鐵調(diào)素抗乙型肝炎病毒活性的初步研究

王兆飛 管世鶴 陳禮文 楊凱 張浩 候舒文 潘正蘭 段元麗 王秀

摘要：目的 初步探究鐵調(diào)素抗乙型肝炎病毒（HBV）活性。方法 使用鐵調(diào)素處理pcDNA1.3轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞及pSM2轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞，檢測并分析不同時間點(diǎn)鐵調(diào)素處理組與未處理組之間培養(yǎng)上清液中HBV-DNA、HBeAg水平的差異。結(jié)果 與未處理組比較，pcDNA1.3轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞鐵調(diào)素處理組HBV DNA水平顯著降低（P<0.05），pSM2轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞鐵調(diào)素處理組HBV DNA水平顯著降低（P<0.05）。與未處理組比較，pcDNA1.3轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞鐵調(diào)素處理組HBeAg表達(dá)顯著降低（P<0.05），pSM2轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞鐵調(diào)素處理組HBeAg表達(dá)顯著降低（P<0.05）。結(jié)論 通過研究我們初步證明了鐵調(diào)素具有一定的抑制HBV復(fù)制的活性。

關(guān)鍵詞：肝炎病毒，乙型;鐵調(diào)素;HepG2細(xì)胞;Huh7細(xì)胞

鐵調(diào)素（Hepcidin）是一種由肝臟合成并分泌富含半胱氨酸的生物活性多肽，由于鐵調(diào)素在體外研究過程中表現(xiàn)出明顯的抗菌活性屬于高度保守的防御性多肽，作為一種陽離子抗菌多肽鐵調(diào)素也被稱為肝臟抗菌多肽（LEAP-1）。鐵調(diào)素除在維持鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用外還具有一定的抗菌活性，既往對鐵調(diào)素的抗菌活性研究中我們發(fā)現(xiàn)，鐵調(diào)素通過限制細(xì)胞外鐵得獲得，一些細(xì)胞以這種“營養(yǎng)免疫”的形式對抗細(xì)菌感染。近期另一些研究提出，鐵調(diào)素具有不依賴于以往“營養(yǎng)免疫”的形式而獨(dú)立影響免疫應(yīng)答的作用[1]。然而在目前沒有體內(nèi)研究結(jié)論支持的情況下，一些研究報(bào)道鐵調(diào)素可能通過一種尚未被充分了解的機(jī)制抑制炎性細(xì)胞因子。然而鐵調(diào)素在宿主防御中具有獨(dú)立作用都僅是推測性的結(jié)論。近期有學(xué)者報(bào)道體內(nèi)常量鐵調(diào)素未能表現(xiàn)出顯著的免疫學(xué)活性，而高濃度鐵調(diào)素（濃度為體內(nèi)常量的數(shù)十倍）在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出一定的免疫學(xué)活性[2，3]。并有研究報(bào)道體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中高濃度鐵調(diào)素可以抑制HCV/HIV病毒復(fù)制[4]，而鐵調(diào)素能否同樣影響HBV的復(fù)制仍未有提及。為此，本課題通過探究高濃度鐵調(diào)素對HBV病毒復(fù)制的影響，從而明確應(yīng)用鐵調(diào)素治療慢性乙型病毒性肝炎的臨床價(jià)值。

1 研究對象與方法

1.1 儀器與試劑 低溫高速離心機(jī);超低溫冰箱;HBV-DNA病毒定量檢測試劑盒（批號：20180512 R1）;雅培全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（i2000SR）;

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染? 以含有100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM對HepG2細(xì)胞、Huh7細(xì)胞（上海富亨細(xì)胞庫）在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整每孔細(xì)胞數(shù)約為1×106。取具備乙型肝炎病毒全基因組的pC1.3質(zhì)粒（pSM2）1.8 μg，混合脂質(zhì)載體（Thermo Scientific，USA）2μL，靜置20 min，轉(zhuǎn)染接種于6孔板24 h，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到80%融合;在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)定12h、24h、48h取細(xì)胞上清液。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。應(yīng)用 Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)對定量資料進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，應(yīng)用Spearman相關(guān)分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 鐵調(diào)素處理組與未處理不同時間點(diǎn)HBV DNA水平的比較

與未處理組比較，pcDNA1.3轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞鐵調(diào)素處理組在12h時即出現(xiàn)HBV DNA水平的下降，在處理48h時HBV DNA水平顯著降低（P<0.05）如圖2A所示。

與未處理組比較，pSM2轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞鐵調(diào)素處理組在24h時即出現(xiàn)HBV DNA水平的下降，在處理48h時HBV DNA水平顯著降低（P<0.05）如圖2B所示。

2.2 鐵調(diào)素處理組與未處理不同時間點(diǎn)HBeAg水平的比較

與未處理組比較，pcDNA1.3轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞鐵調(diào)素處理組在24h時即出現(xiàn)HBeAg表達(dá)的下降，在處理48h時HBeAg表達(dá)顯著降低（P<0.05）如圖3A所示。

與未處理組比較，pSM2轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞HBeAg鐵調(diào)素處理組在24h時即出現(xiàn)HBeAg表達(dá)的下降，在處理48h時HBeAg表達(dá)顯著降低（P<0.05）如圖3B所示。

4 討論

據(jù)既往研究報(bào)道鐵調(diào)素在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著的抗菌活性，并且鐵調(diào)素的抗菌活性與它的生理活性相關(guān)，具體機(jī)制為鐵調(diào)素通過降鐵作用導(dǎo)致體內(nèi)鐵元素的低水平，低鐵環(huán)境使得細(xì)菌生長繁殖受到這種“鐵營養(yǎng)”缺乏的影響，表現(xiàn)出抑制細(xì)菌生長繁殖的活性。所以最初鐵調(diào)素抗菌活性正是依靠這種營養(yǎng)性免疫的形式實(shí)現(xiàn)的。所以在感染性疾病中鐵調(diào)素扮演的角色仍存在爭議。近期研究發(fā)現(xiàn)鐵調(diào)素在HCV及HIV感染過程中表達(dá)受到顯著抑制，在體外實(shí)驗(yàn)中鐵調(diào)素可以抑制Huh7細(xì)胞中HCV病毒的復(fù)制[5]，此外在HIV感染的過程中鐵調(diào)素的早期表達(dá)對于隨后的病毒載量有著密切聯(lián)系，但是這種相關(guān)機(jī)制尚未明確。于是我們對鐵調(diào)素影響HBV復(fù)制進(jìn)行了初步研究。

我們通過模擬HBV感染肝細(xì)胞對肝炎、肝癌體外細(xì)胞系進(jìn)行HBV病毒質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，并以高濃度的鐵調(diào)素加以處理，通過定時測定培養(yǎng)上清液HBeAg、HBV DNA表達(dá)水平來了解鐵調(diào)素對HBV復(fù)制的影響，本研究發(fā)現(xiàn)在鐵調(diào)素的作用下HBV的復(fù)制受到顯著抑制。結(jié)合國內(nèi)外的研究我們對鐵調(diào)素抑制HBV復(fù)制的具體機(jī)制進(jìn)行了推測，據(jù)國外學(xué)者對鐵調(diào)素抗HCV活性研究的過程中發(fā)現(xiàn)，鐵調(diào)素的抗病毒活性可能與其對肝細(xì)胞內(nèi)抗病毒狀態(tài)的影響相關(guān)。在鐵調(diào)素處理的肝細(xì)胞中IFN的表達(dá)不是定向的，但是在鐵調(diào)素的作用下肝細(xì)胞中一些IFN誘導(dǎo)基因的表達(dá)顯著上調(diào)，如OAS1和IFIT1（ISG56）。其中已知的IFIT1是影響細(xì)胞內(nèi)抗病毒狀態(tài)中的重要蛋白質(zhì)，而鐵調(diào)素刺激上調(diào)的IFIT1可能直接參與了鐵調(diào)素介導(dǎo)的抗病毒作用。另外，高水平鐵調(diào)素可直接導(dǎo)致體內(nèi)的低鐵環(huán)境，并通過這種營養(yǎng)限制的方式導(dǎo)致病毒在胞內(nèi)的復(fù)制繁殖過程受阻，從而表現(xiàn)出對病毒復(fù)制抑制效應(yīng)。以上兩點(diǎn)皆是我們對鐵調(diào)素抗HBV活性具體機(jī)制的推測，然而由于鐵調(diào)素對機(jī)體免疫反應(yīng)的復(fù)雜作用，所以這種抗HBV活性的具體機(jī)制需要進(jìn)一步探究。我們的研究初步證明了鐵調(diào)素具有一定的抑制HBV復(fù)制的活性，也進(jìn)一步佐證了應(yīng)用鐵調(diào)素對于治療慢性乙型病毒肝炎的臨床價(jià)值。

基金：安徽省科技廳重點(diǎn)研究與開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（1804h08020236）;安徽省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2018A0206）;安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院首批“火花計(jì)劃”科研項(xiàng)目（2015hhjh06）

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作者簡介：

王兆飛，男，碩士研究生;單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，合肥230601

管世鶴，男，教授，主任技師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，合肥230601，E-mail：shiheguan@126.com。