單糖標(biāo)準(zhǔn)品的選擇和不同試驗產(chǎn)地金線蓮中多糖含量分析

林守二黃麗英吳興明陳瑜黃慶佐黃冰蘭（福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福建福州50004；福建省永安市農(nóng)業(yè)局，永安66000；福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）

單糖標(biāo)準(zhǔn)品的選擇和不同試驗產(chǎn)地金線蓮中多糖含量分析

林守二1黃麗英1吳興明2陳瑜3黃慶佐1黃冰蘭1（1福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350004；2福建省永安市農(nóng)業(yè)局，永安366000；3福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）

目的：建立金線蓮多糖（Anoectochilus roxburghii polysaccharide，ARPS）的含量測定方法，比較不同試驗產(chǎn)地的金線蓮藥材中多糖的含量，并研究選擇用來換算ARPS含量的最合適標(biāo)準(zhǔn)單糖。方法：采用水提醇沉法制備粗ARPS，用Sevage法脫去其中的蛋白。通過比較不同單糖與樣品溶液的紫外吸收譜圖來選擇最合適的單糖標(biāo)準(zhǔn)品，同時由精制ARPS求出換算因子f，通過苯酚-硫酸法測定不同試驗產(chǎn)地的金線蓮中多糖的含量。結(jié)果：以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)單糖計算ARPS含量，求得換算因子f=1.06，平均回收率為97.94%，測得不同試驗產(chǎn)地的藥材中ARPS的含量從2.01%～17.49%不等。結(jié)論：該方法簡便、穩(wěn)定、可行，不同試驗產(chǎn)地的金線蓮藥材中多糖的含量差異較大，該結(jié)果為金線蓮培植與進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

金線蓮；多糖；含量測定；單糖標(biāo)準(zhǔn)品；試驗產(chǎn)地

金線蓮（Anoectochilus roxburghii）為蘭科開唇蘭屬植物，是民間常用的多年生珍稀草藥，多用于治療糖尿病、高脂血癥、乙型肝炎等疾?。?］，有“藥王”“金草”之稱。其一般分布在海拔300～1 200 m的丘陵地帶，福建、臺灣、浙江、江西、廣東和廣西等地有野生金線蓮［2］。金線蓮富含多糖、揮發(fā)油、微量元素、強心苷類、三萜類、有機酸、甾體化合物、黃酮類化合物、生物堿等多種成分［3-4］，其中關(guān)于多糖類的研究較多。

根據(jù)研究報道，植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、降血脂等生物活性［5］，其在保健食品、畜牧生產(chǎn)及其他領(lǐng)域均有較廣泛應(yīng)用［6］。關(guān)于金線蓮多糖（ARPS）的應(yīng)用研究報道也逐漸增加，劉青等［7］發(fā)現(xiàn)金線蓮多糖具有較強的清除氧自由基作用和體外抗氧化活性。許丹妮等［8］通過研究，發(fā)現(xiàn)金線蓮多糖能提高免疫抑制小鼠體質(zhì)量及免疫器官指數(shù)，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖。王常青等［9］研究發(fā)現(xiàn)臺灣金線蓮多糖對肺腺癌細(xì)胞具有較好的殺傷作用，表明其具有作為抗腫瘤藥物或輔助抗腫瘤藥物的應(yīng)用前景。翁秀華等［10］研究發(fā)現(xiàn)金線蓮多糖對人前列腺癌細(xì)胞PC-3的增殖具有顯著的抑制作用。

金線蓮多糖的含量受較多因素的影響。龔秀會等［11］通過對不同基原金線蓮植物的化學(xué)成分比較，發(fā)現(xiàn)組培的金線蓮樣品中多糖含量遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報道的野生金線蓮樣品。黃瑞平等［12］在不同月齡金線蓮多糖的比較中發(fā)現(xiàn)多糖含量隨著金線蓮的栽培月齡的增加而降低。楊翠芹等［13］討論了不同培養(yǎng)條件對金線蓮多糖含量的影響，表明較高的蔗糖濃度對多糖積累最有利，且隨著繼代天數(shù)的延長，多糖含量表現(xiàn)出先減少后增加的趨勢。顧慧芬等［14］通過對臺灣產(chǎn)的野生與組培金線蓮有效成分分析比較，發(fā)現(xiàn)組培苗與野生品的多糖含量相近。

苯酚-硫酸法測定多糖含量的原理是多糖經(jīng)濃硫酸水解產(chǎn)生單糖，單糖在濃硫酸加熱作用下，失去3分子水，生成糠醛類衍生物，糠醛類衍生物進(jìn)一步與苯酚生成有色物質(zhì)，其反應(yīng)式如圖1所示。

但是不同單糖在苯酚-硫酸法中的顯色程度、脫水難易、脫水產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性都存在差異，而金線蓮多糖是由多種單糖組成的雜多糖，且不同單糖經(jīng)過苯酚-硫酸法顯色后所得標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率差異較大，所以選擇合適的單糖作為標(biāo)準(zhǔn)參考十分重要。

本實驗分別比較了甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖與ARPS經(jīng)過苯酚-硫酸法反應(yīng)后的紫外-可見吸收譜圖，選擇與ARPS吸收譜圖最為接近的葡萄糖作為單糖標(biāo)準(zhǔn)品，首次對單糖標(biāo)準(zhǔn)品的選擇進(jìn)行系統(tǒng)研究，并用精制后的ARPS求得換算因子f，對不同試驗產(chǎn)地的金線蓮中多糖的含量進(jìn)行分析，研究金線蓮含量分析的可行方法，為金線蓮培植與進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1　單糖的苯酚-硫酸法顯色反應(yīng)

1　實驗材料

1.1　主要儀器

SZ-97自動三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；傾倒式粉碎機（上海淀久中藥機械制造有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；BS124S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；LXJ-IIB型低速大容量多管離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；FD-1冷凍干燥機（北京博醫(yī)康技術(shù)公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；島津2450型紫外可見分光光譜儀（島津國際貿(mào)易（上海）公司）。

1.2　試劑

氯仿（分析純，南京力盛化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇，正丁醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；苯酚（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；硫酸（分析純，衡陽市凱信化工試劑有限公司）；甘露糖，半乳糖（標(biāo)準(zhǔn)品，阿拉丁試劑公司）；鼠李糖（標(biāo)準(zhǔn)品，德國AlfaAesa公司）；葡萄糖（分析純，上海實驗試劑有限公司）；巖藻糖（分析純，廈門泰京生物技術(shù)有限公司）；二次蒸餾水（實驗室自制）。

1.3　金線蓮藥材

金線蓮藥材來源和培養(yǎng)模式如表1，2，藥材經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)系鑒定。來自福建永安林下金線蓮培養(yǎng)基地，栽培方式：金線蓮幼苗經(jīng)人工栽培4個月后移栽至試驗田。試驗地分為4個區(qū)（即樣一、樣二、樣三、對照區(qū)），每區(qū)為4平方米；每個區(qū)均施10次肥料；每隔10天施一次肥（陰雨天順延）；每次施1小包肥料，對照區(qū)只施相應(yīng)數(shù)量的清水，具體方案如表1。福建南靖金線蓮幼苗下土種植后，施不同量氨基酸培養(yǎng)，臺灣品種移至南靖栽培，方法同福建南靖，具體方案如表2。廣西的金線蓮為野生品。

表1　福建永安金線蓮施肥試驗方案

表2　福建南靖金線蓮的培養(yǎng)條件

2　實驗方法

2.1　金線蓮多糖的超聲提取及Sevage法去除蛋白

將不同試驗產(chǎn)地的金線蓮全草晾干，60℃真空干燥，粉碎，過80目篩。分別稱取不同的金線蓮粉末10 g，按料液比1∶20加水，60℃超聲提取30 min，4 200 r/m in離心15 m in，取上清液，濾渣加200 m L的水，重復(fù)提2次。合并3次離心后的上清液，過濾，低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至20 m L左右。

往濃縮后的上清液中加入20 m L的氯仿和5 m L正丁醇，劇烈振蕩20 m in，4 200 r/m in離心15 min，去除中間蛋白質(zhì)層，重復(fù)3次，加入3倍體積的無水乙醇，4℃過夜沉淀，去上清液，離心收集沉淀物，冷凍干燥至恒重，得到金線蓮粗多糖干浸膏，分別稱量13種金線蓮粗多糖干浸膏的質(zhì)量，并分別計算粗多糖干浸膏得率［15］。

2.2　吸收波長及單糖標(biāo)準(zhǔn)品的選擇

2.2.1 5%苯酚液的配制將固體苯酚于60℃的水浴中加熱溶解，取100 g左右于圓底燒瓶中，另加入0.1 g鋁片和0.05 g碳酸氫鈉，油浴200℃加熱蒸餾，收集餾分。稱取10 g所收集的餾分于190 g的蒸餾水中溶解，置于棕色瓶中備用。

2.2.2各單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液的配制文獻(xiàn)［16-17］研究表明，金線蓮中多糖主要是由葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖和巖藻糖組成，本實驗分別取上述5種單糖標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)苯酚-硫酸法顯色后，將其紫外-可見吸收譜圖與樣品溶液相比較，以選取最合適單糖標(biāo)準(zhǔn)品。

分別精密稱取甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖的單糖標(biāo)準(zhǔn)品50 mg于5個50 m L的容量瓶中，加水定容，即得5種1.0 mg/m L的單糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃冷藏備用。再分別精密稱取13種干浸膏50 mg于13個50 m L的容量瓶中，加水定容，即得1.0 mg/m L的樣品溶液，4℃冷藏備用。

2.2.3吸收波長的選擇精密量取13種1.0 mg/m L的樣品溶液1.00 m L于13個10 m L容量瓶中，加水定容搖勻，即得13種0.1 mg/m L的樣品溶液。再分別量取各樣品溶液1.00 m L于13支10 m L具塞試管中，各加入5%苯酚0.6 m L，濃硫酸6.0 m L，混勻，置于100℃水浴中，15 m in后取出，立即放入冰水浴中冷卻15 m in，室溫放置15 m in，用紫外-可見分光光度儀掃描300～700 nm的吸收曲線。

2.2.4不同單糖吸收譜圖繪制分別精密量取1.0 mg/m L的單糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.00 m L于10 m L容量瓶中，加水定容搖勻，即得5種0.1 mg/m L的單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。再分別量取各單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.00 m L按照“2.2.3”苯酚-硫酸法的反應(yīng)流程操作后，用紫外-可見分光光度儀掃描300～700 nm波長范圍內(nèi)的吸收譜圖。

2.3　換算因子f的測定

精密稱取經(jīng)高速逆流色譜法（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）純化過的金線蓮精制多糖10 mg，加入50 m L容量瓶中，加水定容搖勻即得0.2 mg/m L的儲備液。精密量取該儲備液0.50 m L，水補足至1.00 m L，按“2.2.3”的方法測定吸光度值，并按下式計算換算因子f。

其中W為所稱多糖質(zhì)量；C為供試液中葡萄糖濃度；D為稀釋體積。

3　結(jié)果與討論

3.1　單糖標(biāo)準(zhǔn)品的選擇

目前多糖測定基本以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，但是植物多糖是由不同單糖以不同的摩爾比例按一定的排列順序構(gòu)成的，而不同單糖在苯酚-硫酸法中的顯色程度、脫水難易、脫水產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性都存在差異，在無法獲得與待測多糖組成完全一致的標(biāo)準(zhǔn)多糖的條件下，選擇顯色后譜圖與待測多糖最為接近的標(biāo)準(zhǔn)單糖作為參考較為準(zhǔn)確，故本實驗對不同單糖與待測金線蓮多糖顯色后的譜圖作了對比，以期能夠更加準(zhǔn)確通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算待測多糖的含量。

按“2.2.3”實驗方法，得金線蓮多糖樣品溶液和不同單糖樣品溶液經(jīng)過苯酚-硫酸法顯色后的紫外-可見吸收譜圖，如圖2～3。各不同樣品溶液的吸收光譜圖形狀和峰位置幾乎相同（如圖2所示），最大吸收波長均為（482±0.5）nm。

圖2是葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液的吸收曲線，圖3是甘露糖、鼠李糖、半乳糖和巖藻糖的吸收曲線。由圖2，3顯示每條曲線主要有兩個吸收峰，分布在320 nm和480 nm左右，在480 nm附近的吸收峰為多糖經(jīng)苯酚-硫酸法顯色后的吸收峰，是重點考察對象。葡萄糖和樣品溶液兩個吸收峰分別位于320 nm和482 nm處，且320 nm的峰吸收值大于482 nm，肩峰的位置均是528 nm。鼠李糖和巖藻糖在478 nm處有最大吸收，甘露糖和半乳糖分別是在483 nm和482 nm處有最大吸收，另1個吸收峰皆為（320±1）nm，且478 nm 或482 nm或483 nm的峰吸收值大于320 nm，即長波長峰值大于短波長峰值，肩峰的位置分別是526 nm和528 nm。

由于不同單糖經(jīng)過苯酚-硫酸法后所得吸收曲線和最大吸收值位置不同，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率差異較大，并將直接影響到金線蓮多糖含量測定時的計算，所以選擇合適的單糖作為標(biāo)準(zhǔn)參考十分重要。綜上所述，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液的吸收曲線最為相似，所以實驗選用葡萄糖作為單糖標(biāo)準(zhǔn)品。這與文獻(xiàn)［18］研究蘆薈多糖的實驗結(jié)果不同，其可能是由于所研究藥材不一樣，得到的多糖樣品組成也不同。

3.2　苯酚-硫酸法測定波長的選擇

多糖經(jīng)濃硫酸水解產(chǎn)生單糖，單糖在濃硫酸加熱作用下，失去3分子水，生成糠醛類衍生物，糠醛類衍生物進(jìn)一步與苯酚合成有色物質(zhì)。實驗中發(fā)現(xiàn)，13種樣品溶液經(jīng)苯酚-硫酸法顯色后均是在（482±0.5）nm處有最大吸收，最終選擇482 nm作為測定時的吸收波長。在一定濃度范圍內(nèi)，顯色程度與糖的濃度成線性關(guān)系，以此來計算樣品中多糖的含量。

2　葡萄糖和ARPS經(jīng)過苯酚-硫酸法后的紫外-可見吸收譜圖

3　不同單糖經(jīng)過苯酚-硫酸法后的紫外-可見吸收譜圖

3.3　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取0.1 mg/m L的葡萄糖溶液0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 m L于6支10 m L具塞試管中，水補足至1.00 m L，按“2.2.3”苯酚-硫酸法反應(yīng)后，以0號管為空白對照，于482 nm的固定波長處測定吸光度，每濃度設(shè)重復(fù)測定3次。以葡萄糖濃度C（mg/m L）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示，并得到線性回歸方程：

A=7.513C+0.012 4，

R2=0.999 7。葡萄糖溶液的濃度在0.02～0.10 mg/m L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

4　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.4　精密度試驗

分別精密量取0.1 mg/m L的葡萄糖液0.50 m L 5份，0.1 mg/m L的南靖A3區(qū)樣品3溶液1.00 m L 5份于10 m L的具塞試管中，加水補足至1.00 m L，另取1.00 m L的水作為空白對照，按“2.2.3”苯酚-硫酸法反應(yīng)后于482 nm處分別測定吸光度。葡萄糖液的平均吸光度為0.398 4，RSD=0.96%，南靖A3區(qū)樣品溶液的平均吸光度為0.526 3，RSD=0.83%，表明該方法精密度良好。

3.5　穩(wěn)定性試驗

繼精密度測定后，每隔15 m in在482 nm處測定各管的吸光度，結(jié)果如表3所示，表明此方法在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.6　用精制的金線蓮多糖計算換算因子f

金線蓮多糖是由多種單糖組成的雜多糖，不同糖在苯酚-硫酸法中的顯色程度、脫水難易、脫水產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性都存在差異，因此單純以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線換算的測定結(jié)果會存在一定誤差。董群等［19］討論了在苯酚-硫酸法中多糖換算因子f的計算方法，但其需要先測定多糖的糖組成及準(zhǔn)確的摩爾比。另外，在一些文獻(xiàn)中雖有用精制多糖計算換算因子，但可能因精制多糖雜質(zhì)去除程度不夠，所得f值為2～4，使得所測含量乘以f后成倍增加。本實驗采用經(jīng)HSCCC精制后的金線蓮多糖來計算換算因子f的值，精制多糖組成上與待測樣品最為接近，且純度達(dá)到90%以上，可有效消除單純以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)計算多糖含量而帶來的誤差，測得f為1.06，結(jié)果更加接近真實值。

3.7　多糖的含量測定

精密量取1.0 mg/m L的13種樣品溶液各1.00 m L于13個10 m L容量瓶中，加水定容，即得13種0.1 mg/m L的樣品溶液。準(zhǔn)確移取0.1 mg/m L的各樣品溶液1.00 m L于10 m L具塞試管中，按“2.2.3”的方法測定吸光度值，每種溶液平行測定3管，每管設(shè)重復(fù)測定3次，并按下式計算多糖含量：

金線蓮藥材中多糖含量（%）=浸膏中含量×浸膏得率。

其中C為樣品中對應(yīng)葡萄糖濃度；D為稀釋體積；f為換算因子；W為原料干質(zhì)量。

表3　穩(wěn)定性試驗

表4　不同金線蓮中粗多糖干浸膏得率比較

按實驗方法“2.1”，計算得金線蓮粗多糖干浸膏得率如表4所示。結(jié)果表明永安對照區(qū)的得率最低，南靖A1區(qū)得率最高。

各個樣品中金線蓮多糖的含量如表5所示，浸膏中多糖含量40%～79%，藥材全草中多糖含量2.01%～17.49%，相差8倍多，表明不同栽培方式對藥材多糖含量有著重大的影響，且組培的金線蓮藥材中多糖含量普遍高于野生的，南靖產(chǎn)的金線蓮藥材中多糖含量普遍高于永安產(chǎn)的，臺灣品種金線蓮藥材中多糖含量也較高。

3.8　加樣回收試驗

加樣回收試驗結(jié)果如表6，表明該方法回收率良好。

表5　不同試驗產(chǎn)地金線蓮中多糖的含量測定結(jié)果（n=3）

表6　回收率試驗結(jié)果（n=9）

4　結(jié)論

在苯酚-硫酸法測定多糖含量中，由于不同單糖在苯酚-硫酸法中的顯色程度、脫水難易、脫水產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性都存在差異，而植物多糖是由不同單糖通過糖苷鍵連接而成的雜多糖，所以選擇合適的單糖作為標(biāo)準(zhǔn)參考十分重要。本實驗中的金線蓮多糖與葡萄糖經(jīng)過苯酚-硫酸法顯色后的紫外吸收譜圖最為相似，故選擇葡萄糖作為單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行含量計算。苯酚-硫酸法為多糖含量測定的經(jīng)典方法，方法學(xué)考察結(jié)果進(jìn)一步證明其適用于測定多糖的含量。不同產(chǎn)地及不同培養(yǎng)條件的金線蓮中多糖含量差異較大，藥材全草中多糖含量為2.01%～17.49%，相差8倍多，表明栽培方式對藥材多糖含量有著重大的影響，且人工栽培的金線蓮藥材中多糖含量普遍高于野生品種，但對于藥材的質(zhì)量評價還有待于對活性成分的進(jìn)一步研究。

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［18］陳偉，陳俊，林新華，等.庫拉索蘆薈多糖的分離純化和含量測定［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2005，22（2）：131-133.

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Selection of Standard M onosaccharide and Analysis of Polysaccharide Content in Anoectochilus Roxburghii from Different Experimental Provenances

Lin Shouer1，Huang Liying1，Wu Xingm ing2，Chen Yu3，Huang Qingzuo1，Huang Binglan1（1 College of Pharmacy，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)ujian Fuzhou 350004，China；2 Agricultural Bureau of Yong'an，Yong'an 366000；3 College of Preclinical Medicine Fujian Medical University）

Objective：To develop a method for determ ination of content of Anoectochilus roxburghii polysaccharide（ARPS），compare the contents of ARPS in the plants from various experimental provenances and select the optimal standard monosaccharide to calculate the ARPS content.M ethods：Crude ARPS was prepared by water extraction-alcohol precipitation method，and deproteinized by Sevage method.The optimal standard monosaccharide was selected by comparing the UV spectra of various monosaccharides and sample solutions. Meanwhile，the conversion factor（f）was calculated w ith refined ARPS，based on which the content of ARPS from various experimental provenances were determined by phenol-sulfuric acid method.Results：The ARPS content was calculated using glucose as the standard monosaccharide.The conversion factor f was 1.06 and the average recovery rate was 97.94%.The contents of ARPS in plants from various experimental provenances ranged from 2.01% to 17.49%.Conclusion：The method is simple，stable and feasible.The contents of ARPS in plants from various

experimental provenances were significantly different.The results provide a basis for the cultivation and further study of Anoectochilus roxburghii.

Anoectochilus roxburghii；Polysaccharide；Content Determination；Standard Monosaccharide；Experimental Provenances

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.07.004

福建省衛(wèi)生教育聯(lián)合攻關(guān)計劃項目（wkj-FJ-33）；福建省自然基金項目（2012J01368，2012J01363）

林守二，女，在讀碩士。研究方向：天然藥物分析。E-mail：893447163@qq.com
黃麗英，女，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：天然藥物分析。通訊作者E-mail：fjmuhly88@sina.com

2015-11-18）