順鉑聯(lián)合5-氟尿嘧啶對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的影響及其可能機(jī)制

王莉芹，瞿全新

(1.天津醫(yī)科大學(xué) 研究生院，天津 300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院濱海醫(yī)院 婦產(chǎn)科，天津 300480；3.天津第一中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，天津 300192)

順鉑聯(lián)合5-氟尿嘧啶對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的影響及其可能機(jī)制

王莉芹1，2Δ，瞿全新3

(1.天津醫(yī)科大學(xué) 研究生院，天津 300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院濱海醫(yī)院 婦產(chǎn)科，天津 300480；3.天津第一中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，天津 300192)

目的 探討順鉑聯(lián)合5-氟尿嘧啶對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞內(nèi)分泌治療的影響。方法 將人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞系進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)，選擇處于對數(shù)生長周期的細(xì)胞分為3組：5-氟尿嘧啶(5 mg/L)組、順鉑(5 mg/L)組、順鉑(5 mg/L)+5-氟尿嘧啶(5 mg/L)組(聯(lián)合組)，在給予相應(yīng)的藥物處理后進(jìn)行MTT法檢測細(xì)胞抑制率和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)采用免疫印跡法檢測Bcl-2和p65蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 聯(lián)合組、順鉑組與5-氟尿嘧啶組的細(xì)胞抑制率分別為(41.45±3.13)%、(25.20±3.09)%和(23.19±4.10)%，聯(lián)合組的抑制率明顯高于其他2組(P<0.05)。聯(lián)合組、順鉑組與5-氟尿嘧啶組的細(xì)胞凋亡率分別為(29.44±4.35)%、(5.74±1.12)%和(5.82±1.78)%，聯(lián)合組的凋亡率明顯高于其他2組(P<0.05)。聯(lián)合組、順鉑組與5-氟尿嘧啶組的Bcl-2相對表達(dá)量分別為(0.31±0.11)、(1.23±0.49)和(1.28±0.59)，p65相對表達(dá)量為(0.67±0.23)、(1.67±0.56)和(1.71±0.71)，聯(lián)合組的Bcl-2和p65相對表達(dá)量都明顯少于其他2組(P<0.05)。結(jié)論 順鉑+5-氟尿嘧啶在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中的聯(lián)合使用能促使細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與抑制Bcl-2和p65蛋白的表達(dá)相關(guān)。

順鉑；5-氟尿嘧啶；子宮內(nèi)膜癌；Ishikawa細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer)是一種高度惡性的腫瘤，是指原發(fā)于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤。同時(shí)多數(shù)子宮內(nèi)膜癌生長緩慢，但部分特殊病理類型的子宮內(nèi)膜癌發(fā)展很快，短期內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[1-3]。由于早期癥狀不典型，確診時(shí)多數(shù)患者的腫瘤已發(fā)展至晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，多數(shù)需要進(jìn)行化療[4]。順鉑(cisplatin )為鉑的金屬絡(luò)合物，能干擾DNA復(fù)制，是治療晚期腫瘤的一線藥物；順鉑用于DNA 鏈間及鏈內(nèi)交鏈，屬周期非特異性藥，作用類似烷化劑，能干擾DNA復(fù)制[5-6]。5-氟尿嘧啶(5-FU)是尿嘧啶的同類物，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為有效的氟尿嘧啶脫氧核苷酸后，以抗代謝物而起作用，可干擾DNA的合成[7-8]。為此本研究通過體外培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶，通過細(xì)胞增殖等實(shí)驗(yàn)反映順鉑+5-氟尿嘧啶的抑癌作用，并探討順鉑+5-氟尿嘧啶在子宮內(nèi)膜癌的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞及試劑：人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞系本實(shí)驗(yàn)室保存，常規(guī)凍存。10%國產(chǎn)胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、注射用順鉑(DDP，齊魯制藥公司)、注射用5-氟尿嘧啶(5-FU，紫竹制藥公司)、二甲基亞砜(DMSO)、DEPC焦碳酸二乙酯(美國Amresco公司)、AnnexinV-FITC試劑盒(武漢晶美生物工程有限公司)；MTT試劑；蛋白裂解液；BCA蛋白定量檢測試劑盒。

細(xì)胞培養(yǎng)條件：Ishikawa細(xì)胞用含100U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

溶液配制：順鉑溶液的配制：順鉑用含3%新生胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基溶解為1 mg/mL，避光4 ℃保存。5-氟尿嘧啶溶液的配制：配置方法同順鉑。

1.2 方法 研究時(shí)間為2014年2月～2015年2月。

1.2.1 細(xì)胞分組：將處于對數(shù)生長期的人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞系的細(xì)胞濃度調(diào)至2×105/mL，培養(yǎng)于96孔板內(nèi)(每孔加入量為100 μL)，在37 ℃、5%的CO2的孵箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為3組：5-氟尿嘧啶(5 mg/L)組、順鉑(5 mg/L)組、順鉑(5 mg/L)+5-氟尿嘧啶(5 mg/L)組(聯(lián)合組)，每組設(shè)置12個(gè)副孔進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測，處理細(xì)胞不同時(shí)間后，貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞倒凈培養(yǎng)液，用DEPC 處理過的PBS 洗滌一遍，進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2.2 檢測方法

① MTT實(shí)驗(yàn)：采用MTT法可檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖情況，將細(xì)胞按照1.2.1分組后給予對應(yīng)藥物處理，同時(shí)設(shè)置空白對照組(不給予任何干預(yù)措施)，24 h后加入MTT試劑，4 h后離心(12 000 r/min離心10 min)棄上清，細(xì)胞選擇150 μL的DMSO溶解，492 nm濾光片采用酶標(biāo)儀檢測吸光度，自動(dòng)計(jì)算得出細(xì)胞抑制率。

② 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：采用免疫熒光法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，將細(xì)胞按照1.2.1分組后以對應(yīng)藥物處理24 h后，采用4 ℃預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次后離心，將250 μL的2×PBS與250 μL的滅菌去離子水混勻后懸浮細(xì)胞，每孔再加入5 μL的Annexin V-FITC和3 μL的碘化丙啶，充分混勻后室溫下避光反應(yīng)5 min，置于流式細(xì)胞儀檢測相應(yīng)凋亡情況。

③ 免疫印跡法檢測Bcl-2和p65的表達(dá)：將細(xì)胞按照1.2.1分組后以對應(yīng)藥物處理24 h后收集細(xì)胞，置于Eppendorf管中，12 000 r/min離心1 min后去上清，收集沉淀物進(jìn)行蛋白提取，嚴(yán)格按照裂解液說明書步驟進(jìn)行細(xì)胞核和總蛋白的提取。采用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度，按1:4的比例加入5×上樣緩沖液，100 ℃沸水中煮10 min，聚丙烯酰胺凝膠上電泳后轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉1 h，β-actin、Bcl-2、p65的一抗稀釋液孵育4 ℃搖床過夜，TBST充分洗膜后加入二抗室溫下孵育1 h，TBST洗膜后，滴加ECL顯影液進(jìn)行成像，Image J軟件進(jìn)行灰度分析。β-actin作為Bcl-2、p65的內(nèi)參進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞抑制情況對比 經(jīng)過檢測，聯(lián)合組、順鉑組與5-氟尿嘧啶組的細(xì)胞抑制率分別為(41.45±3.13)%、(25.20±3.09)%和(23.19±4.10)%，3組細(xì)胞抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合組的抑制率明顯高于其他2組(P<0.05)。見表1。

表1 不同組別的人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞系抑制率情況對比Tab.1 Comparison of inhibition ratio of endocrine Ishikawa cells among

*P<0.05，與順鉑組相比，compared with DDP group；#P<0.05，與5-氟尿嘧啶組相比，compared with 5-FU group

2.2 細(xì)胞凋亡情況對比 經(jīng)過檢測，聯(lián)合組、順鉑組與5-氟尿嘧啶組的細(xì)胞凋亡率分別為(29.44±4.35)%、(5.74±1.12)%和(5.82±1.78)%，3組細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合組的凋亡率明顯高于其他2組(P<0.05)。見表2。

表2 不同組別的人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞系凋亡情況對比Tab.2 Comparison of apoptosis of endocrine Ishikawa cells among each group (±s，%)

*P<0.05，與順鉑組相比，compared with DDP group；#P<0.05，與5-氟尿嘧啶組相比，compared with 5-FU group

2.3 Bcl-2和p65的表達(dá)情況對比 經(jīng)過檢測，聯(lián)合組、順鉑組與5-氟尿嘧啶組的Bcl-2相對表達(dá)量分別為(0.31±0.11)、(1.23±0.49)和(1.28±0.59)，3組Bcl-2相對表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，p65相對表達(dá)量為(0.67±0.23)、(1.67±0.56)和(1.71±0.71)，3組p65相對表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合組的Bcl-2和p65相對表達(dá)量都明顯少于其他2組(P<0.05)。見表3。

表3 不同組別的人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞系Bcl-2和p65的表達(dá)情況對比Tab.3 Comparison of Bcl-2 and p65 expressions in endocrine Ishikawa cells among each group (±s，%)

*P<0.05，與順鉑組相比，compared with DDP group；#P<0.05，與5-氟尿嘧啶組相比，compared with 5-FU group

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是指原發(fā)于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，是最常見的婦科惡性腫瘤之一[9-10]。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)行為重要的方面，也是導(dǎo)致治療失敗的最主要原因[11]。同時(shí)晚期子宮內(nèi)膜癌基本失去了手術(shù)治療機(jī)會(huì)，化療為治療的重要手段，但既往研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌在接受單藥化療治療時(shí)會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的化療抵抗性，大大降低了治療的效果，為此選擇合理的化療方案意義重大[12-14]。

5-氟尿嘧啶(5-Fu)為常見的抗代謝類抗腫瘤藥，可在體內(nèi)先轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟-2-脫氧尿嘧啶核苷酸，可抑制DNA的生物合成；也可阻止尿嘧啶和乳清酸摻入RNA，達(dá)到抑制RNA合成的作用。順鉑是治療多種實(shí)體瘤的一線用藥，為鉑的金屬絡(luò)合物，主要作用于DNA鏈間及鏈內(nèi)交鏈，干擾DNA復(fù)制[15-16]。本研究顯示聯(lián)合組、順鉑組與5-氟尿嘧啶組的細(xì)胞抑制率分別為(41.45±3.13)%、(25.20±3.09)%和(23.19±4.10)%，聯(lián)合組的抑制率明顯高于其他2組(P<0.05)，表明藥物聯(lián)合使用可發(fā)揮協(xié)同作用，抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

近年來隨著子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的增多和年輕化趨勢，積極的化療能有效控制復(fù)發(fā)，從而提高患者的生存率和生活質(zhì)量[17]。順鉑與5-氟尿嘧啶呈明顯的劑量療效依賴特點(diǎn)，但是劑量過大會(huì)導(dǎo)致毒副反應(yīng)增加，限制了患者總的存率的明顯提高[18]。有研究發(fā)現(xiàn)在低濃度順鉑作用下，DNA的駐留長度可從大約52 nm急劇減小為大約15 nm。而在高濃度DDP情況下，發(fā)現(xiàn)了DNA的成環(huán)和凝聚現(xiàn)象[19]。本研究顯示聯(lián)合組、順鉑組與5-氟尿嘧啶組的細(xì)胞凋亡率分別為(29.44±4.35)%、(5.74±1.12)%和(5.82±1.78)%，聯(lián)合組的凋亡率明顯高于其他2組(P<0.05)，也表明藥物聯(lián)合使用有化療的增敏作用，對于各種化療藥物的細(xì)胞毒作用產(chǎn)生抵抗。

隨著腫瘤分子生物學(xué)的進(jìn)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種信號(hào)分子在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、侵襲、血管生成過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。比如p65轉(zhuǎn)入核內(nèi)時(shí)可促進(jìn)下游抗凋亡蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而降低腫瘤細(xì)胞的放療敏感性[20]。Bcl-2則通過阻止細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞色素C對caspase蛋白酶的激活，以及促進(jìn)谷胱甘肽進(jìn)入細(xì)胞核，抑制核內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而發(fā)揮抗凋亡作用，下調(diào)Bcl-2和p65蛋白的表達(dá)有利于增加腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[8]。本研究顯示聯(lián)合組、順鉑組與5-氟尿嘧啶組的Bcl-2相對表達(dá)量分別為(0.31±0.11)、(1.23±0.49)和(1.28±0.59)，p65相對表達(dá)量為(0.67±0.23)、(1.67±0.56)和(1.71±0.71)，聯(lián)合組的Bcl-2和p65相對表達(dá)量都明顯少于其他2組(P<0.05)，表明藥物聯(lián)合使用可以有效抑制p65的核內(nèi)轉(zhuǎn)移從而下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá)，顯著增加子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡率。

總之，順鉑+5-氟尿嘧啶在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中的聯(lián)合使用能促使細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與抑制Bcl-2和p65蛋白的表達(dá)相關(guān)。

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(編校：王儼儼)

Effect of cisplatin combined with 5- fluorouracil on endocrine Ishikawa cells in endometrial cancer and its possible mechanism

WANG Li-qin1,2Δ, QU Quan-xin3

(1.School of Graduate, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, Binhai Hospital of Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 300480, China; 3.Department of Obstetrics and Gynecology, Tianjin First Central Hospital, Tianjin 300192, China)

ObjectiveTo investigate the effect of cisplatin and 5- fluorouracil on endocrine Ishikawa cells in the treatment of endometrial cancer.MethodsThe human endometrial cancer cell line Ishikawa were selected, at the logarithmic growth period, the cells were divided into three groups of 5-fluorouracil (5 mg/L) group, cisplatin (5 mg/L) group and cisplatin (5 mg/L) combined with fluorouracil (5 mg/L) group (combined group).After treated with corresponding drugs treatment, the cell viability was detected by MTT, the apoptosis was detected by flow cytometry, and the Bcl-2 and p65 expressions cells were detected by Western blot.ResultsThe inhibitory rate of combined group, cisplatin group and 5-fluorouracil group were (41.45±3.13)%, (25.20±3.09)% and (23.19±4.10)% respectively, and the inhibitory rate in the combined group was significantly higher than that of the other two groups (P<0.05).The apoptosis rate of the combined group, cisplatin group and 5- group were (29.44±4.35)%, (5.74±1.12)% and (5.82±1.78)% respectively, and the apoptosis rate in the combined group was significantly higher than that of the other two groups (P<0.05).The Bcl-2 relative expression in the combined group, cisplatin group and 5-fluorouracil group were (0.31±0.11), (1.23±0.49) and (1.28±0.59), the p65 expression were (0.67±0.23), (1.67 ±0.56) and (1.71±0.71), combined group of Bcl-2 and p65 relative expressions were obviously less than that of the other two groups (P<0.05).ConclusionCisplatin combined with 5- fluorouracil on endocrine Ishikawa cells in the treatment of endometrial cancer could promote cell apoptosis, inhibit the cell proliferation, and its mechanism may be related to the inhibition of Bcl-2 and p65 protein expressions.

cisplatin; 5- fluorouracil; endometrial carcinoma; Ishikawa cells; apoptosis

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.08.010

王莉芹，通信作者，女，本科，主任醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤,E-mail：sdlclsxia@126.com。

R737.33

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