石河子地區(qū)奶牛乳房炎大腸埃希菌的分離鑒定及耐藥性分析

張　倩，劉功成，屈勇剛*，趙　毅，楊亞東，楊　蓓，王欣雨 ，王園園

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003;2.陜西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,陜西西安 710016)

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獸醫(yī)臨床

石河子地區(qū)奶牛乳房炎大腸埃希菌的分離鑒定及耐藥性分析

張倩1，劉功成1，屈勇剛1*，趙毅2，楊亞東1，楊蓓1，王欣雨1，王園園1

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003;2.陜西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,陜西西安 710016)

摘要：為了解引起新疆石河子地區(qū)規(guī)模化牛場奶牛乳房炎大腸埃希菌的流行情況及其耐藥性，對(duì)石河子地區(qū)部分奶牛場采集85份臨床型或隱性乳房炎奶樣進(jìn)行大腸埃希菌的分離、鑒定及耐藥性試驗(yàn)。結(jié)果表明，從85份奶樣中分離到127株細(xì)菌，其中大腸埃希菌27株，占21.26%。耐藥性試驗(yàn)結(jié)果顯示，27株大腸埃希菌全部對(duì)桿菌肽耐藥，66%以上對(duì)青霉素、復(fù)方新諾明、紅霉素耐藥，80%以上對(duì)丁胺卡那霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢曲松、頭孢哌酮5種藥物敏感。調(diào)查結(jié)果為本地區(qū)奶牛乳房炎的防控提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：奶牛乳房炎；大腸埃希菌；分離鑒定；耐藥性

奶牛乳房炎主要是由多種非特定的病原微生物所引起，是奶牛的常見病和多發(fā)病，也是影響奶牛業(yè)發(fā)展及其經(jīng)濟(jì)效益的主要疾病之一。奶牛乳房炎的發(fā)生除因病原微生物感染外，還與各地區(qū)氣候環(huán)境、畜舍環(huán)境、管理措施、奶牛自身及遺傳因素等有關(guān)[1]。據(jù)報(bào)道，美國、日本的奶牛隱性乳房炎檢出率每年分別達(dá)50%和45%，而我國奶牛隱性乳房炎檢出率高達(dá)50%～70%[2]。大腸埃希菌為引起奶牛乳房炎比較常見的病原菌之一，它不僅感染乳房腺體，還會(huì)造成奶牛乳腺組織的損傷或破壞，減少產(chǎn)奶量，甚至?xí)斐扇閰^(qū)泌乳功能的喪失，變成瞎奶區(qū)，使奶牛提前淘汰，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。又因乳房炎治療中抗生素的長期使用致使病原菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，從而給奶牛乳房炎的治療帶來困難[4]。因此，及時(shí)準(zhǔn)確地掌握引起不同地區(qū)奶牛乳房炎大腸埃希菌的流行情況及耐藥情況，是有效治療奶牛乳房炎的關(guān)鍵措施[5-6]。本試驗(yàn)通過對(duì)新疆石河子地區(qū)的奶牛乳房炎大腸埃希菌的分離、鑒定及耐藥性分析，為進(jìn)一步選用有效的抗生素進(jìn)行治療提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1奶樣臨床型乳房炎和隱性乳房炎的奶樣采自石河子周邊5個(gè)不同規(guī)模、不同管理水平的奶牛場。采樣時(shí)，先對(duì)乳頭進(jìn)行消毒，棄掉前5 mL～10 mL牛乳后無菌取乳樣5 mL左右，冰袋冷藏保存，于24 h內(nèi)送檢。

1.1.2主要試劑及培養(yǎng)基氯化鈉(NaCl)、酵母浸粉、牛肉浸粉、檸檬酸鈉、蛋白胨、胰蛋白胨、磷酸二氫銨、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、硫代硫酸鈉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、酚紅、美藍(lán)、伊紅Y、溴麝香草酚藍(lán)，北京澳博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；普通營養(yǎng)瓊脂(LB)培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂(TSI) 培養(yǎng)基、生化鑒定培養(yǎng)基(尿素、甲基紅(MR)、吲哚、VP、枸櫞酸鹽、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇培養(yǎng)基)、6%α-萘酚-乙醇溶液、歐-波試劑均由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室常規(guī)配制；麥康凱培養(yǎng)基(MAC)，北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.1.3藥敏紙片18種抗菌藥物紙片均為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品，即β-內(nèi)酰胺類5種：青霉素(PG)、頭孢曲松(CTRX)、頭孢氨芐(CL)、氨芐西林(AMP)和頭孢哌酮(SCF)；氨基糖苷類4種：卡那霉素(K)、慶大毒素(CN)、阿米卡星(AMK)和新霉素(N)；喹諾酮類2種：恩諾沙星(ENR)和氧氟沙星(OFM)；酰胺醇類2種：氯霉素(C)和氟苯尼考(FFC)；多肽類1種：桿菌肽 (B)；大環(huán)內(nèi)酯類1種：紅霉素(EM)；四環(huán)素類1種：強(qiáng)力霉素(DO)；化學(xué)合成類2種：復(fù)方新諾明(SXT)和呋喃唑酮(F)。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌的富集、分離與純化將采集的85份奶樣首先進(jìn)行病原菌的富集，對(duì)85份奶樣編號(hào)，每份奶樣各取100 μL于相應(yīng)編號(hào)的液體LB中進(jìn)行12 h的搖床培養(yǎng)，然后劃線接種到LB培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，挑取形狀、大小疑似大腸埃希菌的菌落劃線培養(yǎng)于MAC培養(yǎng)基，挑取典型的疑似大腸埃希菌紅色菌落涂片，革蘭染色，鏡檢，觀察菌體的形態(tài)，再次接種到EMB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后于LB培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)。

1.2.2生化鑒定待檢細(xì)菌分離純培養(yǎng)后，桿菌分別接種于三糖鐵、尿素、甲基紅、吲哚、VP、枸櫞酸鹽、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇培養(yǎng)基中， 37℃培養(yǎng)觀察結(jié)果。

1.2.2.1三糖鐵試驗(yàn)用接種環(huán)挑取少許細(xì)菌接種于已制好的三糖鐵斜面培養(yǎng)基中，接種時(shí)先涂布斜面,后穿刺底層,置37℃恒溫箱培養(yǎng)12 h～24 h,觀察其反應(yīng)情況。產(chǎn)酸則培養(yǎng)基變黃；產(chǎn)酸產(chǎn)氣則培養(yǎng)基變黃且有氣泡；產(chǎn)H2S則培養(yǎng)基底部變黑。

1.2.2.2尿素分解試驗(yàn)將待檢細(xì)菌接種到尿素斜面瓊脂試管中，同時(shí)作劃線及穿刺接種，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，尿素分解試驗(yàn)陽性者由于產(chǎn)堿而使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色(+)；陰性者繼續(xù)觀察4 d仍不變色者為陰性(-)。

1.2.2.3甲基紅試驗(yàn)接種細(xì)菌于培養(yǎng)液中，37℃恒溫培養(yǎng)2 d～5 d，滴加甲基紅試劑1滴，立即觀察結(jié)果。鮮紅色為陽性(+)，黃色為陰性(-)。

1.2.2.4吲哚試驗(yàn)挑取小量培養(yǎng)物接種，在37℃培養(yǎng)1 d～2 d，必要時(shí)可培養(yǎng)4 d～5 d。加入歐-波試劑約0.5 mL，沿管壁流下，覆蓋于培養(yǎng)液表面，陽性者于液面接觸處呈玫瑰紅色(+)。

1.2.2.5VP試驗(yàn) 將細(xì)菌接種于本培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)2 d～4 d。加入6% α萘酚乙醇溶液0.5 mL和400 g/L氫氧化鉀溶液0.2 mL，充分振搖試管，觀察結(jié)果。陽性反應(yīng)立刻或于數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色(+)，如為陰性(-)，則應(yīng)放在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)過夜再進(jìn)行觀察。

1.2.2.6枸櫞酸鹽試驗(yàn)將少量被檢細(xì)菌接種到枸櫞酸鹽固體斜面培養(yǎng)基上37℃恒溫培養(yǎng)2 d～4 d，每天觀察結(jié)果。陽性者斜面上有菌落生長，培養(yǎng)基從綠色轉(zhuǎn)為藍(lán)色(+)。不能利用枸櫞酸鹽的細(xì)菌不能生長,培養(yǎng)基不變色為陰性(-)。

1.2.2.7糖(醇)發(fā)酵(分解)試驗(yàn)用接種環(huán)取少量被檢細(xì)菌穿刺接種于糖發(fā)酵半固體斜面培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)2 d～3 d后觀察結(jié)果。無變化培養(yǎng)基仍為藍(lán)色(-)；產(chǎn)酸培養(yǎng)基變黃(+)；產(chǎn)酸又產(chǎn)氣培養(yǎng)基變黃并有氣泡(⊕)。

1.2.3分子生物學(xué)鑒定

1.2.3.1引物合成參照文獻(xiàn)[7]合成大腸埃希菌16 S RNA特異引物，基因序列由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，引物序列為：5′-GAGTGGCGGACGGGTGAGTA-3′，5′-GGCTGCTGGCACGGAGTTAG-3′。

1.2.3.2目的基因的PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20 μL：ddH2O 8 μL，Mix混合物8 μL，模板(菌液)2 μL，上游引物(25 pmol/μL)1 μL，下游引物(25 pmol/μL)1 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min;94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10 min。

1.2.3.3目的條帶電泳觀察取 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 10 μL，于穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀上進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，恒壓120V，以 DNAMarker DL 2 000 作為參照，于凝膠成像儀上觀查并拍照。

1.2.4耐藥性試驗(yàn)將純培養(yǎng)的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)8 h后用移液器吸取100 μL于LB瓊脂平板上，用涂布器涂抹均勻靜置數(shù)分鐘使菌液吸收，在無菌條件下將藥敏紙片以梅花型貼于平板上，置于37℃溫箱培養(yǎng)12 h～48 h，觀察并測(cè)量抑菌圈大小。

2　結(jié)果

2.1菌株的分離與鑒定

菌株在麥康凱上形成紅色、圓形、光滑、邊緣白色成云霧狀的菌落(圖1)，革蘭染色鏡檢，可見革蘭陰性、紅色、兩端鈍圓的短桿狀菌，并在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上形成金屬光澤的菌落，結(jié)果從采集的85份奶樣中分離到27株疑似大腸埃希菌。

2.2生化試驗(yàn)結(jié)果

分離出的大腸埃希菌均能在三糖鐵斜面上產(chǎn)氣產(chǎn)酸但不產(chǎn)H2S且不分解尿素，大多數(shù)菌株分解乳糖和葡萄糖(圖2)，發(fā)酵麥芽糖和甘露醇，吲哚和甲基紅試驗(yàn)為陽性(圖3、圖4)，VP和枸櫞酸鹽試驗(yàn)為陰性(圖5)。

2.3分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

對(duì)初步鑒定的大腸埃希菌以37℃過夜培養(yǎng)的菌液為模板進(jìn)行16 S RNA的PCR鑒定，結(jié)果如圖6,分離到的27株大腸埃希菌均擴(kuò)增出了427 bp的特異性目的條帶，均表現(xiàn)為16 S RNA的PCR陽性，證實(shí)這些菌株為大腸埃希菌。

圖1　麥康凱培養(yǎng)基上菌株生長情況

⊕代表產(chǎn)酸又產(chǎn)氣；+代表產(chǎn)酸；-代表陰性⊕means producing acid and gas; + means producing acid; - means negative

圖2葡萄糖分解情況

Fig.2Decomposition of glucose

+代表陽性；-代表陰性

+ means positive; - means negative

圖3甲基紅試驗(yàn)鑒定結(jié)果

Fig.3The results of methyl red test

+代表陽性；-代表陰性

+代表陽性；-代表陰性

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～17.待檢菌株

M.DNA Marker DL 2000; 1-17.Strains to be tested

圖616 S RNA PCR鑒定結(jié)果

Fig.6PCR identification results of 16 S RNA

2.4藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，從石河子地區(qū)分離得到的27株大腸埃希菌對(duì)每種抗菌藥的耐藥性差異很大，從0～100%；對(duì)桿菌肽、青霉素、紅霉素高度耐藥，其中27株菌對(duì)桿菌肽的耐藥率達(dá)到100%，對(duì)青霉素、紅霉素的耐藥率分別達(dá)到92.59%和81.48%，而分離菌株對(duì)頭孢曲松、頭孢哌酮、阿米卡星、恩諾沙星、氟苯尼考這5種藥物的敏感率均在81.40%以上;除此之外,也有一些菌株對(duì)強(qiáng)力霉素表現(xiàn)為既不耐受也不敏感(表1)。

3　討論

本試驗(yàn)從采集的85份奶樣中分離出127株細(xì)菌，通過形態(tài)學(xué)觀察、生化特性分析及分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，最終確定分離得到27株大腸埃希菌，占21.26%，說明引起奶牛乳房炎的病原菌并非單一菌而是由多種病原菌引起的，其中金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌為主要致病菌[8]，且大腸埃希菌屬于環(huán)境性病原微生物，由此可知由于地理環(huán)境及飼養(yǎng)管理的不同,引起奶牛乳房炎大腸埃希菌的流行情況及其耐藥性有所差異[9-10].及時(shí)掌握各地區(qū)奶牛乳房炎大腸埃希菌的流行情況及其對(duì)抗生素的敏感性，對(duì)預(yù)防及治療奶牛乳房炎極其關(guān)鍵。

本試驗(yàn)通過石河子地區(qū)奶牛乳房炎大腸埃希菌對(duì)18種抗菌藥物的敏感性進(jìn)行分析，結(jié)果表明大腸埃希菌對(duì)臨床上使用的抗菌藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，尤其是對(duì)桿菌肽、青霉素、紅霉素的耐藥率可達(dá)80%以上；對(duì)頭孢曲松、頭孢哌酮、恩諾沙星、氟苯尼考、阿米卡星的敏感率可達(dá)80%以上。與許丹丹[11]和王禮偉等[12]對(duì)石河子地區(qū)奶牛乳房炎大腸埃希菌的耐藥性分析結(jié)果相似，但與吳亞文等[13]對(duì)寧夏地區(qū)奶牛乳房炎大腸埃希菌的耐藥性分析差異較大。

表1　18種抗菌藥物對(duì)27株大腸埃希菌藥敏結(jié)果

隨著國家農(nóng)業(yè)“十三五”的規(guī)劃要求，如何發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)，如何加強(qiáng)食品安全保障，成為畜牧獸醫(yī)工作者不得不思考的問題。鑒于現(xiàn)階段奶牛乳房炎給畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)危害，抗生素治療帶來的副作用，以及病原菌的交叉感染，在用藥時(shí)可以選擇敏感性藥物，采取聯(lián)合用藥、輪換用藥的方法。同時(shí)，還可以采取其他的治療方法和用藥途徑，如細(xì)胞因子療法[14]、溶霉素療法[15]、中藥膜劑[16]、中西結(jié)合[17]、噬菌體療法等[18]新型綠色環(huán)保防治途徑，這是防治奶牛乳房炎新的發(fā)展趨勢(shì)。對(duì)本地區(qū)奶牛乳房炎的防治除關(guān)注治療的新方法、新動(dòng)態(tài)之外，還應(yīng)做到以下幾點(diǎn)：①提高飼養(yǎng)管理水平，做好牛舍的衛(wèi)牛清理，改善擠奶技術(shù)；②奶牛日糧中合理添加提高機(jī)體免疫力的微量元素和維生素等；③用藥時(shí)要按泌乳期和干乳期分別用藥，合理制定用藥方案等。只有從生物環(huán)境、飼養(yǎng)管理及疫病預(yù)防多個(gè)角度進(jìn)行防治，才能減少該病的發(fā)病率。

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收稿日期：2016-01-09

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560699)；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2015AG012)；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2013AB002)

作者簡介：張倩(1990-)，女，河北保定人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病診斷與防治研究。*通訊作者

中圖分類號(hào):S852.612;S857.26

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B

文章編號(hào):1007-5038(2016)07-0115-05

Isolation,Identification and Antimicrobial Resistance ofE.coliIsolated from Dairy Cows with Mastitis in Shihezi

ZHANG Qian1,LIU Gong-cheng1,QU Yong-gang1,ZHAO Yi2,YANG Ya-dong1,YANG Bei1,WANG Xin-yu1,WANG Yuan-yuan1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xingjiang，832003,China；2.ShaanxiCentreforAnimalDiseaseControlandPrevention，Xi'an，Shaanxi，710016,China)

Abstract:To investigate the prevalence of E.coli causing mastitis and its antimicrobial resistance in scaled dairy cow farms of Shihezi,Xinjiang,E.coli were isolated,molecular and biochemical identification were made from 85 clinical or subclinical mastitis milk samples collected from some dairy farms in Shihezi,antimicrobial resistances of E.coli were also analyzed.Among the 85 samples,there are 127 strains of bacteria,including 27 strains of E.coli,accounting for 21.26%.Antimicrobial resistance test results showed that 27 strains of E.coli are all resistant to bacitracin,and more than 66% resistant to penicillin,cotrimoxazole,erythromycin,more than 80% are sensitive to amikacin,enrofloxacin,florfenicol,ceftriaxone and cefoperazone.The survey provided theoretical basis for prevention and treatment of dairy cow mastitis.

Key words:dairy cow mastitis; E.coli; isolation and identification; antibiotic resistance