正交試驗(yàn)優(yōu)化霍山米斛總多糖提取工藝

姚　亮，彭代銀，俞年軍，汪新宇，王飄飄，陳衛(wèi)東，何祥林

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)　安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究所，安徽 合肥　230012；2.安徽霍山長(zhǎng)沖中藥材開發(fā)有限公司，安徽 霍山　237266)

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正交試驗(yàn)優(yōu)化霍山米斛總多糖提取工藝

姚亮1，彭代銀1，俞年軍1，汪新宇1，王飄飄1，陳衛(wèi)東1，何祥林2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究所，安徽 合肥230012；2.安徽霍山長(zhǎng)沖中藥材開發(fā)有限公司，安徽 霍山237266)

[摘要]目的建立霍山米斛總多糖的最佳提取工藝。方法依據(jù)2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》第一部中鐵皮石斛多糖測(cè)定方法，通過(guò)單因素考察及正交試驗(yàn)研究提取溫度、提取次數(shù)、提取時(shí)間、料液比對(duì)霍山米斛總多糖提取率的影響，采用苯酚-硫酸法測(cè)定其多糖含量。結(jié)果霍山米斛的最佳提取工藝為：提取溫度為100 ℃，提取2次，每次提取2 h，料液比為1∶800(g/mL)。結(jié)論所優(yōu)選的工藝簡(jiǎn)單、方便、準(zhǔn)確，適用于霍山米斛總多糖的提取。

[關(guān)鍵詞]霍山米斛；總多糖；正交試驗(yàn)；工藝優(yōu)化

霍山米斛(DendrobiumhuoshanenseenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)俗稱米斛，為蘭科石斛屬多年生草本植物，作為安徽省珍稀、名貴、道地中草藥，產(chǎn)于大別山區(qū)安徽霍山等地?；羯矫柞哂幸婢珡?qiáng)陰、生津止渴、補(bǔ)虛羸、除胃中虛火之功效?，F(xiàn)有的石斛種類繁多，不同石斛類的總多糖的組成存在差異，不能以相同方法評(píng)價(jià)不同石斛中總多糖含量。在霍山米斛主要成分中，大家普遍以總多糖含量的高低來(lái)評(píng)價(jià)霍山米斛的優(yōu)劣。現(xiàn)有研究中，黃森等[1]采用Box-Behnken法優(yōu)化提取霍山米斛活性多糖，張煒玲等[2]和秦霞等[3]采用響應(yīng)面法優(yōu)化霍山米斛多糖提取工藝，魏明等[4]采用超聲波協(xié)同纖維素酶法提取霍山米斛多糖。以上關(guān)于霍山米斛多糖的提取方法比較繁瑣，還要進(jìn)行多糖的純化，工藝復(fù)雜，要求較高，不適合在霍山縣當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)村推廣。所以，本研究參照《中華人民共和國(guó)藥典》中鐵皮石斛總多糖的提取方法[5]，系統(tǒng)地制定簡(jiǎn)便、易行的方法來(lái)提取霍山米斛的總多糖，采用正交試驗(yàn)方法優(yōu)化霍山米斛總多糖的提取工藝，為霍山米斛的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1　材料

1.1儀器紫外分光光度計(jì)：UV-1600 上海美譜達(dá)儀器有限公司；LC-4016型低速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；AB135-S型十萬(wàn)分之一天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；BCD-225CHC冰箱：安徽省合肥美菱股份有限公司；KQ-300B型超聲波清洗器：江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；雙層鐵皮電爐：上海日用電爐廠；Milli-Q Gradient A10超純水系統(tǒng)：密理博(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2試藥霍山米斛于2015年12月采自安徽省霍山縣太平畈鄉(xiāng)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥系俞年軍教授鑒定為DendrobiumhuoshanenseenseC. Z. Tang et S. J. Cheng。無(wú)水葡萄糖(分析級(jí))、苯酚(分析級(jí))、硫酸(分析級(jí))批號(hào)分別為20150807、20150603、20141221。其他試劑均為分析級(jí)，實(shí)驗(yàn)用水均由Milli-Q超純水機(jī)制備。

2　方法與結(jié)果

2.1霍山米斛中總多糖含量的測(cè)定

2.1.1總多糖含量的測(cè)定精密量取供試品溶液1 mL，置10 mL具塞試管中，精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，再精密加硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出，置冰浴中冷卻5 min，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法[5]，在488 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無(wú)水葡萄糖含量，計(jì)算，即得?？偠嗵翘崛÷?總多糖質(zhì)量/原藥材干品質(zhì)量×100%。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成90 μg/mL的溶液，即得。

2.1.3供試品溶液的制備取本品粉末(過(guò)3號(hào)篩)約0.12 g，精密稱定，加水80 mL，加熱回流2 h，放冷，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2 mL，置15 mL離心管中，精密加入無(wú)水乙醇10 mL，搖勻，冷藏1 h，取出，離心20 min，棄去上清液(必要時(shí)濾過(guò))，沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8 mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.4檢測(cè)波長(zhǎng)選擇分別對(duì)未顯色霍山米斛總多糖溶液、未顯色標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液、經(jīng)苯酚-硫酸法顯色后的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液、經(jīng)苯酚-硫酸法顯色后的霍山米斛總多糖溶液，空白溶液在400～800 nm范圍內(nèi)掃描，測(cè)定吸收光譜，見圖1。參照《中華人民共和國(guó)藥典》最終確定最佳吸收波長(zhǎng)為488 nm。

圖1 未顯色霍山米斛總多糖溶液(A)、未顯色標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(B)、顯色后的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(C)、顯色后的霍山米斛總多糖溶液(D)和空白溶液(E)的紫外掃描圖(波長(zhǎng)400～800nm)

2.1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置10 mL具塞試管中，各加水補(bǔ)至1.0 mL，精密加入5%苯酚溶液l mL(臨用配制)，搖勻，再精密加硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出，置冰浴中冷卻5 min，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法[5]，在488 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度(A)對(duì)葡萄糖濃度(c)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程為：A=0.008 81c+ 0.112 52(R2=0.999 04)。結(jié)果表明，葡萄糖濃度在9.106～91.060 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性范圍良好。

2.1.6精密度試驗(yàn)按標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的范圍內(nèi)，精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液6份，各1 mL，按照“2.1.1”項(xiàng)下操作測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD為2.5%，小于4%，表明精密度良好，符合方法學(xué)的要求。

2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的范圍內(nèi)，精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下制備的供試品1 mL，分別于0、10、20、30、40、50、60 min按照“2.1.1”項(xiàng)下操作測(cè)定吸光度，計(jì)算其RSD為0.88%，小于4%，表明穩(wěn)定性良好，符合方法學(xué)要求。

2.1.8重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取霍山米斛樣品6份，約0.12 g，按“2.1.3”項(xiàng)下制備供試品，按照“2.1.1”項(xiàng)下操作測(cè)定含量，計(jì)算RSD為0.80%，小于4%，表明重復(fù)性良好，符合方法學(xué)要求。

2.1.9回收率試驗(yàn)取已知含量的霍山米斛粉末100 mg，精密稱定，共6份，按“2.1.3”項(xiàng)下制備的供試品，精密移取1 mL，再加入葡萄糖對(duì)照品溶液，含量為25 μg，濃縮定容到1 mL，按照“2.1.1”項(xiàng)下操作測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率的范圍為88.87%～98.01%，平均加樣回收率為93.32%，符合方法學(xué)要求。見表1。

表1　加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2霍山米斛提取工藝考察

2.2.1提取溫度試驗(yàn)每次取霍山米斛粉末(過(guò)三號(hào)篩)適量，精密稱定，使料液比為1∶667(g/mL)，加熱回流2 h，提取1次，分別考察在溫度70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃下總多糖提取率。見表2。結(jié)果顯示，在提取溫度70～100 ℃范圍內(nèi)，多糖提取率隨著提取溫度的升高而升高，在100 ℃處有最大值，所以單因素考察最佳提取溫度為100 ℃。

表2　提取溫度對(duì)霍山米斛總多糖提取率的影響(n=6)

2.2.2提取時(shí)間試驗(yàn)每次取霍山米斛粉末(過(guò)3號(hào)篩)適量，精密稱定，使料液比為1∶667(g/mL)，在100 ℃下加熱回流，提取1次條件下，分別考察在1、2、3、4 h提取時(shí)間下總多糖提取率。見表3。

表3　提取時(shí)間對(duì)霍山米斛總多糖提取率的影響(n=6)

結(jié)果顯示，提取時(shí)間在2 h之內(nèi)，多糖提取率隨著提取時(shí)間的增加而顯著增加；提取時(shí)間在2 h之后，多糖提取率反而隨著提取時(shí)間的增加而減少;在提取時(shí)間為2 h時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大值。所以單因素考察最佳提取時(shí)間為2 h。

2.2.3料液比試驗(yàn)每次取霍山米斛粉末(過(guò)3號(hào)篩)適量，精密稱定，在100 ℃下加熱回流，提取1次條件下，分別考察料液比為1∶1 000(g/mL)、1∶800(g/mL)、1∶667(g/mL)、1∶571(g/mL)條件下總多糖提取率。見表4。

表4　料液比對(duì)霍山米斛總多糖提取率的影響(n=6)

結(jié)果顯示，當(dāng)料液比為1∶1 000(g/mL)、1∶800(g/mL)、1∶667(g/mL)時(shí)，霍山米斛粉末浸潤(rùn)比較充分，隨著霍山米斛粉末增加，多糖提取率逐漸下降，當(dāng)料液比為1∶571(g/mL)時(shí)，總多糖提取率下降最快，可能是由于在2 h內(nèi)，霍山米斛粉末中浸出的霍山米斛總多糖達(dá)到最大值?？紤]到總多糖的量便于測(cè)定，為減少誤差，最終選擇1∶800(g/mL)、1∶667(g/mL)、1∶571(g/mL)作為料液比的水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.4提取次數(shù)試驗(yàn)每次取霍山米斛粉末(過(guò)3號(hào)篩)適量，精密稱定，使料液比為1∶667(g/mL)，在100 ℃下加熱回流2 h，分別考察在提取1次、2次、3次、4次條件下總多糖提取率。見表5。

表5　提取次數(shù)對(duì)霍山米斛總多糖提取率的影響(n=6)

結(jié)果顯示，多糖提取率隨著提取次數(shù)的增加而增加，在提取次數(shù)大于2次時(shí)，多糖提取率增加比較緩慢，可能是霍山米斛中總多糖的量已經(jīng)接近提取完全，考慮到能源的消耗和產(chǎn)率的關(guān)系，在正交表中，最終選擇提取1、2、3次作為水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.5正交試驗(yàn)依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以影響因素較大的料液比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)為因素，選用L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而得到霍山米斛總多糖加熱回流提取的最優(yōu)條件。見表6。

表6　正交試驗(yàn)因素水平表

2.2.6正交試驗(yàn)結(jié)果由直觀分析可得，影響霍山米斛總多糖提取率的因素從高至低依次是D、C、A、B，最佳工藝的組合為A1B3C2D3。以均方最小的B因素為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示D因素對(duì)霍山米斛多糖提取工藝具有顯著性影響，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際與成本考慮，選擇提取的最優(yōu)組合為A1B3C2D2，即料液比為1∶800(g/mL)，提取溫度為100 ℃，提取時(shí)間為2 h，提取次數(shù)為2次。見表7、表8。

表7　正交試驗(yàn)結(jié)果

表8　正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果

注：F0.05(2,2)=19。

2.2.7驗(yàn)證試驗(yàn)依照最優(yōu)條件提取霍山米斛總多糖，并重復(fù)平行3次加熱回流提取實(shí)驗(yàn)，計(jì)算最優(yōu)條件下回流提取得到的霍山米斛總多糖的提取率。結(jié)果從100.31、100.21、100.06 mg的霍山米斛粉末測(cè)得的米斛總多糖提取率分別為35.88%、36.23%、35.91%，平均提取率為36.01%，表明最佳提取工藝合理、可靠、可行。

3　討論

多聚糖簡(jiǎn)稱為多糖，常有100個(gè)以上甚至幾千個(gè)單糖基通過(guò)糖苷鍵連接而成。其性質(zhì)隨單糖數(shù)目的增多，差別也越來(lái)越大。研究[6]表明，植物多糖具有多種藥理活性，具有增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老、降低血糖、降低血脂等作用[6]。作為安徽道地藥材，霍山米斛多糖的藥理活性已被大量證實(shí)?；羯矫柞鳛榘不栈羯娇h的支柱產(chǎn)業(yè)，在評(píng)價(jià)其優(yōu)劣時(shí)多以石斛中總多糖的含量為指標(biāo)進(jìn)行考察?，F(xiàn)在多糖提取方法主要有堿提取法、酸提取法，超濾法、超臨界流體萃取技術(shù)、水提醇沉法等[7-13]，大量研究旨在提高霍山米斛的多糖提取率，其提取工藝越來(lái)越復(fù)雜，儀器越來(lái)越特殊，不適合推廣，所以本研究選擇經(jīng)典的加熱回流法來(lái)提取霍山米斛的總多糖。

本研究發(fā)現(xiàn)，影響霍山米斛總多糖提取率的因素從大到小依次是提取次數(shù)、提取時(shí)間、料液比、提取溫度，綜合其他影響因素，得出最佳的提取工藝，即提取溫度為100 ℃，提取2次，每次提取2 h，料液比為1∶800(g/mL)。

霍山米斛經(jīng)過(guò)加熱回流法提取，最后采用苯酚-硫酸法測(cè)定霍山米斛中總多糖含量。該方法具有簡(jiǎn)單、易行的特點(diǎn)，適用于霍山米斛質(zhì)量的評(píng)價(jià)。

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作者簡(jiǎn)介：姚亮(1990-)，男，碩士研究生

通信作者：彭代銀，pengdy@ahtcm.edu.cn

[中圖分類號(hào)]R284.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.04.023

基金項(xiàng)目：安徽省科技廳2015年公益性技術(shù)應(yīng)用研究聯(lián)動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目(1501ld04006)；安徽高?？蒲袆?chuàng)新平臺(tái)團(tuán)隊(duì)等項(xiàng)目(皖教秘科〔2015〕49號(hào))；安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目(皖教科〔2013〕2號(hào))

(收稿日期：2016-04-12；編輯：姚實(shí)林)

Optimization of Extraction Process for Total Polysaccharides fromDendrobiumhuoshanenseby Orthogonal Test

YAOLiang1,PENGDai-yin1,YUNian-jun1,WANGXin-yu1,WANGPiao-piao1,CHENWei-dong1,HEXiang-lin2

(1.AnhuiUniversityofChineseMedicine&InstituteofTraditionalChineseMedicineResourcesProtectionandDevelopment,AnhuiAcademyofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.HuoshanChangchongChineseMedicineDevelopmentCo.,Ltd.,AnhuiHuoshan237266,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the optimal extraction process for total polysaccharides from Dendrobium huoshanense. MethodsBased on the determination of polysaccharides in Dendrobium officinale in the 2015 edition of Pharmacopoeia of The People’s Republic of China, the single-factor study and orthogonal test were performed to investigate the influence of extraction temperature, times of extraction, extraction duration, and solid/liquid ratio on the extraction rate of total polysaccharides from Dendrobium huoshanense. The phenol-sulfuric acid method was used to measure the content of polysaccharides. ResultsThe optimal extraction process was an extraction temperature of 100 ℃, two times of extraction, a duration of 2 hours for each extraction, and a solid/liquid ratio of 1∶800 (g/mL). ConclusionThis process is simple, convenient, accurate, and applicable to the extraction of total polysaccharides from Dendrobium huoshanense.

[Key words]Dendrobium huoshanense; Total polysaccharides; Orthogonal test; Process optimization