表達(dá)H1N1亞型豬流感病毒三聚體HA重組慢病毒的免疫原性研究①

鄧穎琦　李俊峰　曲　輝　唐雨博　孫藝學(xué)　李　鑫　王偉利　丁　壯　叢彥龍

(吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長春130062)

?

表達(dá)H1N1亞型豬流感病毒三聚體HA重組慢病毒的免疫原性研究①

鄧穎琦李俊峰②③曲輝②④唐雨博孫藝學(xué)⑤李鑫王偉利⑥丁壯叢彥龍

(吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長春130062)

[摘要]目的：探討表達(dá)豬H1N1亞型流感病毒三聚體HA的重組慢病毒(rLV-HA-GCN4)對BALB/c小鼠的免疫保護效果。方法：將雌性BALB/c小鼠隨機分為重組慢病毒rLV-HA-GCN4組、重組慢病毒rLV-HA組、慢病毒LV空載體對照組及PBS對照組，先后進(jìn)行質(zhì)粒和慢病毒2次免疫，間隔為2周，注射部位均為小鼠大腿內(nèi)側(cè)肌肉；于初次免疫后的第28天，各組小鼠鼻腔滴注50 μl 100TCID50的H1N1病毒，采用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗、流式細(xì)胞術(shù)、間接ELISA和脾肺指數(shù)檢測各免疫指標(biāo)。結(jié)果：加強免疫后第14天，rLV-HA-GCN4組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為0.3±0.11，與PBS組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，產(chǎn)生以Th1型CD4+ T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫反應(yīng)；rLV-HA-GCN4組小鼠IgG抗體效價可達(dá)1∶8 000，攻毒后第14天約為1∶7 000；攻毒后，rLV-HA-GCN4組脾肺指數(shù)小于PBS組，小鼠體重在前3 d略有下降，隨后逐漸上升，兩個指標(biāo)與PBS組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：rLV-HA-GCN4能夠誘導(dǎo)小鼠良好的細(xì)胞與體液免疫應(yīng)答，從而有效地保護小鼠抵御豬H1N1流感病毒的感染。

[關(guān)鍵詞]豬流感；H1N1亞型；三聚體HA；慢病毒載體；免疫原性

流行性感冒(Influenza)簡稱流感(flu)，是由流感病毒(Influenza virus)引起的一種潛伏期短、傳染性強、傳播迅速的急性呼吸道傳染病。根據(jù)核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)抗原性的不同，將流感病毒分為3個型，即甲(A)、乙(B)、丙(C)型，其中A型流感病毒宿主感染譜最為廣泛，包括多種禽類和哺乳動物。A型流感病毒根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原性的不同可分為多種不同的亞型。其中H1N1亞型流感病毒自1918年發(fā)現(xiàn)至今，不僅導(dǎo)致了養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，而且作為引發(fā)人群季節(jié)性流感的主要致病亞型，也給人類健康帶來了巨大威脅。此外，H1N1亞型病毒在豬群與人群中的跨種傳播也受到了密切關(guān)注，因此防控該亞型流感具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[1,2]。本研究對前期利用慢病毒載體系統(tǒng)包裝的表達(dá)H1N1亞型豬流感病毒三聚體HA的重組慢病毒進(jìn)行了免疫原性評價，為今后防控H1N1亞型豬流感病毒提供理論和實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒H1N1亞型豬流感病毒由吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院傳染病實驗室分離并保存；重組慢病毒rLV-HA-GCN4、重組慢病毒rLV-HA、慢病毒LV均由吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院傳染病實驗室構(gòu)建包裝[3]。

1.1.2實驗動物60只6～8周齡SPF雌性BALB/c小鼠，體重15～18 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0004。

1.1.3主要試劑紅細(xì)胞裂解液、MTT購自碧云天生物有限公司；ConA、PMA、離子酶素購自Sigma公司；阻斷劑BFA、穿膜劑購自eBioscience公司；APC anti-mouse CD3、FITC anti-mouse CD4、PE anti-mouse CD8、FITC anti-mouse TNF-α、PE anti-mouse IFN-γ、PE anti-mouse IL-12、PE anti-mouse IL-4、FITC anti-mouse IL-10均購自BD Biosciences公司；1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自Gibco公司；兔抗鼠酶標(biāo)二抗購自Southern Biotech公司。

1.2方法

1.2.1動物分組、免疫及攻毒將飼養(yǎng)于溫度22℃、相對濕度50%～60%環(huán)境中的小鼠隨機分為4組：重組慢病毒rLV-HA-GCN4組、重組慢病毒rLV-HA組、慢病毒LV空載體對照組及PBS對照組。初次免疫時，免疫組小鼠分別肌注各慢病毒質(zhì)粒15 μg/100 μl，PBS組肌注PBS 100 μl；于初次免疫后的第14天，免疫組再分別以各106轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)的慢病毒進(jìn)行加強免疫。質(zhì)粒與慢病毒免疫部位均為小鼠大腿內(nèi)側(cè)肌肉；于初次免疫后的第28天，小鼠鼻腔滴注50 μl 100TCID50的H1N1病毒，每日觀察小鼠狀態(tài)并稱重。

1.2.2脾細(xì)胞的制備加強免疫后第14天每組取3只小鼠，脫頸處死后無菌剪取部分脾臟置于200目細(xì)胞篩網(wǎng)上，充分研磨后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入5 ml離心管中，2 000 r/min×5 min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液，混勻后立即加入1 ml含有10%血清的1640培養(yǎng)液中，2 000 r/min×5 min；用1640培養(yǎng)液洗滌2次后，再以1 ml培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計數(shù)。

1.2.3淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測定采用MTT法。將1×106ml-1的脾細(xì)胞懸液鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μl，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至單層后，用終濃度為5 μg/ml ConA刺激，未加刺激劑的自然增殖孔以細(xì)胞培養(yǎng)液代替，培養(yǎng)72 h后，加入10 μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心棄上清，加入150 μl DMSO，室溫避光孵育20 min后，在酶標(biāo)儀490nm波長處測定吸光度值(A)。

1.2.4T細(xì)胞亞群的檢測采用流式細(xì)胞術(shù)。將1×106ml-1的脾細(xì)胞懸液鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μl，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至單層后，以100 μl FACS buffer重懸細(xì)胞，每100萬個細(xì)胞分別加入1 μg的APC anti-mouse CD3、FITC anti-mouse CD4、PE anti-mouse CD8，同時設(shè)置同型對照。4℃避光孵育1 h后，2 000 r/min×5 min，用1640培養(yǎng)液洗滌2次，以100 μl FACS buffer重懸細(xì)胞，經(jīng)尼龍膜濾至流式細(xì)胞管，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.5脾細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測采用流式細(xì)胞術(shù)。將1×106ml-1的脾細(xì)胞懸液鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μl，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至單層后，每孔加入PMA與離子酶素(終濃度為10 mg/ml)，12 h后加入BFA(3 μg/ml)，培養(yǎng)5 h后收集4個復(fù)孔細(xì)胞。2 000 r/min×5 min棄上清，用PBS重懸細(xì)胞；2 000 r/min×5 min，棄上清，每管加入100 μl 4%多聚甲醛，室溫避光孵育20 min；每管加入1 ml穿膜劑，混勻，2 000 r/min×5 min，棄上清。重復(fù)上述操作步驟1次。每管加入400 μl PBS，混勻后分裝至100 μl/管。分別加入各10 μl的FITC anti-mouse TNF-α、PE anti-mouse IFN-γ、PE anti-mouse IL-12、PE anti-mouse IL-4、FITC anti-mouse IL-10，4℃孵育1 h后，用FACS buffer洗滌2次，2 000 r/min×5 min，剩余200 μl上清，經(jīng)尼龍膜濾至流式細(xì)胞管，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢檢測。

1.2.6抗體效價的檢測采用間接ELISA方法。分別于初次免疫、加強免疫和攻毒后的第14天，經(jīng)小鼠眼眶無菌采血。37℃水浴30 min，4℃ 1 500 r/min×10 min，分離血清。采用間接ELISA方法測定血清中IgG抗體效價：將100 μl病毒液加入96孔ELISA板，4℃包被過夜；每孔加入150 μl BSA，37℃封閉2 h；每孔加入100 μl不同稀釋度的待檢血清，37℃作用1 h；每孔加入100 μl HRP標(biāo)記的兔抗鼠酶標(biāo)二抗(1∶5 000稀釋)，37℃作用1 h。上述各步驟之間均用PBST洗滌3次，每次5 min。二抗孵育后每孔加入50 μl底物，避光顯色；當(dāng)陽性對照孔顯色時，每孔加入50 μl終止液，在酶標(biāo)儀450nm波長處測定A值，A≥0.2判為陽性。

1.2.7脾肺指數(shù)的測定于攻毒后第14天，將小鼠斷頸，無菌取出小鼠脾臟和肺臟，用濾紙吸干表面水分后稱重，并計算：脾指數(shù)=(脾重/體重)×100%；肺指數(shù)=(肺重/體重)×100%。

圖1　淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果Fig.1　Result of lymphocyte transformationNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

2結(jié)果

2.1細(xì)胞免疫水平

2.1.1淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平加強免疫后第14天，rLV-HA-GCN4組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(TV)遠(yuǎn)大于其他組，TV=0.3±0.11，與其他3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.1.2胞內(nèi)細(xì)胞因子水平與對照組比較，初次免疫后第14天，rLV-HA-GCN4組各細(xì)胞因子含量均增加，其中IL-10、TNF-α分泌較多，分別達(dá)到26.13±2.51、18.67±1.17；加強免疫后第14天，各組細(xì)胞因子水平均有所下降，但重組慢病毒免疫組各細(xì)胞因子表達(dá)量均高于PBS組，以IFN-γ、TNF-α分泌較多。見圖2。

2.1.3CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群檢測結(jié)果顯示，初次免疫后第14天，與LV組和PBS組相比，rLV-HA-GCN4組與rLV-HA組兩個亞群T細(xì)胞的百分含量均升高，且各組CD4+T細(xì)胞含量高于CD8+T細(xì)胞；與初次免疫相比，加強免疫后第14天，兩個亞群T細(xì)胞的百分含量均有所增加，且以rLV-HA-GCN4組CD4+T細(xì)胞含量增加最為明顯，為38.27±3.32,與PBS組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。攻毒后第14天， rLV- HA- GCN4組

圖2　胞內(nèi)細(xì)胞因子水平Fig.2　Expression level of intracellular cytokinesNote: *.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001.

圖3　CD4+/CD8+ T細(xì)胞亞群分析Fig.3　Analysis of CD4+/CD8+ T cellsNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

圖4　IgG抗體滴度Fig.4　IgG titers

圖5　免疫攻毒后小鼠體重變化Fig.5　Body weight change of mice after immunization and challenge

圖6　攻毒后小鼠的脾肺指數(shù)Fig.6　Spleen and lung indexes in mice after challengeNote: *.P<0.05.

CD4+T細(xì)胞的百分含量下降，為33.93±4.8，而CD8+T細(xì)胞的百分含量增加至20.9±0.98，與PBS組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.2體液免疫水平ELISA檢測結(jié)果顯示，初次免疫后第14天，rLV-HA-GCN4組與rLV-HA組HA抗體效價約為1∶1 000；加強免疫后第14天，HA抗體效價明顯升高，rLV-HA-GCN4組A=0.208時的稀釋倍數(shù)為1∶8 000，rLV-HA組A=0.203時的稀釋倍數(shù)為1∶2 000；攻毒后第14天，rLV-HA-GCN4組HA抗體效價略有降低，A=0.191時的稀釋倍數(shù)為1∶8 000，1∶4 000 時A=0.235；rLV-HA組A=0.24時的稀釋倍數(shù)為1∶2 000。見圖4。

2.3免疫攻毒后小鼠的體重變化初次免疫后，rLV-HA-GCN4組小鼠體重變化較大，在免疫后第8天逐漸上升；加強免疫后，各組小鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；攻毒后，rLV-HA-GCN4組小鼠體重在前3 d略有下降，隨后顯著上升，與LV組和PBS組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明rLV-HA-GCN4免疫后能有效保護小鼠抵御病毒的攻擊。見圖5。

2.4脾肺指數(shù)攻毒后第14天，LV-HA-GCN4組、rLV-HA組、LV組、PBS組小鼠脾指數(shù)分別為3.5±0.66、3.61±0.74、4.92±0.39、5.3±0.18。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，rLV-HA-GCN4組脾指數(shù)與PBS和LV組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。rLV-HA-GCN4組、rLV-HA組、LV組、PBS組肺指數(shù)分別為0.64±0.05、0.73±0.14、0.8±0.12、1.04±0.2，rLV-HA-GCN4組與PBS組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此表明，免疫rLV-HA-GCN4對攻毒小鼠脾肺都具有保護作用。見圖6。

3討論

作為流感病毒表面的重要糖蛋白，HA不僅能結(jié)合細(xì)胞表面的唾液酸受體，而且是病毒最主要的保護性抗原。蛋白的功能取決于結(jié)構(gòu)，所表達(dá)蛋白的結(jié)構(gòu)越接近于天然構(gòu)象，免疫原性越好。為了保持HA的天然三聚體結(jié)構(gòu)，本研究組在前期工作中利用GS-linker將HA與GCN4偶聯(lián)，形成HA-GCN4柔性鏈接，以此利于HA的自然折疊，并以慢病毒包裝系統(tǒng)表達(dá)了HA-GCN4偶聯(lián)蛋白，獲得了主要以三聚體形式存在的HA[3]。本研究以細(xì)胞與體液免疫、脾肺指數(shù)、體重變化等指標(biāo)評價了rLV-HA-GCN4的免疫原性及其免疫保護效果。

CD4+和CD8+T細(xì)胞是成熟T淋巴細(xì)胞的兩個重要亞群。其中，CD4+T細(xì)胞通過產(chǎn)生細(xì)胞因子或細(xì)胞毒活性作用來清除病原，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，輔助CD8+T細(xì)胞活化。CD8+T細(xì)胞為細(xì)胞毒性細(xì)胞或抑制性細(xì)胞，能夠發(fā)揮特異性的殺傷作用或抑制免疫反應(yīng)。正常生理情況下，各亞群T淋巴細(xì)胞在數(shù)量和功能上保持穩(wěn)定并相互協(xié)調(diào)，以維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)[4]。在本研究中，CD4+和CD8+分型結(jié)果顯示，免疫或攻毒后，CD4+T細(xì)胞數(shù)量均明顯多于CD8+T細(xì)胞。但是從免疫到攻毒，CD4+T細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)由低-高-低的走勢，而CD8+T細(xì)胞數(shù)量表現(xiàn)為持續(xù)升高，表明免疫已經(jīng)有效激活了T淋巴細(xì)胞，而當(dāng)CD4+T細(xì)胞發(fā)揮抗病毒作用后，免疫系統(tǒng)可通過促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的活化、增殖來調(diào)節(jié)CD4+和CD8+T細(xì)胞的功能平衡，從而有利于免疫系統(tǒng)趨于穩(wěn)態(tài)。

CD4+T細(xì)胞是不均一的細(xì)胞亞群，主要亞群是輔助性T細(xì)胞(helper T lymphocyte，Th)。根據(jù)CD4+Th細(xì)胞所分泌細(xì)胞因子的不同，可進(jìn)一步將其分為若干亞群，其中Th1與Th2細(xì)胞是最早被認(rèn)識的兩個Th細(xì)胞亞型。Th1與Th2之間相互制約，通過遏制彼此的數(shù)量及功能而處于動態(tài)平衡，以保持機體正常的免疫功能。一旦發(fā)生平衡失調(diào)，即Th1/Th2漂移，就會導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)功能的紊亂。免疫功能的平衡主要由不同的T淋巴細(xì)胞亞群分泌的各種細(xì)胞因子進(jìn)行調(diào)控。其中，Th1細(xì)胞以表達(dá)IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-12為主，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13[5]。IFN-γ是主要的抗病毒因子，能激活CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，增強中性粒細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子(IL-1、IL-12等)的合成和分泌。IL-12是一種多功能中間物質(zhì)，是介導(dǎo)Th0向Th1方向極化的最核心因子，可與IL-2共同誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分泌更多的IFN-γ，是強化細(xì)胞免疫因子之一[6,7]。TNF-α是免疫與炎癥反應(yīng)中所分泌的具有抗病毒作用的細(xì)胞因子[8]。IL-4是Th2細(xì)胞分泌的特征性抗炎細(xì)胞因子，對B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等都有免疫調(diào)節(jié)作用[9]。IL-10也是一種抗炎細(xì)胞因子，對恢復(fù)及維持體內(nèi)的免疫平衡有重要作用。它能明顯抑制Th1型細(xì)胞因子產(chǎn)生，并間接促進(jìn)Th2細(xì)胞分化。此外，IL-10能夠降低抗原的提呈，抑制巨噬細(xì)胞的活性，進(jìn)而抑制促炎癥因子和趨化因子的產(chǎn)生[10]。在本研究中，IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12五種細(xì)胞因子的檢測結(jié)果顯示，初次免疫后各組細(xì)胞因子含量高于加強免疫，這可能是由于初次免疫時機體首次受到抗原的刺激導(dǎo)致細(xì)胞因子在短期內(nèi)大量釋放，而處于免疫狀態(tài)的機體受到同種抗原的再刺激時，不再表現(xiàn)出強烈的免疫反應(yīng)。根據(jù)免疫后細(xì)胞因子的表達(dá)水平，本研究中收集的各免疫時間點的T淋巴細(xì)胞樣本主要表達(dá)Th1型細(xì)胞因子。

體液免疫檢測結(jié)果表明，rLV-HA-GCN4組小鼠在加強免疫后第14天，IgG抗體效價可達(dá)1∶8 000，攻毒后第14天約為1∶7 000；攻毒后，rLV-HA-GCN4組脾肺指數(shù)顯著低于PBS組，小鼠體重在前3 d略有下降，隨后逐漸上升。

4結(jié)論

由于酵母轉(zhuǎn)錄激活因子——GCN4能夠促進(jìn)與其偶聯(lián)表達(dá)的蛋白分子保持天然的多聚體結(jié)構(gòu)，從而有利于蛋白保留其生物學(xué)活性，因此利用慢病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建的rLV-HA-GCN4免疫小鼠后表現(xiàn)出了良好的免疫原性，能夠有效誘導(dǎo)細(xì)胞與體液免疫應(yīng)答，這比單純表達(dá)HA的rLV-HA組效果要好。本研究對流感病毒免疫制劑的研制具有一定的借鑒意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]Watanabe T,Kawaoka Y.Pathogenesis of the 1918 Pandemic Influenza Virus[J].PLoS Pathogens,2011,7(1):e1001218.

[2]Leung GM,Nicoll A.Reflections on pandemic (H1N1) 2009 and the international response[J].PLoS Med,2010,7(10):e1000346.

[3]李鑫,宋戰(zhàn)昀,朱利塞,等.表達(dá)豬H1N1亞型流感病毒三聚體HA的重組慢病毒包裝[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2012,32(12):1828-1845.

[4]Swain SL,McKinstry KK,Strutt TM.Expanding roles for CD4+T cells in immunity to viruses[J].Nat Rev Immunol,2012,12(2):136-148.

[5]Motomura Y,Kitamura H,Hijikata A,etal.The transcription factor E4BP4 regulates the production of IL-10 and IL-13 in CD4+T cells[J].Nat Immunol,2011,12(5):450-459.

[6]Nazari B,Amirzargar A,Nikbin B,etal.Comparison of the Th1,IFN-γ secreting cells and FoxP3 expression between patients with stable graft function and acute rejection post kidney transplantation[J].Iran J Allergy Asthma Immunol,2013,12(3):262-268.

[7]Méndez-Samperio P.Role of interleukin-12 family cytokines in the cellular response to mycobacterial disease[J].Int J Infect Dis,2010,14(5):e366-e371.

[8]Walsh KB,Teijaro JR,Rosen H,etal.Quelling the storm:utilization of sphingosine-1-phosphate receptor signaling to ameliorate influenza virus-induced cytokine storm[J].Immunol Res,2011,51(1):15-25.

[9]Luzina IG,Keegan AD,Heller NM,etal.Regulation of inflammation by interleukin-4:a review of "alternatives"[J].J Leukoc Biol,2012,92(4):753-764.

[10]Fujio K,Okamura T,Yamamoto K.The family of IL-10-secreting CD4+T cells[J].Adv Immunol,2010,105:99-130.

[收稿2016-01-13修回2016-01-27]

(編輯倪鵬)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.011

作者簡介：鄧穎琦(1992年-)，女，在讀碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)方面研究，E-mail:dengyingqi92@126.com。

通訊作者及指導(dǎo)教師：丁壯(1960年-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事人獸共患病毒病診斷與防控研究。

中圖分類號S855.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-0983-05

Study on immunogenicity of recombinant lentivirus expressing trimeric HA of swine H1N1 influenza virus

DENG Ying-Qi,LI Jun-Feng,QU Hui,TANG Yu-Bo,SUN Yi-Xue,LI Xin,WANG Wei-Li，DING Zhuang,CONG Yan-Long.

College of Veterinary Medicine,Jilin University,Changchun 130062,China

[Abstract]Objective:To evaluate the protective immunity by vaccination of BALB/c mice with rLV-HA-GCN4,a recombinant lentivirus expressing the trimeric HA of swine H1N1 influenza virus.Methods: The female mice were randomly divided into rLV-HA-GCN4,rLV-HA,LV and PBS groups.Mice were primed with plasmid and boosted with lentivirus by the administration of intramuscular thigh injections at an interval of two weeks.At day 28 post-prime immunization,mice were inoculated intranasally with 100TCID50of swine H1N1 influenza virus in a 50 μl volume.The immune levels were assessed by the T lymphocyte transformation test,flow cytometry,indirect ELISA and the indexes of spleen and lung.Results: The spleen lymphocyte transformation rate was 0.3±0.11 in the rLV-HA-GCN4 group at day 14 post-boost immunization,showing a statistical significance (P<0.01) compared to the PBS group.Meanwhile,rLV-HA-GCN4 could cause T lymphocyte response mainly based on the Th1-type CD4+ T cells.The IgG antibody titer reached to 1∶8 000 at day 14 post-boost immunization and approximately 1∶7 000 at day 14 post challenge.After challenge,the spleen and lung indexes of rLV-HA-GCN4 group were significantly lower than those of PBS group (P<0.05).The body weight of rLV-HA-GCN4 group demonstrated a slight decrease before 3 days post challenge and then a gradual increase compared to the LV and PBS groups (P<0.05).Conclusion: rLV-HA-GCN4 can effectively induce cellular and humoral immune response in BALB/c mice against swine H1N1 influenza virus.

[Key words]Swine influenza; H1N1 subtype; Trimeric HA; Lentiviral vector; Immunogenicity

①本文為國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2014IK237)和吉林省科技廳重點科技攻關(guān)項目(20150204029NY)。

②共同第一作者。

③吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院，長春130118。

④吉林省動植物檢驗檢疫局，長春130062。

⑤吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春130118。

⑥吉林省出入境檢驗檢疫局，長春130000。

叢彥龍(1977年-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事人獸共患病毒病診斷與防控研究。