培元顆粒質(zhì)量初步研究

黃依鳴,李宛蓉,王　鍵,2,桂雙英,2,3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥　230012；2.新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥　230012；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥　230012)

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·方藥研究·

培元顆粒質(zhì)量初步研究

黃依鳴1,李宛蓉1,王鍵1,2,桂雙英1,2,3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥230012；2.新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230012；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥230012)

[摘要]目的建立培元顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜法對(duì)培元顆粒中人參、黃芪、淫羊藿進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定培元顆粒中人參皂苷Rb1與黃芪甲苷的含量。色譜柱為Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(梯度洗脫)，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的漂移管溫度為100 ℃，霧化溫度為30 ℃。結(jié)果薄層色譜法能檢出人參、黃芪、淫羊藿，斑點(diǎn)清晰，且陰性對(duì)照無(wú)干擾；人參皂苷Rb1和黃芪甲苷分別在2.46～20.5 μg/mL、1.54～7.69 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為96.84%、97.58%，RSD分別為1.15%、1.34%。結(jié)論所建立的方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，可以用于培元顆粒的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]培元顆粒；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法

培元顆粒是根據(jù)新安醫(yī)家汪機(jī)的“培本固元”理論，在孫一奎“壯元湯”的基礎(chǔ)上加減而成[1-3]，由人參、黃芪、淫羊藿等中藥組成，具有固本培元、溫陽(yáng)益氣之功效。原方為湯劑，本課題組采用現(xiàn)代提取與制劑技術(shù)研制了培元顆粒[4]。為更好地控制制劑質(zhì)量，本試驗(yàn)開(kāi)展培元顆粒的質(zhì)量研究。

1　儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1260型高效液相色譜儀：包括G1312C二元泵、G1316A柱溫箱、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器G4212B、ChemStation色譜工作站； SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：河南省鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海市三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；UV757CRT紫外分光光度計(jì)：上海精科有限公司；DZF-2002真空干燥箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司。

1.2材料人參、黃芪、淫羊藿等飲片購(gòu)于安徽省亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)周建理教授鑒定均為合格飲片；培元顆粒(自制)；陰性樣品溶液(自制)；薄層層析用硅膠G板、H板：山東省青島海洋化工廠。人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào) 110704-201223)、人參皂苷Re對(duì)照品(批號(hào) 110754-201324)、淫羊藿苷對(duì)照品(批號(hào) 110737-200415)、黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào) 110781-200613)：中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2　方法與結(jié)果

2.1薄層鑒別[5-8]

2.1.1人參的薄層鑒別取本品顆粒5 g，研細(xì)，加氯仿40 mL回流1 h，棄去氯仿液，藥渣揮干溶劑，加入水2 mL攪拌濕潤(rùn)，加入水飽和正丁醇20 mL，振搖，取正丁醇液蒸干，加甲醇2 mL使溶解制成樣品溶液；另取缺人參陰性顆粒5 g，同法制成陰性樣品溶液；取人參皂苷Rb1、人參皂苷Re對(duì)照品，加甲醇制成1 mg/mL的混合對(duì)照溶液。分別精密吸取上述3種溶液各5 μL，點(diǎn)于硅膠G薄層板上，采用氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)下層液展開(kāi)，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，日光燈檢視。結(jié)果在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上，3批樣品溶液顯示相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.1.2黃芪的薄層鑒別[9]取本品顆粒5 g，研細(xì)，加甲醇40 mL回流1 h，濾過(guò)，濾液采用中性氧化鋁柱(100～200目)純化：以40%甲醇洗脫，收集洗脫液100 mL，蒸干后加水40 mL使溶解；以水飽和正丁醇(1∶1)萃取2次，收集正丁醇液，用水洗滌2次；收集正丁醇層，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解制成樣品溶液；另取缺黃芪陰性顆粒5 g，同法制成陰性樣品溶液；取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成1 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別吸取上述3種溶液各10 μL，點(diǎn)于硅膠G板上，采用氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)下層液展開(kāi)，以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，日光燈和紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上，3批樣品日光下顯示相同的棕褐色斑點(diǎn)；紫外光燈(365 nm)下顯示相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)，而陰性樣品無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.1.3淫羊藿的薄層鑒別取本品顆粒5 g，研細(xì)，加水60 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液加水飽和正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，正丁醇層以氨水洗滌2次，收集正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，制成樣品溶液；另取缺淫羊藿陰性顆粒5 g，同法制成陰性樣品溶液；取淫羊藿苷對(duì)照品適量，加甲醇制成0.23 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別吸取上述3種溶液各10 μL，點(diǎn)于硅膠H板上，采用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)展開(kāi)，以三氯化鋁溶液為顯色劑，紫外燈(365 nm)下檢視。結(jié)果在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上，3批供試品顯示相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性樣品無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.2含量測(cè)定[10-11]

2.2.1色譜條件色譜柱：Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；漂移管溫度：100 ℃；霧化溫度：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取人參皂苷Rb1、黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇分別制成0.820 mg/mL人參皂苷Rb1、0.308 mg/mL黃芪甲苷的混合對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

注:1-3為培元顆粒樣品,4為人參皂苷Rb1、Re對(duì)照品,5為陰性樣品。圖1 人參薄層色譜圖 注:1-3為培元顆粒樣品,4為黃芪甲苷對(duì)照品,5為陰性樣品。圖2 黃芪薄層色譜圖 注:1-3為培元顆粒樣品,4為淫羊藿苷對(duì)照品,5為陰性樣品。圖3 淫羊藿薄層色譜圖

2.2.3供試品溶液的制備取本品顆粒10.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入純化水80 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲20 min，冷卻后稱定質(zhì)量，以純化水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，以水飽和正丁醇(1∶0.5)萃取4次，合并正丁醇液，以10%氨水洗滌2次，每次25 mL，收集正丁醇液蒸干，以50%甲醇溶解定容至5 mL，微孔濾膜(0.22 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4陰性樣品溶液的制備分別取缺人參陰性樣品和缺黃芪陰性樣品，依法制備陰性樣品溶液。

2.2.5系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件依法測(cè)定。結(jié)果在對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性樣品在此峰位無(wú)吸收。見(jiàn)圖4。

2.2.6線性關(guān)系考察分別精密吸取混合對(duì)照品溶液3、5、10、12、15、20、25 μL，注入液相色譜儀中，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件依法測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積的自然對(duì)數(shù)值(y)對(duì)進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)值(x)進(jìn)行線性回歸，得人參皂苷Rb1的回歸方程為y=1.283 5x+5.023 6(r=0.999 3)，黃芪甲苷的回歸方程y=1.508 9x+5.207 7(r=0.999 4)。結(jié)果表明，人參皂苷Rb1和黃芪甲苷分別在2.46～20.5 μg/mL、1.54～7.69 μg/mL范圍線性關(guān)系良好。

2.2.7精密度試驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件依法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果人參皂苷Rb1與黃芪甲苷的RSD分別為0.98%、1.10%，表明該方法精密度良好。

圖4 樣品(A)、對(duì)照品(B)、缺人參樣品(C)和缺黃芪樣品(D)的高效液相色譜圖(1.人參皂苷Rb1；2.黃芪甲苷)

2.2.8重復(fù)性考察取同一批樣品6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，依法測(cè)定人參皂苷Rb1與黃芪甲苷的峰面積，計(jì)算其RSD分別為1.30%、1.53%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，依法測(cè)定人參皂苷Rb1與黃芪甲苷的峰面積，計(jì)算其RSD分別為1.85%、2.14%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.10加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的同一批樣品5.0 g，6份，精密稱定，分別加入人參皂苷Rb1與黃芪甲苷對(duì)照品溶液適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，測(cè)定人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果人參皂苷Rb1與黃芪甲苷的平均回收率分別為96.84%、97.58%，RSD分別為1.15%、1.34%，表明該方法準(zhǔn)確可行。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.11樣品測(cè)定分別取自制的10批培元顆粒10 g，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備10批樣品溶液，分別吸取樣品溶液與混合對(duì)照品溶液各10 μL，依法測(cè)定峰面積，計(jì)算各批樣品的人參皂苷Rb1與黃芪甲苷含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　10批樣品含量測(cè)定結(jié)果

3　討論

3.1超聲時(shí)間的確定在含量測(cè)定中，本試驗(yàn)采用超聲提取法制備供試品溶液，考察超聲時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)色譜峰的影響。結(jié)果超聲10 min的樣品色譜峰強(qiáng)度較小，而超聲20 min和30 min無(wú)明顯差異，因此，本實(shí)驗(yàn)選用超聲提取20 min。

3.2流動(dòng)相的選擇在含量測(cè)定中，考察了以乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水為流動(dòng)相對(duì)人參皂苷Rb1和黃芪甲苷分離度的影響。結(jié)果表明，選用甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水為流動(dòng)相時(shí)色譜峰分離度不高，而選擇乙腈-水溶液作為流動(dòng)相，各色譜峰分離度高且色譜峰基線平穩(wěn)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用乙腈-水溶液作為流動(dòng)相。

3.3梯度洗脫本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取法制備供試品溶液，超聲提取所得的供試品成分復(fù)雜，選用梯度洗脫能使人參皂苷Rb1和黃芪甲苷兩個(gè)化合物峰型好，出峰時(shí)間早，分離度高。

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基金項(xiàng)目：科技部十二五科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAI26B03)

作者簡(jiǎn)介：黃依鳴(1994-)，女，碩士研究生

通信作者：桂雙英，guishy0520@126.com

[中圖分類號(hào)]R283[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.04.020

(收稿日期：2015-08-28；編輯：張倩)

A Preliminary Study of Quality Control of Peiyuan Granule

HUANGYi-ming1,LIWan-rong1,2,WANGJian1,2,GUIShuang-ying1,2,3

(1.AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.KeyLaboratoryofXin’anMedicine,MinistryofEducation,AnhuiHefei230012,China; 3.InstituteofPharmaceutics,AnhuiAcademyofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a quality standard for Peiyuan Granule. MethodsThe qualitative identification of Panax ginseng, Astragalus membranaceus, and Herba Epimedii in Peiyuan Granule was performed by thin-layer chromatography (TLC), and the content of ginsenoside Rb1 and astragaloside in Peiyuan Granule was determined by high-performance liquid chromatography-evaporative light-scattering detection. The analysis was carried out on a Phenomenex-C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with a mobile phase of acetonitrile-water for gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min and a column temperature of 30 ℃. The evaporative light-scattering detector was used at a drift tube temperature of 100 ℃ and an atomizing temperature of 30 ℃. ResultsThe TLC spots of Panax ginseng, Astragalus membranaceus, and Herba Epimedii were clear without interference from the negative control. A good linear relationship with peak area was achieved when the concentrations of ginsenoside Rb1 and astragaloside ranged within 2.46-20.5 μg/mL and 1.54-7.69 μg/mL, and the average recovery rates were 96.84% and 97.58%, respectively, with relative standard deviations of 1.15% and 1.34%. ConclusionThe established method is simple and repeatable to effectively control the quality of Peiyuan Granule.

[Key words]Peiyuan Granule; Quality standard; Thin-layer chromatography; High-performance liquid chromatography