c-Met適配體抑制劑的研究進(jìn)展

歐陽生群，胡波，繆雨青，吳隨一，王梁華Δ，秦文星Δ

(1.第二軍醫(yī)大學(xué) 基礎(chǔ)部 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，上海 200433；2.上海長(zhǎng)征醫(yī)院 腫瘤科，上海 200003;3.第二軍醫(yī)大學(xué) 海醫(yī)系，上海 200433)

c-Met適配體抑制劑的研究進(jìn)展

歐陽生群1，胡波1，繆雨青2，吳隨一3，王梁華1Δ，秦文星2Δ

(1.第二軍醫(yī)大學(xué) 基礎(chǔ)部 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，上海 200433；2.上海長(zhǎng)征醫(yī)院 腫瘤科，上海 200003;3.第二軍醫(yī)大學(xué) 海醫(yī)系，上海 200433)

c-Met是酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase，RTKs)家族中的一員，其過表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后以及耐藥性緊密相關(guān)。因此，c-Met是一個(gè)潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)，其抑制劑的研究也已成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)。利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX) 技術(shù)篩選到的c-Met適配體，能夠以較高的親和力特異性拮抗或激活c-Met?？筩-Met適配體經(jīng)優(yōu)化改造后，有望發(fā)展成新一代c-Met抑制劑，并成為潛在的腫瘤靶向治療藥物。

c-Met；抑制劑；腫瘤靶向治療；適配體

人c-Met基因位于染色體7q21-q31，是一種高度保守的原癌基因，生理情況下僅在上皮細(xì)胞中表達(dá)。c-Met蛋白是由α鏈和β鏈經(jīng)二硫鍵連接形成的跨膜糖蛋白，起源于間質(zhì)細(xì)胞所產(chǎn)生的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF，又名離散因子)是其唯一已知的配體。酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase，RTKs)靶向藥物，如伊馬替尼、西妥昔單抗和吉非替尼等已被廣泛用于某些腫瘤的靶向治療。c-Met作為RTKs家族中的一員，其過表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后以及耐藥性緊密相關(guān)。因此，c-Met也是一個(gè)潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)，其抑制劑的研究現(xiàn)已成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)[1-2]?？筩-Met適配體能夠特異性地與c-Met以較高的親和力結(jié)合，但是不能誘導(dǎo)c-Met的二聚化，即抗c-Met適配體無法激活c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并調(diào)控細(xì)胞的行為。因此，抗c-Met適配體經(jīng)優(yōu)化改造后，有望發(fā)展成新一代c-Met抑制劑，并成為潛在的腫瘤靶向治療藥物。本文對(duì)c-Met這一腫瘤治療靶點(diǎn)的特征及其適配體抑制劑的研究進(jìn)展作一綜述。

1 c-Met分子生物學(xué)

1.1 c-Met是典型的酪氨酸激酶受體 c-Met基因有20個(gè)內(nèi)含子和21個(gè)外顯子，編碼的蛋白質(zhì)由Cooper等[3]首次從人骨肉瘤細(xì)胞中分離出來，并被命名為TPR-MET。c-Met是分子量為190kDa的異二聚體，其中，α鏈全部在胞外，β鏈為包含胞外區(qū)(SEMA、PSI和IPT)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的Ⅰ型跨膜蛋白。c-Met胞外部分可與HGF結(jié)合(IPT和SEMA為其結(jié)合位點(diǎn))，胞內(nèi)區(qū)具有酪氨酸激酶活性，可在多個(gè)位點(diǎn)磷酸化。其中，磷酸化的Y1349 和Y1356是絕大多數(shù)生物學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)，對(duì)c-Met活性的調(diào)節(jié)具有重要作用[4-5]。c-Met的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 c-Met結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 c-Met structure

c -Met參與許多生理和病理過程，包括胚胎發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)的形成等；出生后，c -Met/HGF通路的激活與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、肝再生、腎再生以及表皮再生密切相關(guān)；另外，c-Met的過量表達(dá)將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差以及耐藥性等[6-8]。

1.2 c-Met信號(hào)通路及活化 c-Met信號(hào)通路的異?；罨梢酝ㄟ^多種途徑實(shí)現(xiàn)，例如：生殖細(xì)胞或體細(xì)胞突變、染色體重排以及Met/HGF蛋白表達(dá)量增加等，這些途徑既可以單獨(dú)作用，也可以聯(lián)合作用。

在分子水平上，c-Met信號(hào)起始于HGF和c-Met在細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)域的特異性結(jié)合，引起c-Met的二聚化，并導(dǎo)致Y1234 和Y1235的磷酸化和兩個(gè)多底物錨定位點(diǎn)Y1349和Y1356的磷酸化，從而錨定調(diào)節(jié)底物。c-Met的活化使得接頭蛋白Gab1、Grb2、Shc和c-Cbl磷酸化，從而激活PI3K、STAT、ERK1、ERK2和FA K等通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移和侵襲等過程[9-10]。

2 c-Met過表達(dá)是多種腫瘤的共同特征

c-Met屬于高度保守的原癌基因。在人類惡性腫瘤中，其發(fā)生突變的可能性相對(duì)較小，主要是野生型c-Met基因的過表達(dá)。Drebber等[11]檢測(cè)了114例胃癌患者的手術(shù)標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)有73.7%的患者c-Met過表達(dá)。另外，單因素及多因素分析結(jié)果表明c-Met的過表達(dá)與預(yù)后不良密切相關(guān)。Tsai等[12]用免疫組化法檢測(cè)了69例宮頸腺癌，結(jié)果顯示c-Met在宮頸腺癌中的陽性表達(dá)率為30.4%，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)c-Met的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有明顯的相關(guān)性。Jacobsen等[13]發(fā)現(xiàn)c-Met過表達(dá)與前列腺癌惡性程度相關(guān)。Chen等[14]用免疫組化法檢測(cè)了93例口腔鱗癌中c-Met的表達(dá)，結(jié)果顯示c-Met在口腔鱗癌中的表達(dá)明顯高于口腔上皮角化過度組與上皮異常增生組，并與腫瘤分級(jí)、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外，c-Met的過表達(dá)與腫瘤的耐藥性有關(guān)。在c-Met高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌動(dòng)物模型中，無論表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)狀態(tài)如何，都表現(xiàn)出對(duì)EGFR抑制劑的耐藥性[15]。同時(shí)，許多研究表明在某些腫瘤中c-Met可以作為預(yù)后指標(biāo)[16-17]。c-Met在84例腫瘤組織中的分布[4]見圖2。

圖2 c-Met在84例腫瘤組織中的分布Fig.2 Distribution of c-Met in 84 tumor tissues

可見，c-Met在多種腫瘤細(xì)胞中均有過量表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后以及耐藥性緊密相關(guān)。

3 c-Met適配體抑制劑

c-Met的過表達(dá)在腫瘤病理過程中發(fā)揮著如此重要的作用，其抑制劑的研究也因此成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前，針對(duì)c-Met的抑制劑主要有小分子抑制劑、生物性抑制劑、抗c-Met抗體和HGF拮抗劑[18-23]，主要的c-Met抑制劑的研究進(jìn)展見表1。近年來，一類新的c-Met抑制劑——適配體也取得了突破性進(jìn)展。

表1 部分c-Met抑制劑的研究進(jìn)展Tab.1 Progress of partial c-Met inhibitors

3.1 適配體簡(jiǎn)介 適配體是能夠特異性地與靶標(biāo)以較高的親和力結(jié)合的單鏈寡核苷酸，可以通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技術(shù)從體外篩選獲得。適配體通過分子內(nèi)相互作用，如氫鍵，范德華力和疏水作用等折疊成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，其與靶標(biāo)形成的復(fù)合物的解離常數(shù)通常在pmol/L～nmol/L，因此，適配體也被稱為“化學(xué)抗體”。然而，與抗體相比，適配體的優(yōu)點(diǎn)主要有：純度高，批次間的差異小；合成簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠；沒有免疫原性等。

截止2016年7月，在PubMed數(shù)據(jù)庫中，已經(jīng)有6000多篇關(guān)于適配體的文章。適配體作為一種新型的分子識(shí)別元件，可以用于醫(yī)療診斷、生物影像、藥物輸送系統(tǒng)和新物開發(fā)等各個(gè)領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景[24-25]。

3.2 c-Met適配體 c-Met作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)，其適配體的研究因此吸引了研究者們的廣泛關(guān)注。2011年，Boltz等[26]首次報(bào)道了c-Met適配體的篩選，隨后研究者們又對(duì)該適配體進(jìn)行了一系列研究，見表2。

表2 c-Met適配體的研究進(jìn)展Tab.2 Progress of anti-c-Met aptamers

3.2.1 HGF競(jìng)爭(zhēng)性c-Met適配體：在腫瘤免疫治療中，抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)發(fā)揮著重要作用[27]。Boltz等為了定向殺死腫瘤細(xì)胞，首次構(gòu)建了類似于ADCC的二價(jià)適配體。在該研究中，c-Met作為腫瘤治療的靶點(diǎn)，被選為腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物，c-Met適配體應(yīng)運(yùn)而生。作者以c-Met-Fc為靶標(biāo)，利用filter-SELEX，總共進(jìn)行了12輪篩選。為了模擬生理環(huán)境，作者采用杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)孵育。在篩選過程中，作者通過減少文庫的濃度和增加tRNA的濃度來提高篩選壓力，通過引入負(fù)篩來提高適配體的特異性。在最終得到的適配體中，CLN0003(GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGT CGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGC TCC)的親和力最高，為91pM。此外，CLN0003能和表達(dá)c-Met的GTL-16細(xì)胞、MKN-45細(xì)胞以及EBC-1細(xì)胞結(jié)合，但不能和Fc以及不表達(dá)c-Met的Jurkat E6.1細(xì)胞結(jié)合。

2014年，Ueki等[28]利用mfold軟件預(yù)測(cè)了CLN0003的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并將其分為3個(gè)部分：SL1、G-Loop和SL2(140 mM Na+， 21 ℃)， 見圖3。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SL1能夠特異性地與表達(dá)c-Met的SNU-5細(xì)胞結(jié)合，而且其親和力和CLN0003相當(dāng)。SL1由G環(huán)和莖組成，對(duì)其進(jìn)一步研究的結(jié)果表明SL1是最小結(jié)合域。c-Met磷酸化水平的變化情況和細(xì)胞行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了SL1的功能，即干擾HGF與c-Met的結(jié)合，從而抑制癌細(xì)胞的遷移。SL1的堿基序列為：ATCAGGCTGGATGGT AGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGAT。

圖3 CLN0003二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖紅色區(qū)域?yàn)镾L1，藍(lán)色區(qū)域?yàn)镾L2，綠色區(qū)域?yàn)镚-loopFig.3 Predication of CLN0003 secondary structure red zone is SL1, blue zone is SL2, green zone is G-loop

2015年，Stephan等[29]利用CLN0003構(gòu)建了類似于抗體-藥物偶聯(lián)物(antibody drug conjugates，ADCs)的Aptamer-Fc復(fù)合物，并獲得了既能引起免疫效應(yīng)又能穩(wěn)定存在的新的抗c-Met適配體。

3.2.2 HGF非競(jìng)爭(zhēng)性c-Met適配體：同年，Piater等[30]同樣利用filter-SELEX(篩選過程同CLN0003)，經(jīng)過16輪篩選以后獲得了c-Met RNA適配體。其中，親和力最高的是CLN64(GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGCTAGTTACCAGGTGTAGCTGA CCAAGCGGATGTGTGTTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC)，為 1 nM。 此外，CLN64不能和IgG1-Fc以及酪氨酸激酶受體EGFR結(jié)合。

與CLN0003相比，CLN64也能以較高的親和力與c-Met結(jié)合，但是CLN0003和HGF之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，而CLN64不能抑制HGF和c-Met的結(jié)合。

3.2.3 HGF類似c-Met適配體:基于c-Met激活的機(jī)制，Ueki等[31]假設(shè)二聚化的SL1即Di-SL1能夠與2個(gè)c-Met結(jié)合，從而使c-Met二聚化并呈活化狀態(tài)。c-Met下游磷酸化的出現(xiàn)以及細(xì)胞的分散和遷移證明Di-SL1可以作為HGF類似物。雖然此為關(guān)于c-Met激活劑的研究，但從另一方面來說，該研究也預(yù)示了SL1的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

c-Met有2個(gè)HGF結(jié)合位點(diǎn)，分別是IPT和SEMA。不管HGF是否有活性，其氨基端(NK1)都能夠以高親和力與IPT3和IPT4結(jié)合。然而，只有在活化以后，其SPH才能和c-Met的SEMA結(jié)合，而且親和力有所下降。適配體CLN0003和CLN64都能夠以高親和力特異性結(jié)合在c-Met的胞外配體結(jié)合域，而且2種適配體的結(jié)合位點(diǎn)有重疊，其中，CLN0003覆蓋了CLN64的結(jié)合位點(diǎn)。但是，CLN0003和HGF存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，而CLN64不能抑制HGF和c-Met的結(jié)合[30]。另外，雖然2種適配體都能夠和c-Met結(jié)合，但是都不能激活c-Met下游信號(hào)通路，只有Di-SL1，即二聚化的、優(yōu)化后的CLN0003能夠激活c-Met下游信號(hào)。

近年來關(guān)于c-Met適配體的研究提示：特異性強(qiáng)、親和力高、合成簡(jiǎn)便、易于修飾和經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的抗c-Met適配體通過進(jìn)一步修飾和改造后有望成為新一代c-Met抑制劑，并發(fā)展成腫瘤靶向治療的有效藥物。

3.3 抗c-Met適配體的發(fā)展?jié)摿?一方面，適配體是核酸分子。沒有修飾的適配體，特別是RNA適配體，在生物體內(nèi)易被降解，這也是阻礙適配體研究領(lǐng)域蓬勃發(fā)展的一個(gè)重要原因[32-35]。另一方面，適配體修飾簡(jiǎn)便，而且能夠進(jìn)行多種修飾，能夠在一定程度上提高適配體的穩(wěn)定性。另外，新型核苷酸的使用以及與抗體等的偶聯(lián)也能夠增強(qiáng)適配體在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性[36-38]。2004年第一個(gè)適配體藥物哌加他尼鈉(macugen)[39]的上市說明：適配體經(jīng)過合理的修飾與改造后，有成為藥物的巨大潛力。盡管抗c-Met適配體的研究還處于初級(jí)階段，但是隨著研究的深入以及適配體領(lǐng)域的逐漸發(fā)展和進(jìn)步，抗c-Met適配體有望成為新一代抗腫瘤藥物。

4 小結(jié)

c-Met參與許多生理與病理過程，其過表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移以及耐藥性密切相關(guān)。c-Met作為一個(gè)潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)，其抑制劑的研究現(xiàn)已成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前，針對(duì)c-Met的抑制劑主要有小分子抑制劑、生物性抑制劑、抗c-Met抗體和HGF拮抗劑。其中，最有潛力的是小分子抑制劑和單克隆抗體。自1990年Tuerk和Ellington發(fā)現(xiàn)適配體以來，適配體的研究發(fā)展迅速。2004年，美國食品與藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)了第一個(gè)適配體藥物——哌加他尼鈉(Macugen)的上市，這是適配體研究領(lǐng)域的里程碑?？筩-Met核酸適配體作為一種單鏈寡核苷酸，具有合成簡(jiǎn)便、易于修飾、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)，而且能夠特異性地與c-Met以較高的親和力結(jié)合，有望成為新一代c-Met抑制劑，并發(fā)展成腫瘤靶向治療的有效藥物，從而使更多腫瘤患者受益。

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(編校：王儼儼)

作 者 簡(jiǎn) 介

王梁華，教授、碩士研究生導(dǎo)師，目前任職于第二軍醫(yī)大學(xué)，為生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室副主任。

王梁華教授承擔(dān)包括國家重大新藥創(chuàng)制、國家自然科學(xué)基金、國家863計(jì)劃、國家科技攻關(guān)計(jì)劃、上海市科委重大項(xiàng)目等共28項(xiàng)，其中12項(xiàng)為課題負(fù)責(zé)人。研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)藥物及生物毒素。完成了2個(gè)國家一類新藥的研制；發(fā)表學(xué)術(shù)論文近百篇，主編、副主編論著11部，參編13部。參與完成的國家一類新藥新型重組腫瘤壞死因子α衍生物D3a的研制(2003年獲一類新藥證書)，相關(guān)專利獲中國發(fā)明專利金獎(jiǎng)，所完成的“九五”國家重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃獲國家科技部、國家財(cái)政部、國家計(jì)委、國家經(jīng)貿(mào)委聯(lián)合頒發(fā)的優(yōu)秀成果獎(jiǎng)。負(fù)責(zé)研制的治療用生物制品第一類新藥重組人凋亡素2配體已完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)，發(fā)表相關(guān)論文18篇，3項(xiàng)中國發(fā)明專利已授權(quán)。自編2套分子生物學(xué)軟件(已獲著作權(quán)登記證書)，從理論與實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了死亡受體6相互作用的一系列蛋白中的一些分子可能作為死亡受體的潛在配體。現(xiàn)為中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)理事，該會(huì)海洋分會(huì)秘書長(zhǎng)，中國微生物學(xué)會(huì)干擾素及細(xì)胞因子專業(yè)委員會(huì)委員兼秘書等；《藥物生物技術(shù)》編委，《中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)雜志》《第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)》《中國腫瘤生物治療雜志》等審稿人。

DOI：10.3969/j.issn.1005-1678.2016.08.005

Recent progress of aptamer inhibitors targeting c-Met

OUYANG Sheng-qun1, HU Bo1, MIAO Yu-qing2, WU Sui-yi3, WANG Liang-hua1Δ?, QIN Wen-xing2Δ?

(1.Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Medical Sciences, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China;2. Department of Oncology, Shanghai Changzheng Hospital, Shanghai 200003, China;3.Faculty of Naval Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

c-Met is one member of the receptor tyrosine kinases (RTKs).It is closely related between the over-expression of c-Met and a wide variety of tumor occurrence, development, invasion, metastasis, prognosis and drug resistance.Therefore, c-Met is a potential target for oncotherapy, and researches on its inhibitors have become a hot spot in the field of tumor treatment.Aptamers targeting c-Met are gained from systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX).They can bind to c-Met with high specificity and affinity, resulting in the activation or inhibition of c-Met.We envision that anti-c-Met aptamers would be ideal new c-Met inhibitors after optimization, and could be developed into potential targeted drugs for cancers.

c-Met; inhibitor; targeted oncotherapy; aptamers

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.08.004

歐陽生群，女，碩士，研究方向：海洋生物毒素、適配體，E-mail:ouyangjoanna@163.com；王梁華，通信作者，男，博士，副教授，研究方向：海洋生物毒素、生物技術(shù)藥物、適配體，E-mail:wsh928@hotmail.com；秦文星，共同通信作者，男，博士，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤化療，E-mail:15921128566@139.com。

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