciesinvitro.

triterpene saponins;antifungal activity;Candidaalbicans

2015-09-17

浙江省自然科學(xué)基金 (LY12C20012)，浙江省公益性技術(shù)研究項(xiàng)目 (2013C32084)

夏曉萍，女 (漢族)，本科，副主任藥師.E-mail:xiaxp@sohu.com

劉龍孝，E-mail:liulx@zju.edu.cn

R 379.4R 978.5

A

1673-3827(2016)11-0149-04