辣椒及辣椒提取物中黃曲霉毒素含量的測(cè)定及遷移規(guī)律分析

周 麗，楊清山*，連運(yùn)河，王 磊，張曉芳（1.河北省天然色素工程技術(shù)研究中心，河北 邯鄲 057250；2.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北 邯鄲 057250）

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辣椒及辣椒提取物中黃曲霉毒素含量的測(cè)定及遷移規(guī)律分析

周 麗，楊清山*，連運(yùn)河，王 磊，張曉芳
（1.河北省天然色素工程技術(shù)研究中心，河北 邯鄲 057250；2.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北 邯鄲 057250）

利用免疫親和層析凈化高效液相色譜法對(duì)印度辣椒和新疆辣椒及其辣椒提取物中的黃曲霉毒素（B1、B2、G1、G2）進(jìn)行檢測(cè)及遷移規(guī)律分析。結(jié)果表明，不同來(lái)源的辣椒和辣椒提取物中存在不同程度的黃曲霉毒素B1（0.93～51.53 μg/kg）污染，在辣椒生產(chǎn)過(guò)程中，黃曲霉毒素部分遷移到辣椒油樹(shù)脂當(dāng)中，辣椒紅中幾乎沒(méi)有。這一結(jié)果說(shuō)明生產(chǎn)過(guò)程中黃曲霉毒素污染主要來(lái)源于辣椒原料且易遷移到辣椒油樹(shù)脂中。在生產(chǎn)中要控制產(chǎn)品中黃曲霉毒素的污染，首要的是做到控制好原料。

黃曲霉毒素（B1、B2、G1、G2）；辣椒提取物；免疫親和層析凈化高效液相色譜法；測(cè)定；遷移規(guī)律

黃曲霉毒素是由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的代謝產(chǎn)物，主要包括B1、B2、G1、G2、M1、M2六種。黃曲霉毒素具有致畸、致癌、致誘變作用，而黃曲霉毒素Bl的毒性和致癌性最強(qiáng)，被稱為第一大類致癌物，其毒性是砒霜的68 倍［1］，能誘發(fā)人和動(dòng)物的肝癌。近年來(lái)黃曲霉毒素Bl污染事件的發(fā)生，已引起世界各國(guó)及消費(fèi)者對(duì)食品安全的關(guān)注［2-3］。目前對(duì)黃曲霉毒素的研究主要集中在分析方法，如高效液相色譜［4-6］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜［7-8］、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定［9］、分子［10］檢測(cè)方法，以及其危害［11-14］、預(yù)防［15-16］及控制［17-18］等方面，對(duì)其在辣椒提取物中的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

辣椒提取物是以辣椒（Capsicum annuum L.）［19］為原料，經(jīng)粉碎、提取、分離等工序制備而成的辣椒紅、辣椒油樹(shù)脂等產(chǎn)品。辣椒紅主要作為著色劑添加到食品當(dāng)中，而辣椒油樹(shù)脂作為增味劑添加到食品中［20］。經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，我國(guó)已成為世界上最大的辣椒提取物產(chǎn)銷(xiāo)國(guó)，每年有8%～10%以上的辣椒用于制備辣椒提取物，辣椒紅年產(chǎn)量3 500 t，占國(guó)際市場(chǎng)份額的70%以上。因此，辣椒及辣椒提取物的食品安全問(wèn)題關(guān)系到消費(fèi)者健康和企業(yè)發(fā)展［21-23］。

辣椒在采摘、晾曬、貯藏、運(yùn)輸、加工等過(guò)程中，由于環(huán)境條件及水分控制等問(wèn)題，極易引起霉變及霉菌毒素污染［24-25］，因而辣椒提取物中極有可能由于加工過(guò)程中的毒素遷移而污染。開(kāi)展辣椒提取加工過(guò)程中黃曲霉毒素的監(jiān)測(cè)與控制研究，闡明黃曲霉毒素在辣椒提取加工過(guò)程中的含量變化、遷移規(guī)律，可以為開(kāi)發(fā)黃曲霉毒素控制技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒，產(chǎn)地印度、新疆。辣椒紅，色價(jià)E1%1 cm460 nm：50～300。辣椒經(jīng)粉碎、提取、分離而得到的油狀黏稠液體。辣椒油樹(shù)脂，辣度：1%～30%。辣椒經(jīng)粉碎、提取、分離而得到的油樹(shù)脂。以上樣品均由晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司提供。

標(biāo)準(zhǔn)品：黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2（純度＞99%） 美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）美國(guó)Fisher公司；磷酸氫二鉀（分析純） 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；氯化鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純） 天津市津北精細(xì)化工有限公司；氯化鉀（優(yōu)級(jí)純） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；碘（分析純）天津大茂化學(xué)試劑有限公司；濃鹽酸（分析純） 萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠；實(shí)驗(yàn)室用水均為Milli-Q超純水，每日更新。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀（配熒光檢測(cè)器） 美國(guó)Agilent公司；柱后衍生系統(tǒng) 美國(guó)Pickering Laboratories公司；AL104分析天平 瑞士Mettler公司；拍打式無(wú)菌均質(zhì)器（8 次/s） 法國(guó)Interscience公司；免疫親和柱（黃曲霉毒素B1） 北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；玻璃纖維濾紙（直徑110 mm，孔徑1.5 μm） 英國(guó)GE Healthcare公司；Master-S UVF超純水機(jī) 上海和泰儀器有限公司；0.22 μm針式過(guò)濾膜 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜分離條件

ODS C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；進(jìn)樣量20 μL；柱溫40 ℃；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水（22∶22∶56，V/V）溶液；流速0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm；增益值：PMT14。

1.3.2 柱后衍生化條件

衍生溶液：體積分?jǐn)?shù)10%甲醇溶液（含0.05%碘）；泵洗液：體積分?jǐn)?shù)20%甲醇溶液；衍生溶液流速0.3 mL/min；衍生反應(yīng)溫度95 ℃。

1.3.3 使用溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

磷酸緩沖鹽（phosphate buffer saline，PBS）：稱取7.9 g氯化鈉、1.8 g磷酸氫二鉀、0.24 g磷酸二氫鉀、0.2 g氯化鉀、900 mL水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，最后用水稀釋至1 000 mL，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

10%甲醇-PBS：取10 mL甲醇溶液，加入PBS并定容至100 mL。

黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：用甲醇溶液分別配制成80 μg/kg的黃曲霉毒素B1、G1和20 μg/kg的黃曲霉毒素B2、G2標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取適量的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇溶液稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

柱后衍生溶液（10%甲醇、0.05%碘溶液）：稱取0.5 g碘，溶解于100 mL甲醇溶液后，加純水定容至1 000 mL，以0.45 μm的尼龍濾膜過(guò)濾，充入氮?dú)獗芄獗４妗?/p>

1.3.4 樣品制備

1.3.4.1 提取

稱取15 g樣品至均質(zhì)袋中，加入60 mL體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液，并加入2 g氯化鈉；用拍打式無(wú)菌均質(zhì)器均質(zhì)3 min；用普通濾紙進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液至250 mL三角瓶中；移取5 mL濾液至50 mL容量瓶中，用PBS定容；將稀釋液用玻璃纖維濾紙過(guò)濾至三角瓶中。

1.3.4.2 凈化

取1.3.4.1節(jié)稀釋液10 mL，加入免疫親和柱（流速1 mL/min）；液體徹底排凈后，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)10%甲醇-PBS（或純水）洗滌2 次（流速3 mL/min）；棄去洗脫液，加入1 mL甲醇，孵育2 min（流速1 mL/min）；收集洗脫液，搖勻。

1.3.5 樣品測(cè)定

將1.3.4.2節(jié)洗脫液過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)行高效液相色譜分析。每次進(jìn)樣20 μL，重復(fù)2 次，記錄色譜峰面積，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的黃曲霉毒素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒及辣椒提取物中黃曲霉毒素含量的測(cè)定

利用免疫親和層析凈化高效液相色譜法對(duì)不同來(lái)源的辣椒和辣椒提取物中黃曲霉毒素含量（B1、B2、G1、G2）進(jìn)行分析，高效液相色譜圖見(jiàn)圖1，結(jié)果見(jiàn)表1～3。

圖1 黃曲霉毒素的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC profiles of aflatoxin standard and paprika extracts

表1 不同 來(lái)源 辣椒 樣品 中黃 曲霉 毒素 B1、B2、G1、G2含量Table 1 Detecti on results of aflatox in B 1，B 2，G 1， and G2 in pa pr ika sam ples fro m differe nt re gi on s

不同來(lái)源的辣椒中普遍含有不同含量的黃曲霉毒素B1（0.93～48.07 μg/kg），印度辣椒中黃曲霉毒素B1較高，新疆辣椒中黃曲霉毒素B1較低，部分印度辣椒中檢出黃曲霉毒素B2，未檢出黃曲霉毒素G1、G2。不同來(lái)源的辣椒生產(chǎn)的辣椒紅產(chǎn)品未檢出黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2。不同來(lái)源的辣椒生產(chǎn)的辣椒油樹(shù)脂產(chǎn)品中含有不同含量的黃曲霉毒素B1（1.49～51.53 μg/kg），部分印度辣椒和新疆辣椒中檢出黃曲霉毒素B2，未檢出黃曲霉毒素G1、G2。

表2 不同來(lái)源辣椒紅中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量Table 2 Detecti on results of aflatox in B 1，B 2，G 1 and G2 in pa pr ika oleores in fr om differ entpap rika sou rc es

表3 不同 來(lái)源 辣椒 油樹(shù) 脂中 黃曲 霉毒 素B 1、B2、G1、G2含量Table3 Detecti on results of aflatox in B1，B 2，G 1 and G 2 in capsicum oleores in from different paprika sources

2.2 辣椒及辣椒提取物中黃曲霉毒素的遷移規(guī)律

利用免疫親和層析凈化高效液相色譜法對(duì)不同來(lái)源的辣椒粒和辣椒提取物中黃曲霉毒素含量B1進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表4、5。

表4 不同來(lái)源辣椒生產(chǎn)紅辣素過(guò)程中黃曲霉毒素B1遷移 率Table4 Migrati on of aflatox in B1from di fferent paprika sourcesto paprikaextractsdur in g produ cti on

分別選取印度和新疆辣椒粒，經(jīng)溶劑提取、提取液濃縮后得到紅辣素，提取后的渣子即為辣椒渣，按照1.3節(jié)檢測(cè)黃曲霉毒素含量，研究黃曲霉毒素B1從原料至紅辣素及辣椒渣的遷移規(guī)律。結(jié)果表明，從辣椒原料生產(chǎn)至紅辣素和辣椒渣的過(guò)程中，黃曲霉毒素B1主要遷移至辣椒渣中。

將上述得到的印度和新疆紅辣素，經(jīng)分離、濃縮后分別得到辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂，按照1.3節(jié)檢測(cè)黃曲霉毒素含量，研究黃曲霉毒素B1從紅辣素至辣椒油樹(shù)脂及辣椒紅的遷移規(guī)律。結(jié)果表明，對(duì)于新疆原料，從紅辣素生產(chǎn)至辣椒油樹(shù)脂和辣椒紅的過(guò)程中，黃曲霉毒素B1主要遷移至辣椒油樹(shù)脂中，辣椒紅中未遷移。對(duì)于印度原料，從紅辣素生產(chǎn)至辣椒油樹(shù)脂和辣椒紅的過(guò)程中，黃曲霉毒素B1遷移至辣椒油樹(shù)脂及辣椒紅中。經(jīng)分析，黃曲霉毒素和辣椒油樹(shù)脂均易溶于醇類溶劑，在分離過(guò)程中黃曲霉毒素應(yīng)該遷移至辣椒油樹(shù)脂中，而印度原料可能由于分離不徹底，造成辣椒紅中出現(xiàn)黃曲霉毒素。

表5 不同來(lái)源紅辣素生產(chǎn)辣椒紅、辣椒油樹(shù)脂過(guò)程中黃曲 霉毒 素B 1遷移 率Table5 Migrati on of aflatox in B1fr om di ffer en tp ap rika e xtractsto pa pr ika oleores in and capsicu m oleo res in dur in g produ cti on

3 結(jié) 論

辣椒在貯存、運(yùn)輸、加工過(guò)程中，可能會(huì)受到黃曲霉毒素的污染，而被污染的辣椒在加工過(guò)程中黃曲霉毒素會(huì)由辣椒遷移到辣椒油樹(shù)脂中，造成產(chǎn)品被黃曲霉毒素污染，進(jìn)而會(huì)對(duì)人類健康造成威脅。因此，為防止辣椒提取物中黃曲霉毒素的污染，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)辣椒原料的控制。

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Contamination and Migration of Aflatoxin in Paprika and Paprika Extracts

ZHOU Li， YANG Qingshan*， LIAN Yunhe， WANG Lei， ZHANG Xiaofang
（1.Hebei Engineering Technology Research Center of Natural Pigments， Handan 057250， China；2.Chenguang Biotech Group Co.Ltd.， Handan 057250， China）

Aflatoxins （B1， B2， G1， G2） in paprika and paprika extracts were quantified by high-performance liquid chromatography （HPLC） after cleanup by immunoaffinity chromatography.Paprika samples were collected from India and Xinjiang， China.Paprika extracts were prepared in our laboratory.The results showed that aflatoxin was detected in both paprika and paprika extract samples in the range of 0.93 to 51.53 μg/kg and that during preparation of paprika extracts，aflatoxin migrated from paprika to capsicum oleoresin， but not to paprika oleoresin.These results indicated that the aflatoxin in paprika extracts came from contaminated paprika.To control aflatoxin contamination of paprika extracts， the starting raw material must be free from contamination by aflatoxin.

aflatoxin （B1， B2， G1， G2）； paprika extract； high-performance liquid chromatography after cleanup by immunoaffinity chromatography； determination； migration

10.7506/spkx1002-6630-201614029

TS202.3

A

1002-6630（2016）14-0165-04

周麗， 楊清山， 連運(yùn)河， 等.辣椒及辣椒提取物中黃曲霉毒素含量的測(cè)定及遷移規(guī)律分析［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（14）: 165-168.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614029. http://www.spkx.net.cn

ZHOU Li， YANG Qingshan， LIAN Yunhe， et al.Contamination and migration of aflatoxin in paprika and paprika extracts［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 165-168.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614029. http://www.spkx.net.cn

2015-10-25

國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)（2014DFA31220）

周麗（1980—），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：zhouli_2004@126.com

*通信作者：楊清山（1985—），男，工程師，學(xué)士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：yqs5363631@163.com