利福噴丁對(duì)氟康唑體外抗耐藥白念珠菌的增效作用

王玉連　張璐璐　秦玉璘　曹永兵　吳建華

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院皮膚科，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

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利福噴丁對(duì)氟康唑體外抗耐藥白念珠菌的增效作用

王玉連1張璐璐2秦玉璘2曹永兵2吳建華1

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院皮膚科，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

目的測(cè)定利福噴丁 (Rifapentine)對(duì)氟康唑 (Fluconazole)體外抗耐藥白念珠菌的增效作用。方法參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì) (CLSI)的M27-A2方案測(cè)定利福噴丁與氟康唑?qū)Π啄钪榫淖畹鸵志鷿舛?(MIC)；利用棋盤式微量液基稀釋法測(cè)定利福噴丁聯(lián)合氟康唑體外抗白念珠菌的效果。結(jié)果利福噴丁單藥時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)所用12株白念珠菌均無抗菌活性 (MIC80>1 024 μg/mL)。在氟康唑敏感白念珠菌株中，利福噴丁聯(lián)合氟康唑后未表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng) (FICI>0.5)；在氟康唑耐藥白念珠菌中，利福噴丁聯(lián)合氟康唑后均表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用 (FICI<0.1)。結(jié)論利福噴丁單用無抗白念珠菌活性，但利福噴丁能顯著增強(qiáng)氟康唑抗耐氟康唑白念珠菌活性。

白念珠菌；利福噴??；氟康唑；協(xié)同作用

[Chin J Mycol，2016，11(3):156-159]

白假絲酵母菌 (Candidaalbicans)亦稱白念珠菌，是一種條件致病性真菌。近年來，由于廣譜抗生素的大量、不合理應(yīng)用，激素的濫用，腫瘤的化學(xué)治療及器官移植后免疫抑制劑的應(yīng)用，免疫功能低下患者不斷增多，使真菌感染幾率大大增加，其中白念珠菌感染最常見[1-2]。雖然氟康唑?yàn)榕R床首

選治療白念珠菌藥物，但隨著氟康唑的大量、頻繁使用，真菌耐藥發(fā)生率逐年上升，導(dǎo)致臨床治療真菌感染的失敗。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利福噴丁、舍曲林等聯(lián)合氟康唑時(shí)對(duì)耐氟康唑白念珠菌可能有協(xié)同作用[3]。利福噴丁為利福霉素類抗生素，是結(jié)核病的一線用藥，抗結(jié)核桿菌作用比利福平強(qiáng)，且藥物不良反應(yīng)比利福平小。目前為止，關(guān)于利福噴丁體外抗真菌協(xié)同作用的研究較少，因此，我們開展利福噴丁聯(lián)合氟康唑體外抗白念珠菌的效應(yīng)研究，為臨床治療白念珠菌感染探索有效用藥。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

儀器HZ-9211K恒溫振蕩器 (太倉市科教器材廠)；MJX智能型真菌培養(yǎng)箱 (寧波江南儀器廠)；SW-CJ-1F型單人雙面超凈化工作臺(tái) (蘇州漢達(dá)工業(yè)自動(dòng)化有限公司)；96孔平底帶蓋平板 (美國Corning Incorporated生產(chǎn))；Multishan MK3型酶標(biāo)儀 (芬蘭Labsystems生產(chǎn))。

菌株白念珠菌敏感菌株 (FLC-sensitiveCandidaalbicans)：SC5314，國際實(shí)驗(yàn)室通用菌株，由美國華盛頓喬治敦大學(xué)免疫微生物教研室William A.Fonzi教授惠贈(zèng) (氟康唑MIC80=0.5 μg/mL);Y0109，臨床標(biāo)準(zhǔn)菌株，由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心提供，并經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定 (氟康唑MIC80=0.5 μg/mL)；藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌選用CLSI推薦的近平滑念珠菌 (Candidaparapsilosis)ATCC22019以及10株白念珠菌臨床分離株，以上菌株均由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心保存并提供，經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定。所有菌株試驗(yàn)前均在沙氏培養(yǎng)基 (SDA)劃板活化，30℃培養(yǎng)24～48 h，以保證受試真菌的活力與純度，并于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

藥物利福噴丁 (美國melone公司，批號(hào)S0118A)，將利福噴丁用二甲基亞砜 (DMSO,Sigma公司)溶解為64 mg/mL，-20℃避光儲(chǔ)存?zhèn)溆?；氟康唑注射?(大扶康DIFLUCAN，輝瑞制藥有限公司，批號(hào)A075102，濃度2 mg/mL)，4℃儲(chǔ)存。

培養(yǎng)基SDA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂18 g，加三蒸水900 mL溶解，加入2 mg/mL氯霉素水溶液50 mL，調(diào)整pH值為7.0±0.1 (25℃)，定容至1 000 mL，高壓滅菌，4℃保存。RPMI 1640培養(yǎng)液：RPMI 1640粉末10 g，NaHCO32.0 g，三氮嗎啡啉丙磺酸鈉 (MOPS，Sigma)34.5 g (0.165 M)，加三蒸水900 mL溶解，1 moL/L NaOH溶液調(diào)pH值為7.0±0.1 (25℃)，定容至1 000 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后于4℃保存。YEPD培養(yǎng)液：酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加三蒸水900 mL溶解，加入2 mg/mL氯霉素水溶液50 mL，定容至1 000 mL，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

參考2002年CLSI公布的的M27-A2方案[4]。

菌液制備用接種環(huán)從4℃保存的SDA培養(yǎng)基上挑取白念珠菌單克隆，接種到1 mL YEPD培養(yǎng)液，于30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，活化24 h使真菌處于指數(shù)生長期后期。取該菌液同樣方法再次活化，16 h后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度至1×103～5×103CFU/mL。

藥敏板制備和棋盤式微量稀釋法取無菌96孔板，將配制好的菌液各100 μL加入96孔板的2～11列中，第11列不加藥作生長對(duì)照，第12加入RPMI 1640培養(yǎng)液100 μL作空白對(duì)照，第1列加入相應(yīng)體積的菌液及藥液，1～10列逐級(jí)倍比稀釋 (過程中3次更換槍頭)，使敏感菌株氟康唑終濃度0.125～64 μg/mL；耐藥菌株0.5～256 μg/mL；所有菌株利福噴丁濃度均為2～1 024 μg/mL。藥物聯(lián)合采用棋盤法，合用的2種藥物在96孔板上以二維棋盤的縱 (A至H)橫 (1至10)分別兩個(gè)方向進(jìn)行2倍比稀釋，同時(shí)設(shè)立生長對(duì)照和空白對(duì)照。使得氟康唑與利福噴丁合用后，敏感株氟康唑的終濃度為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 μg/mL；耐藥菌株氟康唑終濃度為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL；所有菌株利福噴丁終濃度為128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL。

評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)最低抑菌濃度 (MIC值)和分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)。MIC80值 (即真菌生長80%被抑制時(shí)的最低藥物濃度)：在35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h及48 h后用酶標(biāo)儀于630 nm下測(cè)各孔OD值，并與陽性對(duì)照孔相比，以O(shè)D值下降80%以上的最低濃度孔中的藥物濃度為氟康唑及利福噴丁對(duì)該受試菌株的MIC80值，每次實(shí)驗(yàn)配制一塊質(zhì)控菌藥敏板，質(zhì)控菌MIC值在規(guī)定的參考范圍內(nèi)，所有藥敏試驗(yàn)均重復(fù)操作3次。分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù) (fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)：聯(lián)合用藥時(shí)各藥物MIC值分別除以單獨(dú)用藥時(shí)MIC值的商的和，即FICI=MIC (A combo/MIC (A alone)+MIC (B combo/MIC (B alone)，是評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥時(shí)兩藥間相互作用的主要參數(shù)。FICI判定標(biāo)準(zhǔn)：FICI<0.5為協(xié)同作用，F(xiàn)ICI值越小，兩藥協(xié)同作用越強(qiáng)；0.54為拮抗作用。

2　結(jié)　　果

利福噴丁與氟康唑?qū)Σ煌瑏碓床煌舾行缘陌啄钪榫淖饔媒Y(jié)果見表1。單用利福噴丁對(duì)所有受試菌株的MIC80測(cè)定值均>1 024 μg/mL；對(duì)氟康唑敏感白念珠菌 (氟康唑MIC80<8 μg/mL)SC5314、Y0109、163，氟康唑單用藥時(shí)的MIC80值為0.5～1 μg/mL，與利福噴丁聯(lián)合后其MIC80值沒有變化，利福噴丁與氟康唑合用的FIC指數(shù)為1.000 (FICI>0.5)，兩藥的相互作用表現(xiàn)為無關(guān)作用；對(duì)氟康唑耐藥白念珠菌 (氟康唑MIC80>32 μg/mL)112869、112679、100、103、331、632、J18、J38及18#，兩藥聯(lián)合后氟康唑的MIC80值由單用時(shí)的>64 μg/mL，下降至1～8 μg/mL，利福噴丁的MIC80值由單用時(shí)的>1 024 μg/mL，下降至32～64 μg/mL，F(xiàn)IC指數(shù)分別為0.039、0.023、0.020、0.047、0.035、0.039、0.039、0.047、0.035 (FICI<0.5)，兩藥的相互作用為協(xié)同作用。

表1利福噴丁和氟康唑體外抗白念珠菌效應(yīng)

Tab.1Invitroantifungal susceptibility assays of rifapentine with fluconazole againstCandidaalbicans

編號(hào)菌株單藥MIC80(μg/mL)聯(lián)合MIC80(μg/mL)FCZRFTFCZRFTFICI聯(lián)合效應(yīng)1SC53140.5>10240.511.000無關(guān)2Y01091>1024111.000無關(guān)31630.5>10240.511.000無關(guān)4112869>64>10241640.039協(xié)同5112679>64>10241320.023協(xié)同6100>256>10242320.020協(xié)同7103>256>10248640.047協(xié)同8331>256>10242640.035協(xié)同9632>256>10244640.039協(xié)同10J18>256>10244640.039協(xié)同11J38>256>10248640.047協(xié)同1218#>256>10242640.035協(xié)同

注：MIC.minimal inhibitory concentrations，最低抑菌濃度；FICI.fractional inhibitory concentration index，分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)；FCZ.fluconazole，氟康唑；RFT.rifapentine，利福噴丁

3　討　　論

利福噴丁為利福霉素類抗結(jié)核藥，其抗結(jié)核機(jī)制與利福平基本相似，可與依賴DNA的RNA多聚酶的亞單位牢固結(jié)合，抑制細(xì)菌RNA的合成，防止該酶與RNA連接，阻斷RNA轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)而使DNA和蛋白的合成停止。同一劑量下利福噴丁對(duì)結(jié)核桿菌的殺滅作用明顯強(qiáng)于利福平,且同等劑量下對(duì)患者胃腸道刺激及肝功能損傷均小于利福平，為抗結(jié)核的一線用藥[5-6]。20世紀(jì)70年代初，研究者開始探索利福霉素類抗生素聯(lián)合抗真菌藥的協(xié)同效應(yīng)。Beggs等[7]通過棋盤微量稀釋法證明了利福平對(duì)兩性霉素B抗臨床分離的白念珠菌、近平滑念珠菌、星狀念珠菌等40株假絲酵母菌生長的增效作用。念珠菌生物被膜的形成與其耐藥性有重要的關(guān)系，Del Pozo等[8]通過不同藥物單用或合用對(duì)白念珠菌生物被膜形成研究表明：兩性霉素B單藥時(shí)最小生物膜清除濃度>10 mg/mL,與利福平聯(lián)合用藥時(shí)最小生物膜清除濃度為0.04 mg/mL,即利福平與兩性霉素B體外抗白念珠菌生物膜的形成具有協(xié)同作用。研究還顯示利福平對(duì)兩性霉素B體外抗光滑念珠菌等其他念珠菌屬生物被膜的形成也有增效作用。

氟康唑?yàn)槿蝾惪拐婢帲饕ㄟ^抑制真菌細(xì)胞膜的合成發(fā)揮其抑菌作用。目前由于氟康唑的臨床長期、反復(fù)、不合理應(yīng)用，致病真菌的耐藥率日趨升高，其中以白念珠菌耐藥情況最嚴(yán)峻[9]。目前文獻(xiàn)報(bào)道真菌耐藥機(jī)制主要包括四部分：①外排泵基因的過度表達(dá)：藥物外排增多導(dǎo)致白念珠菌胞內(nèi)藥物濃度減低，這是對(duì)唑類藥物耐藥的重要機(jī)制之一，相關(guān)外排基因主要包括ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)家族 (ATP-binding cassette transporter)和異化擴(kuò)散載體超家族 (major facilitators)。在白念珠菌的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)家族中，CDR1、CDR2基因的高表達(dá)與唑類耐藥密切相關(guān)，異化擴(kuò)散載體超家族的耐藥相關(guān)基因主要為MDR1p和Fullp[10]。②藥物靶酶的改變：唑類抗真菌藥作用靶酶是Erg11，Erg11基因的突變或過度表達(dá)是引起耐藥的重要原因之一[11]。③生物膜的形成：生物被膜形成后，白念珠菌對(duì)氟康唑的敏感性下降了幾十倍甚至幾百倍，目前其耐藥機(jī)制尚不明確，可能與生物屏障的形成有關(guān)。④念珠菌細(xì)胞膜通透性改變：細(xì)胞膜通透性降低導(dǎo)致胞內(nèi)抗真菌藥物累積減少，不足以發(fā)揮其抗真菌作用。目前，多采用增加藥物劑量、開發(fā)新藥等方法克服白念珠菌耐藥問題。加大藥物劑量必定會(huì)增加其毒副作用，新藥的開發(fā)耗費(fèi)時(shí)間長、成本高、成效低。近年來，人們?cè)谔剿骺茖W(xué)的聯(lián)合用藥同時(shí)，開始開發(fā)抗真菌藥增效劑。最近研究表明黃酮類化合物與氟康唑聯(lián)用能顯著增強(qiáng)其抗真菌活性，da Silva等[12]發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物可能通過增加活性氧 (ROS)、破壞線粒體、損傷DNA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮對(duì)氟康唑的增效作用。大量研究表明黃芩素對(duì)氟康唑具有顯著協(xié)同抗真菌作用，Huang S等[13]研究發(fā)現(xiàn)黃芩素可能通過抑制藥物外排泵對(duì)氟康唑起增效作用。大量文獻(xiàn)報(bào)道他克莫司等鈣調(diào)神經(jīng)酶抑制劑、阿司匹林等非甾體抗炎藥、多慮平等三環(huán)類抗抑郁藥、三氯生等抗生素以及小檗堿等植物提取物對(duì)氟康唑抗耐藥真菌有增效作用。

本研究參照參考CLSI提出的M27-A2方案，對(duì)12株白念珠菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，觀察利福噴丁和氟康唑體外抗白念珠菌聯(lián)合效應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)所用的12株白念珠菌中，利福噴丁單用藥時(shí)MIC80值均>1 024 μg/mL，未表現(xiàn)出抗真菌活性；對(duì)氟康唑敏感白念珠菌株，利福噴丁與氟康唑的MIC80值在合用前后沒有變化，兩藥合用的FICI>0.5，表明利福噴丁與氟康唑聯(lián)合未表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)；對(duì)氟康唑耐藥白念珠菌株，利福噴丁與氟康唑合用后，氟康唑的MIC80值降低了32～128倍，利福噴丁的MIC80值降低了16～32倍，F(xiàn)IC指數(shù)為0.020～0.047 (FICI<0.1)，兩藥合用表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用。利福噴丁協(xié)同氟康唑體外抗白念珠菌作用機(jī)制尚不明確，本次研究表明利福噴丁單用無抗真菌活性，其對(duì)氟康唑的增效作用只表現(xiàn)在氟康唑耐藥白念珠菌菌株中，而在敏感菌株中未表現(xiàn)出對(duì)氟康唑的增效作用，可能是氟康唑在較低濃度時(shí)就可以抑制敏感菌株的生長，無需聯(lián)合其他藥物。

本課題組首次發(fā)現(xiàn)利福噴丁對(duì)氟康唑抗氟康唑耐藥白念珠菌具有增效作用，我們將在后續(xù)研究中通過觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期，檢測(cè)胞膜甾醇含量、胞內(nèi)藥物含量及相關(guān)基因表達(dá)等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索利福噴丁對(duì)氟康唑抗耐藥白念珠菌作用機(jī)制，為耐藥白念珠菌感染的臨床治療及新藥研發(fā)等提供新途徑。

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[本文編輯]施慧

Synergistic effect of rifapentine with fluconazole against FLC-resistanceCandidaalbicans

WANG Yu-lian1，ZHANG Lu-lu2,QIN Yu-lin2,CAO Yong-bing2，WU Jian-hua1

(1.Desect1mentofDermatology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200433,China;2.NewDrugResearchandDevelopmentCenter,SchoolofPharmacology,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai,200433,China)

ObjectiveTo explore theinvitrosynergistic effect of rifapentine with fluconazole on FLC-resistanceCandidaalbicans.MethodsThe minimal inhibitory concentrations (MIC) of rifapentine and fluconazole againstCandidaalbicanswere detected by method of Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A2 microdilution.The effects of rifapentine and fluconazole againstCandidaalbicansinvitrowere valued by broth microdilution checkerboard technique system.ResultsIn the antifungal susceptibility assay，there was no antimicrobial activity of rifapentine single used against the 12 strains ofCandidaalbicans(MIC>1 024 μg/mL).The combined of rifapentine and fluconazole didn't display synergistic effect on the FLC-sensitiveCandidaalbicans(FICI>0.5),however,it had a significant synergistic effect on the FLC-resistanceCandidaalbicans(FICI<0.1).ConclusionRifapentine alone demonstrated no antifungal activity,but rifapentine can significantly enhance the effect of fluconazole against FLC-resistanceCandidaalbicans.

Canidiaalbicans；rifapentine；fluconazole；synergism

2015-10-16

國家973項(xiàng)目子課題 (2013CB531602)

王玉連，女 (漢族)，碩士研究生在讀，住院醫(yī)師.E-mail:weilaiyisheng626@163.com

曹永兵，E-mail:ybcao@vip.sina.com；吳建華，E-mail:wujh_ch@163.com

R 978.5

A

1673-3827(2016)11-0156-04