TLCS同時測定珠黃散中4種膽汁酸含量

陳蓉陳偉顧炳仁（蘇州市食品藥品檢驗所，江蘇蘇州504；蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，5006）

TLCS同時測定珠黃散中4種膽汁酸含量

陳蓉1陳偉2顧炳仁1（1蘇州市食品藥品檢驗所，江蘇蘇州215104；2蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，215006）

目的：建立同時測定珠黃散中膽酸、豬去氧膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸含量的方法。方法：以甲醇為提取溶劑，制備供試品溶液應(yīng)用于薄層色譜掃描法，使用硅膠G高效薄層板，以異辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸（15∶7∶6）為展開劑，10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，460 nm為測定波長，進行薄層定量掃描。結(jié)果：膽酸、豬去氧膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸分別在0.20～2.00μg（r≥0.999）內(nèi)含量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系，平均回收率（n=6）分別為95.88%（RSD=1.86%），97.43%（RSD=2.23%），96.24%（RSD=2.78%），96.63% （RSD=1.87%）。測得12批珠黃散中4種膽汁酸平均含量分別為31.94，6.36，20.19，10.53 mg/g。結(jié)論：該方法專屬性強，重復(fù)性好，適用于珠黃散中4種膽汁酸的含量測定及質(zhì)量控制。

珠黃散；膽酸；豬去氧膽酸；去氧膽酸；鵝去氧膽酸；薄層色譜掃描法；含量測定

珠黃散來源于清代綜合性醫(yī)書《醫(yī)級》，為傳統(tǒng)方劑［1］。由人工牛黃與珍珠配伍組成，具有清熱解毒，化腐生肌的功效。主治喉痹、乳蛾、口瘡、牙疳等癥。用于熱毒內(nèi)蘊所致的咽痛、咽部紅腫、糜爛、口瘡潰瘍久不收斂［2］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)常用于急性咽炎，急性扁桃體炎，復(fù)發(fā)性口腔潰瘍，牙齦炎，壓瘡等［3-5］。方中珍珠清熱解毒，生肌斂瘡，牛黃清熱解毒涼血，二藥配伍，共奏清熱解毒，祛腐生肌之效。目前，珠黃散的國家標(biāo)準(zhǔn)為《中國藥典》以及衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)。《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)相對完善，部頒標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容較為簡單?！吨袊幍洹?015年版一部采用薄層色譜掃描法（TLCS）測定珠黃散中膽酸含量來控制人工牛黃的質(zhì)量。人工牛黃主要成分為膽汁酸類，主要包含膽酸、豬去氧膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸?？梢?，單一測定膽酸含量來評價珠黃散中人工牛黃質(zhì)量并不完善。本文擬建立TLCS同時測定膽酸、豬去氧膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸4種膽汁酸類成分，該方法專屬性強，重復(fù)性好，適用于珠黃散中4種膽汁酸的含量測定及質(zhì)量控制，能較為全面反映方中人工牛黃的質(zhì)量。

1　儀器與試藥

Camag TLC Scanner 3型薄層掃描儀（瑞士卡瑪生化科技有限公司）；Camag Automatic TLC Sampler 4型全自動點樣儀（瑞士卡瑪生化科技有限公司）；XS105DU型電子天平（北京賽多利斯儀器公司）；KQ-400GKDV超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；硅膠G高效薄層色譜板（100 mm×200 mm×0.25 mm，Merck KGaA）；BUCHI B-811全自動索氏提取儀（瑞士步琪有限公司）。

2　方法與結(jié)果

2.1　對照品溶液的制備

取105℃干燥至恒重的對照品膽酸、豬去氧膽酸、去氧膽酸品、鵝去氧膽酸適量，加甲醇制成每lm L含膽酸0.200 2mg、豬去氧膽酸0.200 5mg、去氧膽酸0.200 4 mg、鵝去氧膽酸0.200 2 mg的混合對照品溶液，即得。

2.2　供試品溶液的制備

取珠黃散樣品0.2 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流提取2 h，提取液蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10 m L量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3　試驗條件

精密吸取供試品溶液5μL，對照品溶液2μL 與10μL，分別交叉點于同一硅膠G薄層板上，以異辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸（15∶7∶6）為展開劑，展距8 cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，取出，在薄層板上覆蓋同樣大小的玻璃板，周圍用膠布固定；條帶點樣，帶寬6 mm；掃描光源為鎢燈，波長460 nm，狹縫寬度4.00×0.30 mm，掃描速度20 mm/s。測量供試品吸光度積分值與對照品吸光度積分值，外標(biāo)二點法計算，即得。

2.4　線性關(guān)系的考察［6］

精密吸取上述混合對照品溶液各1，2，4，6，8，10μL，分別點于薄層板上，按上述“2.3”項方法測定吸光度積分值，以對照品進樣質(zhì)量為自變量（X），峰面積積分值為因變量（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：

膽酸：

Y=3.113 X+1 775（r=0.999 9），

豬去氧膽酸：

Y=1.482 X+894.2（r=0.999 9），

王世君身為雞東縣公路管理站工程師兼農(nóng)村公路路網(wǎng)改造工程建設(shè)指揮部總工程師，自參加工作以來，便一直從事公路與橋梁建設(shè)、養(yǎng)護與管理工作。他刻苦鉆研業(yè)務(wù)知識，兢兢業(yè)業(yè)、務(wù)實創(chuàng)新，所負責(zé)的各項工作都取得了長足的發(fā)展。

去氧膽酸：

Y=0.647 9 X+1 076（r=0.999 6），

鵝去氧膽酸：

Y=1.376 X+1 701（r=0.999 8）。

實驗表明，膽酸、豬去氧膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸在0.20～2.00μg范圍內(nèi)具良好的線性關(guān)系。

2.5　空白試驗

按處方工藝制備不含人工牛黃的陰性樣品，即取珍珠對照藥材，按“2.2”項下方法制備陰性對照溶液。與供試品溶液、對照品溶液點于同一薄層板上，按上述“2.3”項方法進行展開、顯色、掃描。結(jié)果陰性樣品在膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸對照品相應(yīng)的色譜位置無吸收，表明其他成分對混合對照品的測定無干擾。樣品色譜中，膽酸（Rf：0.31）、豬去氧膽酸（Rf：0.50）、鵝去氧膽酸（Rf：0.62）、去氧膽酸（Rf：0.67）與前后斑點之間分離清晰，無其他成分干擾。見圖1，2。

1　薄層色譜平面圖

2.6　精密度試驗［7］

2　薄層色譜掃描圖

2.6.1同板精密度試驗精密吸取同一供試品溶液（120101）5μL，在同一硅膠G薄層板上分別點樣6次，同上述“2.3”項進行測定，結(jié)果膽酸、豬去氧膽酸、去氧膽酸品、鵝去氧膽酸的RSD分別為1.05%，1.57%，1.20%，1.72%，表明儀器同板精密度良好。

2.6.2異板精密度試驗精密吸取同一供試品溶液（120101）5μL，在6塊不同硅膠G薄層板上分別點樣，同上述“2.3”項進行測定，結(jié)果膽酸、豬去氧膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸的RSD分別為1.44%，1.84%，0.93%，0.86%，表明儀器異板精密度良好。

2.7　穩(wěn)定性試驗［8］

精密吸取同一供試品溶液（120101）5μL，點樣，展開，顯色至斑點清晰，按上述“2.3”項方法于0，10，20，30，40，60 m in測定其峰面積。結(jié)果，膽酸、豬去氧膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸峰面積RSD分別為0.71%，1.31%，1.39%，1.60%。結(jié)果表明供試品在60 m in內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8　重復(fù)性試驗

取同一珠黃散樣品（120101）6份，精密稱定，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液。點樣5μL，展開，顯色至斑點清晰，按上述“2.3”項方法測定其峰面積值。結(jié)果，膽酸、豬去氧膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸平均含量分別為33.89，6.23，18.64，10.03 mg/g，RSD分別為0.73%，1.64%，1.23%，1.00%。結(jié)果表明該測定方法重復(fù)性良好。

2.9　加樣回收試驗

取已知含量的珠黃散樣品（120101，含膽酸34.00 mg/g，豬去氧膽酸6.10 mg/g，鵝去氧膽酸9.98 mg/g，去氧膽酸18.28 mg/g），研細，精密稱定0.1 g，加入“2.1”項下混合對照品溶液5.0 m L，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，平行6份，點樣5μL，展開，顯色至斑點清晰，按上述“2.3”項方法測定其峰面積值。計算回收率，結(jié)果見表1。

2.10　樣品測定

分別稱取所收集的12批珠黃散樣品適量，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，點樣5μL，展開，顯色至斑點清晰，按上述“2.3”項方法測定其峰面積值，計算膽酸、豬去氧膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸含量。結(jié)果見表2。

根據(jù)上述測定結(jié)果，12批珠黃散中膽酸含量均符合《中國藥典》2015年版每1 g不得少于26.0mg的規(guī)定。豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸含量均較膽酸含量低。各批次之間含量差異不明顯。從表2可知，膽酸含量約為膽汁酸總量的一半，故單一測定膽酸含量來反映人工牛黃的質(zhì)量并不全面，建議同時測定這4種膽汁酸含量，以總量計，來評價人工牛黃的品質(zhì)，更為合適。

表1　膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸加樣回收率試驗（n=6）

表2　珠黃散含量測定結(jié)果（n=3，?±s）（mg/g）

3　討論

膽汁酸類成分的含量測定方法有比色法［9］、高效液相色譜法［10-12］、薄層色譜掃描法［13］、毛細管電泳法［14］等，這些方法多限于單組分測定。其中定量測定最常用高效液相色譜法，但因膽汁酸類物質(zhì)是不具有熒光性質(zhì)的甾體化合物，結(jié)構(gòu)中無共軛雙鍵，不含有生色團，有末端吸收，溶劑干擾大，因此需要采用蒸發(fā)光散射檢測器，相比紫外檢測器，測定時間更長，準(zhǔn)確度較低。TLCS能夠較為簡便快速地同時測定4種膽汁酸。經(jīng)過10%硫酸乙醇顯色后，在日光和紫外光燈365 nm下，均能清晰分離。較為直觀實用。

本測定方法基本參照《中國藥典》2015年版一部珠黃散項下膽酸的含量測定方法，因其只測定人工牛黃中膽酸這一成分，并不能同時分離4種膽汁酸，故測定結(jié)果不全面。經(jīng)改進，以甲醇為提取溶劑，樣品中除一些無機鹽、膽紅素外，大多數(shù)成分能溶于甲醇，較為便捷。采用全自動索氏提取儀制備樣品，異辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸（15∶7∶6）為展開劑，得到的Rf值在0.3～0.7之間，較為適當(dāng)，可將4種成分較好分離，并能做到同步含量測定，使測定結(jié)果更準(zhǔn)確。

珠黃散作為傳統(tǒng)方藥，臨床應(yīng)用普遍，但現(xiàn)代研究較少，特別是制劑質(zhì)量控制還不完善。本文建立了TLCS同時測定膽酸、豬去氧膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸4種膽汁酸類成分，該方法專屬性強，重復(fù)性好，適用于珠黃散中4種膽汁酸的含量測定及質(zhì)量控制，能較為全面反映方中人工牛黃的質(zhì)量?？蔀椤吨袊幍洹分兄辄S散含量測定標(biāo)準(zhǔn)的提高作一參考。

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Simultaneous Determ ination of Contents of Four Bile Acids in Zhuhuang San by TLCS

Chen Rong1，Chen Wei2，Gu Bingren1（1 Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215104，China；2 Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，215006）

Objective：To develop a method for simultaneous determination of contents of four bile acids，i.e. cholic acid，hyodeoxycholic acid，deoxycholic acid and chenodeoxycholic acid，in zhuhuang san.Methods：Test sample solution was prepared for TLCS using methanol as an extraction solvent.Silica gel prefabricate thin layer plate was used w ith isooctane-ethyl acetate-glacial acetic acid（15∶7∶6）as a developing solvent and 10%alcoholic solution of sulfuric acid as a color development reagent.TLCS was performed at a detection wave-length of 460 nm.Results：There was a good linear relation between the integrated peak area and the contents of four bile acids at a range of 0.20～2.00μg（r≥0.999）.The average recovery rates（n=6）of cholic acid，hyodeoxycholic acid，deoxycholic acid and chenodeoxycholic acid were 95.88%（RSD=1.86%），97.43%（RSD=2. 23%），96.24%（RSD=2.78%）and 96.63%（RSD=1.87%）respectively.The average contents of the above-mentioned four bile acids in 12 batches of zhuhuang san were 31.94，6.36，20.19 and 10.53 mg/g respectively.Conclusion：The method showed high specificity and reproducibility，which was suitable for the determ ination of contents of four bile acids in Zhuhuang San.

Zhuhuang San；Cholic Acid；Hyodeoxycholic Acid；Deoxycholic Acid；Chenodeoxycholic Acid；Thin Layer Chromatography Scanning（TLCS）；Consent Determ ination

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.07.002

蘇州市“科教興衛(wèi)”青年科技項目（KJXW 2015028）

陳蓉，女，碩士，主管中藥師。主要從事中藥品質(zhì)評價工作。E-mail：kedingyu@126.com
顧炳仁，男，碩士生導(dǎo)師，主任藥師。主要從事從事藥物分析工作。通訊作者E-mail：gubinren@126.com

2016-02-24）