金線蓮莖段組織培養(yǎng)技術的研究

陸素君

摘要：利用組織培養(yǎng)培技術對金線蓮莖段組培苗進行研究試驗。結果表明：以金線蓮莖段為外植體，用0.1%升汞溶液消毒10min效果比較好，殺傷力小，容易獲得無菌材料，消毒之前剝開葉柄基部鞘狀抱莖消毒效果好；芽增殖培養(yǎng)基用MS+糖30g·L^-1+瓊脂粉4.5g·L^-1+馬鈴薯汁10g·L^-1+激素以6-BA3.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1有利于金線蓮的增殖與生長；在生根階段以1/2MS+糖30g·L^-1+瓊脂粉4.5g·L^-1+馬鈴薯汁10g·L^-1+活性炭0.5g·L^-1+NAA1.Omg·L^-1效果最理想，生根率達95%，根系發(fā)達，葉子展開墨綠色；種植理想的基質為泥炭土：椰糠：細沙=5：3：2，種植成活率高達97%，幼苗生長旺盛。

關鍵詞：金線蓮莖段；組織培養(yǎng)；快速繁殖

中圖分類號：S567.23+9 文獻標識碼：A 文章編號：1004-3020（2016）03-0023-04

金線蓮Anoectochilus formosanus蘭科Or-chidaceae開唇蘭屬Anoectochilus多年生草本植物。別名金線蘭、金絲草、樹草蓮、金線仔草、金線虎頭蕉、金線入骨消等。在民間具有廣泛藥用價值，素有“藥王”、“金草”、“神草”、“鳥人參”等美稱。營養(yǎng)成份中氨基酸和微量元素兩者的含量均高于國產西洋參和野山參；它們與牛磺酸、多糖類成分具有營養(yǎng)、抗衰老、養(yǎng)肝護肝、調節(jié)人體機體免疫的作用。分布在福建、臺灣、廣東、廣西、海南、四川、貴州、云南等亞熱帶及熱帶。金線蓮性喜陰涼、潮濕，尤其喜歡生長在有常綠闊葉樹木的溝邊、石壁、土質松散的潮濕地帶，要求溫度20～32℃，光照約為正常日照的1/3，最忌陽光直射。由于金線蓮在自然界的蘊藏量已很稀少，因此，人工種植金線蓮有利于保護瀕危藥用植物的生存與繁殖。對金線蓮進行莖段組培育苗快速繁殖及種植的研究，為金線蓮組培育苗工廠化生產提供參考依據。

1 試驗材料來源

外植體誘導試驗材料采用廣西壯族自治區(qū)博白縣那林鎮(zhèn)林區(qū)的野生金線蓮。誘導獲得無菌材料后開展培養(yǎng)基調試。

2 試驗方法

2.1 外植體誘導

將采回來的金線蓮外植體在自來水下沖洗去表面的灰塵，用剪刀把外植體葉子部分按兩種剪法處理：一種是只剪葉子，未剝掉葉柄基部鞘狀莖；另一種是全部剝掉葉柄基本鞘狀莖。然后分別從上至下分成三節(jié)莖段，每段必需帶1～2個節(jié)眼，用去離子水漂洗3～4次。置于超凈臺上，在無菌的條件下，用75%的乙醇進行表面消毒10，用無菌水漂洗4～5次，然后0.1%升汞溶液分別消毒5，10，15min不斷攪拌。用無菌水漂洗4～5次，剪掉莖段及葉柄處被藥物損傷的部分，接種于起動培養(yǎng)基上，每一消毒處理接種40支試管，每支接種1個芽。

2.2 生產培養(yǎng)基調試

2.2.1 基本培養(yǎng)基選擇

用無菌的組培瓶苗作轉接材料，分別以MS，N6，B5三種培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加：6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1+糖30g·L^-1+瓊脂粉6g·L^-1+馬鈴薯汁10g·L^-1，每一培養(yǎng)基接種10瓶，接種50d觀察生長情況。

2.2.2 不同激素配比對金線蓮組培苗增殖的影響

選擇上述試驗表現(xiàn)最好的培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基，添加不同比例的激素配比，6-BA分別為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mg·L^-1，NAA為0.5mg·L^-1，培養(yǎng)基中添加糖30g·L^-1+瓊脂粉6g·L^-1+馬鈴薯汁10g·L^-1，每一激素配比接種10瓶，每次接種后50d觀察芽分化情況。

2.2.3 不同生長素對金線蓮生根的影響

選擇上述試驗表現(xiàn)最好的培養(yǎng)基分別以全大量、1/2大量為生根基本培養(yǎng)基，分別添加IBA、NAA、IBA+NAA3種激素處理，每一處理分別設計0.5，1.0，2.0mg·L^-13個水平，添加糖30g·L^-1+瓊脂粉6g·L-1+馬鈴薯汁10g·L^-1+活性炭0.5g·L^-1，每一培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶插苗10株。接種50d后檢查生根情況及根系的發(fā)達情況。

2.2.4 不同的添加物對金線蓮組培苗的影響

選擇上述試驗金線蓮生根表現(xiàn)最好的培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加物分別為對照0g·L^-1；香蕉10g·L^-1、20g·L^-1；馬鈴薯10g·L^-1、20g·L^-1，觀察瓶苗生長情況。

2.2.5 培養(yǎng)條件

以上每一試驗均重復3次，所用培養(yǎng)基pH值為5.5。培養(yǎng)基消毒滅菌為恒溫121℃，恒壓1.1個大氣壓，時間15min。培養(yǎng)條件為自然光照，溫度為25±1℃，濕度70%～80%。

2.3 組培苗種植

①泥炭土；②泥炭土：椰糠：細沙=5：3：2用0.5%的高錳酸鉀溶液消毒備用。將生根的小苗搬到培養(yǎng)室外，煉苗3～5d，使其適應外界環(huán)境。種植時用鑷子輕輕夾出生根苗，用清水將培養(yǎng)基洗干凈，移栽到消毒好的基質，淋足定根水。種植后注意保持基質濕潤，注意遮陽，一般透光率為30%左右。一星期后可噴0.1%磷酸二氫鉀溶液葉面肥，連續(xù)噴灑4次。以后可淋30%的沼氣水。病蟲害防治可用多菌靈、托布津等殺菌劑1000倍液進行防治。

3 試驗結果分析

3.1 修剪處理及消毒時間對金線蓮外植體的影響

從表1可以看出：金線蓮外植體葉柄基部鞘狀抱莖對消毒效果影響非常大，未剝掉葉柄基部鞘狀抱莖用0.1%升汞溶液消毒515的獲得率為零，全部污染。而經過全剝掉葉柄基部鞘狀莖消毒效果會好一些，同是用0.1%升汞溶液消毒10第二段枝條的獲得率達37.5%。從試驗中還觀察到污染的材料主要是霉菌，這與金線蓮生長在陰暗潮濕的環(huán)境以及它的葉柄基部鞘狀抱莖有關。

3.2 基本培養(yǎng)基對金線蓮生長的影響

從試驗結果觀察到三種基本培養(yǎng)對金線蓮組培育苗有明顯的作用，效果依次為MS>B5>N6。MS培養(yǎng)基能使苗木抽高達6.1cm，增殖倍數有3.0，芽分化正常，節(jié)間正常，葉子展開。后面以MS為基本培養(yǎng)基進行相關的試驗。

3.3 不同激素配比對金線蓮組瓶苗增殖的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加6=BA：0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mg·L^-1，NAA為0.5mg·L^-1，試驗觀察到NAA的用量不變，隨著6-BA的濃度增高，金線蓮的芽增殖倍數增高，在6-BA為3.0mg·L^-1時效果最佳，增殖倍數達6.6，節(jié)間正常，葉子展開（見圖1）。但6-BA上升到4.0mg·L^-1時，芽增殖倍數變化不大，葉子出現(xiàn)了卷曲及水漬狀，節(jié)抽得變長。

3.4 不同生長素對金線蓮生根的影響

試驗以全量MS、1/2MS培養(yǎng)基為金線蓮生根基本培養(yǎng)基，添加了生長素IBA、NAA、IBA+NAA。從表4結果看出，以1/2MS為生根基本培養(yǎng)基，單獨添加生長素NAA效果理想，以濃度為1.0mg·L^-1效果最佳，生根率達100%，根系發(fā)達，葉子展開墨綠色，苗長得快，50d平均高度有6.1cm，根系長2.8cm，有利于種植（見圖2）。

3.5 不同的添加物對金線蓮的影響

從表5可以看出：添加香蕉汁、馬鈴薯汁對金線蓮組培苗生根起到很大的作用，不加有添加物的對照組苗木生根率低，根系短，葉子紅，而加有馬鈴薯汁的最好，用量在10～20g·L^-1都可以，根系發(fā)達，生根率達到100%，葉子墨綠色，葉脈明顯。

3.6 不同的基質對金線蓮苗木生長的影響

金線蓮喜陰濕肥沃的生長環(huán)境，根據此特性在種植上用兩種配比的基質進行種植。從表6可以看出：泥炭土：椰糠：細沙=5：3：2的配方有利于金線蓮組培苗的生長，此配方基質疏松透氣，種植成活率高達97%，幼苗生長旺盛。純泥炭土的配方容易積水板結，不利于幼苗的生長。

4 結論與討論

（1）金線蓮莖段外植體消毒用0.1%升汞溶液消毒10min效果比較好，殺傷力小，容易獲得無菌材料。消毒之前要剝開葉柄基部鞘狀抱莖，可以提高消毒效果。

（2）金線蓮組培育苗繼代培養(yǎng)基用MS+糖30g·L^-1+瓊脂粉4.5g·L^-1+馬鈴薯汁10g·L^-1為基本培養(yǎng)基，激素組合6-BA3.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1和6-BAl.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1都有利于金線蓮的增殖與生長，在生產中可以高低激素互相交換使用效果更加理想。

（3）礦物元素濃度較高時有利于發(fā)展莖葉，而較低時有利于生根。在金線蓮組培育苗生根階段大量元素減半有利于誘導根系的生長，以1/2MS培養(yǎng)基為生根基本培養(yǎng)基，添加糖30g·L^-1、瓊脂粉4.5g·L^-1、馬鈴薯汁10g·L^-1、活性炭0.5g·L^-1，NAA1.0mg·L^-1效果最理想，生根率達100%，根系發(fā)達，葉子展開綠色，苗長得快，50d左右可以進行種植。

（4）在金線蓮生根培養(yǎng)基中添加馬鈴薯汁的用量在10～20g·L^-1都可以，根系發(fā)達，生根率達到95%以上，但從成本上考慮大量生產可以用10g·L^-1。

（5）金線蓮種植理想的基質為：泥炭土：椰糠：細沙=5：3：2。此配方有利于金線蓮組培苗的生長，基質疏松透氣，種植成活率高達97%，幼苗生長旺盛。在種植中選擇陰涼地種植，遮陰度60%～70%，注意水分的保持。

（6）野生金線蓮非常少，我們在采集外植體時注意基因的收集與保護。

（責任編輯：鄭京津）