泥蚶HDAC1基因cDNA全長、內(nèi)含子克隆及時空表達特征分析

任付真，姚韓韓，董迎輝，周小龍，林志華*

(1. 上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；2.浙江萬里學院 生物與環(huán)境學院 浙江省水產(chǎn)種質資源高效利用技術研究重點實驗室，浙江 寧波 315100)

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泥蚶HDAC1基因cDNA全長、內(nèi)含子克隆及時空表達特征分析

任付真1，2，姚韓韓2，董迎輝2，周小龍1，林志華2*

(1. 上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；2.浙江萬里學院 生物與環(huán)境學院 浙江省水產(chǎn)種質資源高效利用技術研究重點實驗室，浙江 寧波 315100)

摘要：HDAC1作為HDACs家族中重要成員，可使組蛋白去乙?；M而調(diào)節(jié)基因表達，在細胞分化和胚胎早期發(fā)育中起重要作用。本文利用SMART RACE技術克隆得到泥蚶HDAC1(Tg-HDAC1)基因的cDNA全長序列，并對其內(nèi)含子進行擴增及不同組織、不同發(fā)育時期的定量表達。結果發(fā)現(xiàn)：Tg-HDAC1基因的cDNA序列全長為2 275 bp，開放閱讀框(ORF)1 587 bp，編碼528個氨基酸；Tg-HDAC1蛋白序列與斑馬魚、雞、小鼠等的相似性都在80%以上，表明該蛋白氨基酸序列在物種進化過程中具有保守性；在Tg-HDAC1基因中擴增出13個內(nèi)含子，均存在于開放閱讀框中，且都遵循GT-AG原則；熒光定量PCR(qRT-PCR)分析結果顯示，Tg-HDAC1基因在成體血液、內(nèi)臟團、外套膜、鰓、斧足和閉殼肌6個組織中均有表達，而在足中的表達量最高，且與其余5組織中的表達量有極顯著差異(P<0.01)，說明它對該組織生長具有重要作用。不同發(fā)育時期的表達差異結果表明，Tg-HDAC1基因在擔輪幼蟲期表達量最高，顯著高于其他發(fā)育時期(P<0.05)。

關鍵詞：泥蚶；組蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)；基因克隆；內(nèi)含子；表達分析

1引言

組蛋白去乙?；?(Histone deacetylase 1， HDAC1)是HDACs家族中重要的一類蛋白酶，在幾乎所有細胞的細胞核中均有表達，對細胞分化和胚胎發(fā)育起重要作用[1]。迄今HDAC1基因已在線蟲(Caenorhabditiselegans)[2]、果蠅(Drosophilamelanogaster)[3]、斑馬魚(Daniorerio)[4]等模式生物中進行了大量研究。在脊椎動物中，Taunton等[5]發(fā)現(xiàn)第一個哺乳動物的組蛋白去乙?；福籗un等[6]純化和鑒定了雞的HDAC1蛋白；Ye等[7]、柳小春等[8]證明HDAC1基因與豬的主要分割性狀及生長、胴體性狀相關。近幾年，有關藏羚羊[9]、鴨[10]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[11]中HDAC1基因結構和功能研究也相繼被報道，而在海洋貝類中未見相關報道。

泥蚶(Tegillarcagranosa)是一種廣溫廣鹽性灘涂貝類，具有獨特的口感風味和較高的營養(yǎng)價值、經(jīng)濟價值，深受江、浙、閩等地沿海居民喜愛。目前，關于泥蚶功能基因的研究主要集中在免疫相關基因的克隆與表達分析上，如小熱休克蛋白基因[12]、血紅蛋白基因[13]、基質金屬蛋白酶組織抑制因子3基因[14]等，而與生長、繁殖等主要經(jīng)濟性狀相關基因報道較少，已見泥蚶生長因子受體結合蛋白2基因[15]與Smad1/5基因[16]的克隆及時空表達研究。本研究首次克隆獲得泥蚶Tg-HDAC1基因的cDNA全長和所有內(nèi)含子序列，并用qRT-PCR技術對其在成貝不同組織、不同發(fā)育時期的表達進行分析，旨在探索HDAC1基因在生長、發(fā)育過程中的調(diào)控作用，為開展泥蚶分子標記輔助育種奠定基礎。

2材料與方法

2.1實驗材料

泥蚶成貝采自寧波甬盛水產(chǎn)種業(yè)有限公司，活體解剖取血液、內(nèi)臟團、外套膜、鰓、足和閉殼肌6個組織，液氮速凍后分裝入凍存管中，置于-80℃超低溫冰箱中保存，用于總RNA、DNA提取。通過親貝催產(chǎn)、人工授精和早期培育，獲得2-4細胞期、囊胚期、原腸胚期、擔輪幼蟲期、D形幼蟲期、殼頂幼蟲期、眼點幼蟲期及稚貝期9個不同發(fā)育時期的樣品，液氮速凍后存于-80℃超低溫冰箱中。

2.2實驗方法

2.2.1Tg-HDAC1基因cDNA全長克隆

用Trizol法提取泥蚶閉殼肌總RNA，NanoVue微量紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度，1.0%瓊脂糖凝膠檢測RNA質量。按照SMARTTMRACE cDNA Amplication Kit(Clontech)說明反轉錄合成RACE cDNA第一條鏈。根據(jù)本實驗室泥蚶454轉錄組文庫注釋信息，初步篩查到Tg-HDAC1基因cDNA部分序列，分別設計5′-RACE和3′-RACE特異性引物GSP1和GSP2(表1)，根據(jù)Advantage 2 Polymerase Kit說明，采用touch down PCR，擴增Tg-HDAC1基因的cDNA全長。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測、割膠純化，純化產(chǎn)物連接到pMD18-T(TaKaRa)載體，并將重組質粒轉化到大腸桿菌DH5α(TaKaRa)中，經(jīng)菌液PCR鑒定后陽性克隆送華大基因公司測序。

2.2.2Tg-HDAC1基因序列及進化分析

測序結果利用NCBI的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對Tg-HDAC1基因編碼的氨基酸進行功能域與結構域的預測，用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)程序搜索開放閱讀框；DNAMAN 軟件進行氨基酸序列、蛋白質基本理化性質預測分析；采用SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預測該蛋白信號肽區(qū)域；NetPhos2.0工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測氨基酸磷酸化位點；ExPASy ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)在線分析蛋白質疏水性；蛋白質跨膜區(qū)用TMHMM 軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)進行預測分析；Swiss Model軟件(http://swissmodel.expasy.org/workspace/)進行蛋白質高級結構預測；據(jù)NCBI上公布的其他物種HDAC1的氨基酸序列，利用ClustalW進行氨基酸多序列比對；用MEGA 6.0軟件中NJ(neighbor joining)法做進化分析。

2.2.3Tg-HDAC1基因內(nèi)含子的克隆

用酚-氯仿法[17]提取6顆泥蚶閉殼肌基因組DNA，據(jù)已獲得Tg-HDAC1基因的mRNA序列，設計特異性的引物(表1)利用Mastercycler ProS 梯 度 PCR 儀進行普通PCR擴增。PCR反應程序為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，Tm45 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。通過PCR產(chǎn)物割膠純化、克隆測序獲取該基因內(nèi)含子的核苷酸序列。

2.2.4Tg-HDAC1基因 mRNA在泥蚶不同組織、不同發(fā)育時期的表達分析

用Trizol法提取泥蚶6個組織(血液、內(nèi)臟團、外套膜、鰓、斧足和閉殼肌，n=3)和9個發(fā)育時期樣品(成熟卵子、2-4細胞、囊胚、原腸胚、擔輪幼蟲、D形幼蟲、殼頂幼蟲、眼點幼蟲及稚貝，n>500)總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA。根據(jù)cDNA 全長序列及內(nèi)含子的位置設計引物REAL-HDAC1-F和REAL-HDAC1-R(表1)，以18sRNA 基因為內(nèi)參，利用ABI 7500Fast進行Tg-HDAC1基因在成貝不同組織定量表達，每個樣本取3個平行檢測。熒光定量PCR反應條件：95℃ 20 s；95℃ 3 s，60℃ 15 s，72℃ 10 s，40個循環(huán)。采用相對值2-ΔΔCt法對該基因的相對表達量進行分析，SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

3結果

3.1Tg-HDAC1基因cDNA序列分析

Tg-HDAC1基因cDNA序列全長為2 275 bp(Genbank登錄號：KP250871 )，其中5′非編碼區(qū)(5′-UTR)26 bp，開放閱讀框(ORF)1 587 bp，編碼528個氨基酸，3′非編碼區(qū)(3′-UTR)662 bp。3′-UTR存在1個終止密碼子TAA，加尾信號AATAAA及polyA尾巴，其中加尾信號AATAAA與polyA尾巴相距246 bp(圖1)。

表1　實驗所用引物匯總

圖1　Tg-HDAC1基因的cDNA全長序列與推導的氨基酸序列Fig.1　The full-length cDNA sequence of HDAC1 gene and deduced amino acid sequence in T.granosa方框區(qū)域分別代表基因的起始密碼子、終止密碼子與加尾信號，*代表蛋白翻譯結束，下劃線部分表示polyA尾巴，灰色陰影部分為HDAC1超家族保守區(qū)域，代表金屬Zn結合位點The letters boxes are the start codon， the stop codon and the polyadenylation signal sequence. The* represents the end of the protein translation，and the underlined part is polyA. The conserved domain is shaded gray， is Zn binding site

圖2　Tg-HDAC1蛋白的高級結構預測圖Fig.2　The prediction of protein tertiary structure of Tg-HDAC1α-螺旋為深紅色；β-折疊為黃色；轉角為淡藍色；其他殘基的顏色為白色Red represents the alpha-helix， yellow represents the beta-sheet， blue represents the turn， other residues is white

DNAMAN軟件分析顯示，Tg-HDAC1蛋白分子量為59.91 kDa，理論等電點pI=5.65；在線軟件SignalP 4.1、TMHMM分析發(fā)現(xiàn)Tg-HDAC1基因編碼的蛋白質無明顯的信號肽區(qū)域和跨膜區(qū)域；ExPASy ProtScale預測顯示組成該蛋白的氨基酸中親水性氨基酸占主導，表現(xiàn)為親水性；軟件預測表明，Tg-HDAC1蛋白包含絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸磷酸化位點個數(shù)分別為25、10、11；NCBI Blast分析序列的功能域和結構域顯示該蛋白包含HDAC保守結構域，并在保守序列含有金屬Zn結合位點。

用Swiss Model軟件預測表明，Tg-HDAC1蛋白由17個α-螺旋和17個β-折疊片組成，β-折疊片基本平行排列(圖2)，此排列方式或許對維持蛋白的穩(wěn)定性具有作用。

3.2Tg-HDAC1基因與其他物種的同源比對及系統(tǒng)進化分析

氨基酸序列比對結果表明，Tg-HDAC1蛋白序列與斑馬魚、雞、小鼠等脊椎動物同源性都在80%以上，表現(xiàn)出高度的保守性(圖3)。用MEGA6.0軟件構建系統(tǒng)進化樹顯示，泥蚶和無脊椎動物紫色球海膽親緣關系最近，其次為頭索動物門文昌魚。人、獼猴、牛、藏羚羊及鼠高等動物聚在一起，再與鳥綱的雞、兩棲綱的非洲爪蟾、魚綱的斑馬魚形成脊椎動物的一大分支(圖4)。

圖3　不同物種HDAC1氨基酸序列比對Fig.3　Amino acid sequence alignment of HDAC1 between T. granosa and other speciesTg：泥蚶；Xl：非洲爪蟾；Sp：紫色球海膽；Mm：小鼠；Bt：牛；Hs：人；Ph：藏羚羊；Gg：雞；Dr：斑馬魚；Ma：獼猴；Rn：褐家鼠；Bf：文昌魚Tg：Tegillarca granosa；Xl：Xenopus laevis；Sp：Strongylocentrotus purpuratus；Mm：Mus musculus；Bt：Bos taurus；Hs：Homo sapiens；Ph：Pantholops hodgsonii；Gg：Gallus gallus；Dr：Danio rerio；Ma：Macaca mulatta；Rn：Rattus norvegicus；Bf： Branchiostoma floridae

HDAC1物種GenBank登錄號HDAC1物種GenBank登錄號泥蚶(Tegillarcagranosa)KP250871小鼠(Musmusculus)AAI08372.1非洲爪蟾(Xenopuslaevis)NP_001079396.1牛(Bostaurus)NP_001032521.1紫色球海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)NP_999711.1人(Homosapiens)CAG46518.1青島文昌魚(Branchiostomafloridae)XP_002594632.1斑馬魚(Daniorerio)AAI65208.1褐家鼠(Rattusnorvegicus)NP_001020580.1雞(Gallusgallus)AAB99850.1藏羚羊(Pantholopshodgsonii)NP_001273520.1獼猴(Macacamulatta)AFJ71458.1

圖4　利用MEGA6.0 NJ法構建的HDAC1系統(tǒng)進化樹Fig.4　Phylogenetic tree of HDAC1 amino acid sequences by NJ method using MEGA6.0 software

圖5　泥蚶不同組織中Tg-HDAC1基因表達差異性分析(n=3)Fig.5　Analysis of expression difference of Tg-HDAC1 gene in different tissues of T. granosa (n=3)1.內(nèi)臟團；2.外套膜；3.閉殼?。?.血液；5.斧足； 6.鰓；**代表差異極顯著(P<0.01)1. Visceral mass; 2.mantle; 3.adductor muscle; 4.blood 5.foot ; 6.gill；** represents very significant differences(P<0.01)

圖6　Tg-HDAC1基因不同發(fā)育時期表達差異性分析Fig.6　Analysis of expression difference of Tg-HDAC1 gene in different developmental stages of T. granosa1.成熟卵子；2.2-4細胞；3.囊胚；4.原腸胚；5.擔輪幼蟲；6.D形幼蟲；7.殼頂幼蟲；8.眼點幼蟲；9.稚貝；不同字母代表差異顯著(P<0.05)1. Mature eggs; 2. 2-4 cells; 3.blastula; 4. Gastrulae; 5. trochophore; 6. D-shaped larva;7. umbo larvae; 8. eyebot larva;9. juvenile clams， different letters represent significant differences， P<0.05

圖7　Tg-HDAC1基因結構圖Fig.7　Genomic DNA structure of Tg-HDAC1 gene外顯子、內(nèi)含子分別用方框和線條標示，E代表外顯子，I代表內(nèi)含子。方框上的數(shù)字代表每個外顯子的堿基數(shù)，線條下方的數(shù)字代表內(nèi)含子的堿基數(shù)The box and the lines represent the exons and introns respectively.The letter E and I indicates the exon and introns. The number on the box and below the line represent the size of each exon and introns

3.3泥蚶不同組織與不同發(fā)育時期Tg-HDAC1表達差異性分析

用qRT-PCR技術檢測了Tg-HDAC1基因在泥蚶6個組織的表達情況。結果顯示，Tg-HDAC1基因在各個組織中均有不同程度的表達，其中斧足中表達量相對最高，與其余各組織間存在極顯著性差異(P<0.01)(圖5)。

Tg-HDAC1基因在泥蚶的9個發(fā)育時期均有不同程度的表達，從成熟卵子呈逐步升高的趨勢，而在原腸胚和擔輪幼蟲時期的表達量最高，顯著高于其他發(fā)育時期(P<0.05)，在眼點幼蟲和稚貝時期表達量顯著性降低(P<0.05)(圖6)。

3.4Tg-HDAC1基因內(nèi)含子序列分析

克隆得到Tg-HDAC1基因的全部內(nèi)含子序列，且外顯子與內(nèi)含子結合處序列遵循-AT/GT-原則，即都屬于GT-AG-內(nèi)含子。Tg-HDAC1基因共有14個外顯子，13個內(nèi)含子，序列總長度為10 499 bp。其中9號外顯子最長為168 bp，13號外顯子最短，為32 bp，其余外顯子長度在72～165 bp之間；1號內(nèi)含子最長，為1 293 bp，12號內(nèi)含子最短，為193 bp，其余內(nèi)含子長度在203～926 bp之間(圖7)。

4討論

組蛋白乙?；饕山M蛋白乙酰化酶(HATs)與組蛋白去乙?；?HDACs)催化完成，與基因表達調(diào)控密切相關[18]。HDACs有4大類18個亞型，目前研究主要集中在HDAC1[19]。本實驗成功獲得Tg-HDAC1 基因的cDNA全長序列，其編碼的氨基酸序列與雞、小鼠等脊椎動物的HDAC1蛋白具有高度同源性，聚類結果也表明，泥蚶與無脊椎動物如紫色球海膽、文昌魚親緣關系較近，與脊椎動物親緣關系較遠，這與系統(tǒng)形態(tài)學上的分類基本一致。NCBI Blastx分析顯示，Tg-HDAC1 蛋白包含HDAC保守結構域，推測該區(qū)域是HDAC1調(diào)控組蛋白去乙?；潭鹊年P鍵區(qū)域[20]。

內(nèi)含子是指斷裂基因中的非編碼區(qū)序列，在編碼蛋白質前被去除。一直以來，研究者們對基因功能的研究主要集中在編碼序列，而對內(nèi)含子序列的研究較少。高通量技術的出現(xiàn)，使得許多物種的基因組序列逐漸呈現(xiàn)，內(nèi)含子序列占基因組序列的絕大部分，且與許多重要功能相關，因此發(fā)現(xiàn)和深入挖掘其與基因功能的相關性就顯得非常必要。近年來，已開展了一些動物內(nèi)含子與性狀的相關性研究，如在豬的脂肪性脂肪酸結合蛋白(A-FABP)基因內(nèi)含子1發(fā)現(xiàn)了與其肉質性狀相關的SNP多態(tài)位點[21]；牛HDAC1基因內(nèi)含子10～11中存在SNP多態(tài)位點與其屠宰性狀相關[22]；鯰魚(Suckermouthcatfishes)生長激素基因內(nèi)含子在物種系統(tǒng)發(fā)育中具有重要作用[23]等。有關海洋貝類內(nèi)含子的研究也有報道，如包永波[24]搜索了海灣扇貝(Argopectenirradias)超氧化物歧化酶(SOD)基因部分內(nèi)含子區(qū)域的SNP位點；郭慧慧[25]克隆并分析了櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)轉化生長因子β家族基因中內(nèi)含子SNP位點與生長性狀的相關性；李璐[26]克隆并分析了合浦珠母貝(Pinctadamartensii)α-淀粉酶基因的內(nèi)含子結構特征。本研究成功克隆得到Tg-HDAC1 8 224 bp內(nèi)含子序列，序列分析表明，所獲得的內(nèi)含子核苷酸序列均符合“以GT開頭，以AG結尾”的規(guī)則，這是真核生物RNA正確剪切所必需的識別位點。在不同物種中，有些基因的內(nèi)含子數(shù)目是高度可變的，如淀粉酶基因在果蠅中沒有內(nèi)含子或數(shù)目極少，但在凡納對蝦(PenaeusvannameiBoone)中卻發(fā)現(xiàn)有9個內(nèi)含子[27]，這可能是在長期物種進化過程中形成的。HDAC1基因內(nèi)含子數(shù)目在不同物種中略有差異，如在人、猴和牛等脊椎動物中包含14個內(nèi)含子，在鼠、非洲爪蟾及斑馬魚等中卻發(fā)現(xiàn)有13個內(nèi)含子，而在泥蚶Tg-HDAC1基因中擴增出13個內(nèi)含子，均存在于開放閱讀框中，與其他物種差異不大。

HDAC1基因在早期胚胎發(fā)育中有重要的調(diào)節(jié)作用[1]，敲除該基因或使其碳末端發(fā)生突變都會導致小鼠早期胚胎發(fā)育異常[28]。HDAC1基因還參與牙鲆冠狀幼鰭、鰭條、腸道等多種器官的發(fā)育調(diào)控以及變態(tài)階段眼睛移動的過程[11]。在泥蚶中，檢測發(fā)現(xiàn)Tg-HDAC1基因在不同發(fā)育時期均有表達，而原腸胚、擔輪幼蟲期表達量顯著高于其他時期，這兩個時期是胚胎組織、器官形成的重要時期，細胞分裂快速，生命活動旺盛，可能需要更多的Tg-HDAC1基因來調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過程。眼點幼蟲與稚貝時期各組織、器官構建已基本完成，基因表達量較低。

有研究顯示，HDACs和HATs以重塑染色質的

方式直接或間接地結合于MyoD或MEF2基因的調(diào)控序列，影響MyoD或MEF2及其下游基因的表達，進而調(diào)節(jié)肌肉的生肌過程[29]。Tg-HDAC1基因組織表達結果發(fā)現(xiàn)，其在泥蚶斧足中表達量顯著地高于其他組織。斧足是泥蚶主要的運動器官[30]，Tg-HDAC1基因的高表達可能與其富含肌肉、生肌活動較為頻繁有關。另外，斧足占據(jù)泥蚶軟體部的很大部分，Tg-HDAC1基因的高表達推測其對軟體部生長具有重要調(diào)節(jié)作用，可作為泥蚶生長相關的重要候選基因。

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收稿日期：2015-10-23；

修訂日期：2016-04-06。

基金項目：國家現(xiàn)代貝類產(chǎn)業(yè)技術體系項目(CARS-48)；浙江省自然科學基金重點項目(LZ12C19001)； 浙江省重大科技專項(2012C12907-4)；國家水產(chǎn)種質資源平臺項目(2015DKA30470)。

作者簡介：任付真(1988-)，女，山東省定陶縣人，主要從事海洋貝類分子遺傳研究。E-mail：renpiaoyu@126.com *通信作者：林志華(1965-)，研究員。E-mail:zhihua9988@126.com

中圖分類號:S917.4

文獻標志碼：A

文章編號：0253-4193(2016)08-0073-10

cDNA， introns cloning and spatiotemporal expression analysis of HDAC1 gene in Tegillarca granosa

Ren Fuzhen1，2，Yao Hanhan2，Dong Yinghui2，Zhou Xiaolong1，Lin Zhihua2

(1.CollegeofFisheriesandLifeSciences，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China;2.KeyLaboratoryofAquaticGermplasmResourceofZhejiang，CollegeofBiological&EnvironmentalSciences,ZhejiangWanliUniversity,Ningbo315100，China)

Abstract:As an important member of HDACs family， HDAC1 can regulate gene expresstion and play a crucial role in cell differentiation and early embryonic development. Tg-HDAC1 cDNA was cloned by SMART RACE technique and then the bioinformatics， expression analysis， and intron amplification of Tg-HDAC1 were carried out in Tegillarca granosa. The full length of Tg-HDAC1 cDNA was 2 275 bp， containing a complete 1 587 bp ORF encoding 528 amino acids. The homologous similarity between the blood clam and other species， such as Danio rerio， Gallus gallus， Mus musculus， was more than 80%， which indicate that HDAC1 is relatively conserved in the evolution. Thirteen introns of Tg-HDAC1 were amplified in ORF， which all of them follow the principle of GT-AG. The results of six tissue-specific expression by real time PCR showed that Tg-HDAC1 gene expressed in all tissues， and the expression of foot were significantly higher than other tissues(P<0.01)， which suggest that the gene play an important role in the course of foot growth. The relative expression in different stages revealed that the expression of Tg-HDAC1 gradually increased with the process of the development， and showed the highest in trochophore stage (P<0.05)．

Key words:Tegillarca granosa; HDAC1; gene cloning; intron; expression analysis

任付真，姚韓韓，董迎輝，等. 泥蚶HDAC1基因cDNA全長、內(nèi)含子克隆及時空表達特征分析[J].海洋學報，2016，38(8)：73—82， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.08.008

Ren Fuzhen，Yao Hanhan，Dong Yinghui， et al. cDNA， introns cloning and spatiotemporal expression analysis of HDAC1 gene inTegillarcagranosa[J]. Haiyang Xuebao，2016，38(8)：73—82， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.08.008