新疆昭蘇縣馬梨形蟲(chóng)的檢測(cè)及傳播媒介蜱的鑒定

圖爾蓀·薩迪爾，李　佳，王振寶，宋瑞其，巴音查汗*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆阿克蘇地區(qū)動(dòng)物疫病控制診斷中心，新疆阿克蘇 843000；3.新疆伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆伊寧 835000)

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新疆昭蘇縣馬梨形蟲(chóng)的檢測(cè)及傳播媒介蜱的鑒定

圖爾蓀·薩迪爾1，李佳2，王振寶3，宋瑞其1，巴音查汗1*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆阿克蘇地區(qū)動(dòng)物疫病控制診斷中心，新疆阿克蘇 843000；3.新疆伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆伊寧 835000)

摘要：為了解新疆昭蘇縣馬感染梨形蟲(chóng)情況及傳播媒介蜱的種類(lèi)，采用寄生蟲(chóng)病病原常規(guī)檢查方法、分子生物學(xué)技術(shù)和血清學(xué)檢測(cè)方法對(duì)200匹馬進(jìn)行馬梨形蟲(chóng)的檢測(cè)，對(duì)320只傳播媒介蜱進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。結(jié)果顯示，血液涂片染色鏡檢紅細(xì)胞染蟲(chóng)率為9.23%，PCR、cELISA對(duì)駑巴貝斯蟲(chóng)的檢出率分別為28%和23.5%，對(duì)泰勒蟲(chóng)的檢出率分別為36%和34%；對(duì)馬體表和周邊環(huán)境采集的320只蜱蟲(chóng)鑒定為草原革蜱和森林革蜱2種。本研究為該地區(qū)馬梨形蟲(chóng)病的防控提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：馬；泰勒蟲(chóng)；駑巴貝斯蟲(chóng)；蜱；鑒定

馬梨形蟲(chóng)病是馬駑巴貝斯蟲(chóng)或馬泰勒蟲(chóng)所引起的馬屬動(dòng)物的一種血液原蟲(chóng)病，臨床特點(diǎn)是急性溶血性貧血、黃疸、厭食，偶爾出現(xiàn)腹痛、便秘、腹瀉等消化道癥狀[1-9]。據(jù)報(bào)道馬梨形蟲(chóng)也可經(jīng)胎盤(pán)感染，導(dǎo)致母馬流產(chǎn)或胎兒感染，但這種情況少見(jiàn)[10]。

在馬梨形蟲(chóng)病流行的一些地區(qū)和國(guó)家，新出生的馬駒通過(guò)初乳得到的母源抗體從而具有抗感染能力。馬感染梨形蟲(chóng)主要通過(guò)在攜帶病原蜱蟲(chóng)大量茲生的區(qū)域放牧而感染，攜帶病原的蜱蟲(chóng)在叮咬馬匹吸血時(shí)，病原體通過(guò)蜱的唾液腺進(jìn)入馬匹體內(nèi)而感染馬。馬梨形蟲(chóng)病有明顯的季節(jié)性， 一般發(fā)病率高，如不及時(shí)治療，很快就死亡[11]。因此，本研究通過(guò)采用寄生蟲(chóng)病病原常規(guī)檢查方法、分子生物學(xué)技術(shù)和血清學(xué)檢測(cè)方法對(duì)昭蘇縣馬梨形蟲(chóng)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)傳播媒介硬蜱進(jìn)行鑒定。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品2015年6月至2015年11月在昭蘇縣采集了馬抗凝血和血清各200份，蜱蟲(chóng)共320只。

1.1.2主要儀器和材料PCR儀、 Gel Doc2000紫外凝膠成像系，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；電子顯微鏡、Blood Genome DNA Exraction Kit，上海TaKaRa公司產(chǎn)品；馬駑巴貝斯蟲(chóng)和馬泰勒蟲(chóng)cELISA診斷試劑盒，美國(guó)VMRD公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為P140327-001和P140326-001。

1.2方法

1.2.1血液涂片染色鏡檢采血，滴于載玻片的一端，推制成血片，并使晾干。滴甲醇2滴～3滴于血膜上，使其固定，然后用瑞特-姬姆薩復(fù)合染料染色，晾干后鏡檢。

1.2.2馬梨形蟲(chóng)的PCR檢測(cè)按照Blood Genome DNA Exraction Kit的說(shuō)明書(shū)對(duì)200份馬抗凝血提取DNA，引物參考已發(fā)表的泰勒蟲(chóng)18 S RNA和駑巴貝斯蟲(chóng)BC-48基因序列[12]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

BC-48-F：5′-GCGACGTGACTAAGACCTTA- TTGG-3′；BC-48-R：5′-GTTCTCAATGTCAGT- AGCATCCGC-3′；TE-18S-F：5′-TTTGGGCTGT- TTACAGTTGC-3′；TE-18S-R： 5′-CTCAAAGTAAACGTCGAGTCATG-3′。

以提取的馬全血DNA為模板，用PCR方法進(jìn)行馬泰勒蟲(chóng)和駑巴貝斯蟲(chóng)病的檢測(cè)。

1.2.3馬梨形蟲(chóng)抗體檢測(cè)按照馬cELISA試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)對(duì)分離的馬血清進(jìn)行馬梨形蟲(chóng)病抗體的檢測(cè)，測(cè)量各孔的吸光度值，并計(jì)算平均值，判定結(jié)果。檢測(cè)有效性：0.300<陰性O(shè)D值<2.00，有效；陰性判定：當(dāng)0.300<樣品OD值<2.00時(shí)，馬駑巴貝斯、馬泰勒蟲(chóng)均為陰性；陽(yáng)性判定：當(dāng)樣品OD值<標(biāo)準(zhǔn)陰性平均值時(shí)，馬駑巴貝斯、馬泰勒蟲(chóng)均為陽(yáng)性。

1.2.4體表蜱蟲(chóng)的鑒定

1.2.4.1蜱蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)初步鑒定對(duì)所采集的蜱蟲(chóng)進(jìn)行清洗處理，肉眼從外觀特征上初步分類(lèi)，其中一部分用750 mL/L的酒精固定，一部分在解剖鏡下觀察鑒定，一部分制成玻片標(biāo)本分類(lèi)鑒定。

1.2.4.2蜱蟲(chóng)的顯微結(jié)構(gòu)鑒定蜱蟲(chóng)玻片標(biāo)本制作方法：先將蜱用100 g/L的NaOH水溶液煮沸數(shù)分鐘(大的蟲(chóng)體，需用昆蟲(chóng)針在蟲(chóng)體上刺個(gè)小洞)，直至蟲(chóng)體軟化透明即可，然后將蟲(chóng)體放入清水中洗去堿液。洗凈后的蟲(chóng)體依次經(jīng)過(guò)300、500、700、900、1000 mL/L的酒精和1∶1的無(wú)水酒精二甲苯及純二甲苯各1 h，然后用樹(shù)膠封片。對(duì)已干涸的標(biāo)本要先洗潤(rùn)，再放入NaOH液中浸泡，然后脫水透明，最后在鏡下進(jìn)行鑒定。在解剖鏡下依照屬和種的檢索表對(duì)采集的蜱進(jìn)行鑒定及分類(lèi)。借助解剖鏡觀察蜱蟲(chóng)的假頭基、基突、須肢、盾板、側(cè)溝、生殖孔、足基節(jié)、足轉(zhuǎn)節(jié)、肛溝和氣門(mén)板等形態(tài)學(xué)特征。1.2.4.3蜱蟲(chóng)的超微結(jié)構(gòu)鑒定將活蜱用熱水燙死后立即放于25 mL/L戊二醛溶液中，在4℃下固定2 d。用pH 7.2磷酸緩沖液換洗3次，然后用不同濃度的酒精逐級(jí)脫水，再用真空干燥儀干燥，最后用導(dǎo)電膠將標(biāo)本固定在樣品臺(tái)上，進(jìn)行噴金，掃描電鏡下觀察蜱蟲(chóng)的形態(tài)。

2　結(jié)果

2.1血液涂片染色鏡檢結(jié)果

對(duì)昭蘇縣200份馬血液進(jìn)行血液涂片鏡檢。一般馬駑巴貝斯蟲(chóng)蟲(chóng)體長(zhǎng)度大于紅細(xì)胞半徑，且呈尖端連成銳角，而馬泰勒蟲(chóng)蟲(chóng)體長(zhǎng)度小于紅細(xì)胞半徑。

經(jīng)鏡檢檢測(cè)出了馬泰勒蟲(chóng)和馬駑巴貝斯蟲(chóng)，紅細(xì)胞染蟲(chóng)率為9.23%(圖1)。

圖1　血液圖片鏡檢結(jié)果

2.2PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)提取的200份核酸樣品采用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示馬駑巴貝斯蟲(chóng)和馬泰勒蟲(chóng)感染率分別為28%和36%，混合感染率為16%(表1)。

取適量PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示馬努巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性條帶為452 bp，馬泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性條帶為142 bp。電泳結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。

表1　昭蘇縣馬梨形蟲(chóng)感染率

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000；1.陽(yáng)性對(duì)照；2.陰性對(duì)照；3～24.樣品

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000；1.陽(yáng)性對(duì)照；2.陰性對(duì)照；3～24.樣品

2.3cELISA檢測(cè)結(jié)果

cELISA檢測(cè)顯示，馬駑巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性率為23.5%，馬泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性率為34.0%,樣品結(jié)果如表2。

表2　cELISA檢測(cè)結(jié)果

2.4體表蜱蟲(chóng)鑒定結(jié)果

2.4.1蜱蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)初步鑒定結(jié)果共采集鑒定昭蘇縣馬匹體表蜱蟲(chóng)共320只，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定初步鑒定為草原革蜱和森林革蜱2種，屬于硬蜱科革蜱屬，其中232只為雌蜱，88只為雄蜱，未吸血的190只。

2.4.1.1草原革蜱雌蜱基突很短或不明顯，假頭基矩形；孔區(qū)較大，卵圓形，向外斜置，間距小于其短徑。氣門(mén)板橢圓形。足基節(jié)Ⅳ外距末端不超過(guò)或平齊于該節(jié)后側(cè)緣。雄蟲(chóng)體卵圓形；基突寬短；假頭基呈矩形，須肢寬短，足基節(jié)Ⅳ向后方顯著伸長(zhǎng)，其外距不超過(guò)該節(jié)后側(cè)緣，足轉(zhuǎn)節(jié)Ⅰ背距短，末端圓鈍，氣門(mén)板背突較直而短，見(jiàn)圖4。

2.4.1.2森林革蜱雌蜱孔區(qū)較大呈卵圓形；假頭基呈矩形，須肢第3節(jié)背面近似三角形，前端向外斜置。氣門(mén)板背突窄短，末端圓凸；基節(jié)Ⅳ外距末端超出該節(jié)后緣，足基節(jié)Ⅰ內(nèi)距很寬，外距逐漸細(xì)窄，外距比內(nèi)距稍長(zhǎng)或等長(zhǎng)。雄蜱須肢粗短，假頭基呈矩形，寬稍大于長(zhǎng)，足基節(jié)Ⅳ外距明顯，末端超出該節(jié)后緣，足轉(zhuǎn)節(jié)I背距呈三角形，末端尖細(xì)。氣門(mén)板逗點(diǎn)形，背突末端伸達(dá)盾板邊緣，見(jiàn)圖5。

2.4.2蜱蟲(chóng)的顯微結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

2.4.2.1草原革蜱超微結(jié)構(gòu)雌蜱假頭基矩形，后緣平直，基突很短；孔區(qū)較大，卵圓形，向外斜置；間距小于其短徑，生殖孔有翼狀突；氣門(mén)板橢圓形；足基節(jié)Ⅳ外距末端不超過(guò)或平齊于該節(jié)后側(cè)緣。雄蜱假頭基呈矩形，須肢寬短；氣門(mén)板逗點(diǎn)形，背突較直而短，末端不到盾板邊緣；腹面內(nèi)側(cè)緣第1節(jié)有剛毛，第2節(jié)無(wú)剛毛；足基節(jié)Ⅳ向后方顯著伸長(zhǎng)，其外距不超過(guò)該節(jié)后側(cè)緣，足轉(zhuǎn)節(jié)Ⅰ背距短，末端圓鈍，詳見(jiàn)圖6。

2.4.2.2森林革蜱超微結(jié)構(gòu)雌蜱假頭基矩形，后緣平直，基突短而鈍，孔區(qū)大呈卵圓形，向外斜置，孔區(qū)內(nèi)剛毛數(shù)量也為1根，位于孔區(qū)內(nèi)側(cè)中部，氣門(mén)板背突窄短，末端圓凸；第1 對(duì)足基節(jié)的外距短于內(nèi)距，生殖孔的翼狀突很明顯，呈“V”形，第4 對(duì)足基節(jié)外距超出該節(jié)后側(cè)緣，雄蜱假頭基呈矩形，寬稍大于長(zhǎng)，氣門(mén)板逗點(diǎn)形，背突窄短，見(jiàn)圖7。

3　討論

昭蘇作為一個(gè)養(yǎng)馬大縣，在國(guó)家的相關(guān)政策扶持下馬產(chǎn)業(yè)蒸蒸日上，逐漸由最初的交通運(yùn)輸、農(nóng)耕役用和軍馬的傳統(tǒng)馬業(yè)轉(zhuǎn)變?yōu)榧荣?、馬術(shù)、旅游娛樂(lè)和食用為一體的現(xiàn)代馬產(chǎn)業(yè)[13]。昭蘇縣的氣候、植被等生態(tài)條件非常適宜馬匹生長(zhǎng)、繁衍，可謂是“牧馬的天堂”。由于馬屬動(dòng)物是多種寄生蟲(chóng)的自然宿主，飼養(yǎng)管理過(guò)程中常因蟲(chóng)體的寄生造成宿主生長(zhǎng)發(fā)育受阻、被毛雜亂、精神委靡靡等一系列慢性病癥，嚴(yán)重時(shí)可致死，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。寄生蟲(chóng)病的地方性流行成為現(xiàn)階段嚴(yán)重困擾新疆馬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一。

調(diào)查結(jié)果顯示，血涂片紅細(xì)胞染蟲(chóng)率為9.23%，PCR、cELISA等對(duì)駑巴貝斯蟲(chóng)的檢出率分別為28%和23.5%，對(duì)泰勒蟲(chóng)的檢出率分別為36%和34%。血液涂片雖然方便直觀，多用于急性病例檢測(cè)，但其主觀性大；cELISA多用于檢測(cè)抗體，該方法雖然快速有效，適合高通量檢測(cè)，但是對(duì)于病畜感染還不能有效界定； PCR法檢測(cè)病原精準(zhǔn)而快捷，因此PCR方法檢測(cè)出的數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確。根據(jù)調(diào)查結(jié)果可知該地區(qū)馬梨形蟲(chóng)的感染情況較嚴(yán)重，會(huì)影響當(dāng)?shù)伛R養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，應(yīng)引起有關(guān)部門(mén)的重視。為降低該病的發(fā)生率，應(yīng)積極采取藥物防控措施，以便有效降低馬匹感染該病，同時(shí)也提高人們對(duì)蜱傳疾病的認(rèn)識(shí)，做好防治蜱蟲(chóng)的工作對(duì)預(yù)防血液原蟲(chóng)病的發(fā)生，此次流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果為當(dāng)?shù)胤乐悟鐐骷膊√峁┝丝茖W(xué)依據(jù)。

A.♀背面；B.♂背面；C.♀基節(jié)Ⅳ內(nèi)外距；D.♂氣門(mén)板

A.♀背面； B.♂背面； C.♂腹面； D.♂氣門(mén)板

A.口下板齒式(100×)；B.生殖孔(40×)；C.基節(jié)Ⅳ外距(100×)；D.基節(jié)Ⅳ內(nèi)距(100×)；E.♂氣門(mén)板；F.孔區(qū)剛毛(100×)

A.Hypostomal dentition formula(100×)；B.Gonopore(40×)；C.Coxal Ⅳof external spur(100×)；D.Coxal Ⅳof internal spur(100×)；E.♂Spiracular plate；F.Porose areal setae(100×)

圖6草原革蜱超微結(jié)構(gòu)

Fig.6Ultrastructure ofD.nuttalli

A.基節(jié)Ⅳ外距(40×)； B.♀氣門(mén)板(40×)；C.生殖孔(40×)；D.孔區(qū)剛毛(100×)；E.口下板齒式(100×)

A.External spur of coxa Ⅳ(40×)；B.♀Spiracular plate(40×)；C.Gonopore(40×)；D.Porose areal setae(100×)；E.Hypostomal dentition formula(100×)

圖7森林革蜱超微結(jié)構(gòu)

Fig.7Ultrastructure ofD.silvarum

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收稿日期：2016-01-15

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合培養(yǎng)研究生示范基地聯(lián)合培養(yǎng)研究生項(xiàng)目(xjaucxy-yjs-20151017);國(guó)家自然基金委-新疆聯(lián)合基金項(xiàng)目(U1403282)

作者簡(jiǎn)介：圖爾蓀·薩迪爾(1989-)，男(維吾爾族)，新疆克州人，碩士研究生，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者

中圖分類(lèi)號(hào):S852.723

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1007-5038(2016)07-0044-05

Detection of Equine Piroplasma and Identification of Vector Ticks in Zhaosu County of Xinjiang

TUERSUN·Sadier1，LI Jia2，WANG Zhen-bao3，SONG Rui-qi1，Bayinchahan1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi，Xinjiang，830052，China；2.AksuCenterforAnimalDiseaseControl，Aksu，Xinjiang， 843000，China；3.YiliEntry-exitInspectionandQuarantineBureau，Yining，Xinjiang，835000，China)

Abstract:In order to understand the infection situation of equine piroplasma and spread of vector tick species in Zhaosu county of Xinjiang,the blood smear routine inspection method,molecular biology technology and serological detection method were used to detect 200 horses and 320 vector ticks.The results showed that the infective rate of erythrocytes is 9.23%.Babesia caballi detection rates by PCR and cELISA are respectively 28% and 23.5%.Theileria detection rates are respectively 36% and 34%.The 320 ticks collected from horses and surrounding environment were identified as D.nuttalli and D.silvarum.This study provided scientific basis for the prevention of the equine piroplasmosis in the area.

Key words:horse; Theileria equi; Babesia caballi; tick; identification