響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化紅松松仁膳食纖維制備工藝及其理化性質(zhì)分析

包怡紅，馮雁波（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

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響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化紅松松仁膳食纖維制備工藝及其理化性質(zhì)分析

包怡紅，馮雁波
（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

以紅松松仁粕為原料制備松仁膳食纖維，利用響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝條件，并對其相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行分析。通過比較篩選堿性蛋白酶為最適酶，選擇pH值、加酶量、酶解溫度、酶解時間4 個影響因素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計，得到最優(yōu)酶解工藝條件，并對此條件下得到的膳食纖維性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：制備膳食纖維最優(yōu)工藝條件為pH 9.2、堿性蛋白酶加酶量10 148 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間3.1 h，膳食纖維含量可達(dá)77.67%。相對于松仁粕，其持水力、膨脹力、持油力分別提高了24.17%、25.95%、40.44%，溶解性降低了63.94%。松仁粕經(jīng)酶解后得到的膳食纖維具有較好的性能，對于實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。

松仁粕；膳食纖維；響應(yīng)面；性質(zhì)

紅松（Pinus koraiensis Sivb.ct Zucc）為裸子植物，常綠喬木，主產(chǎn)于中國東北長白山、小興安嶺，是東北地區(qū)的珍貴樹種［1-2］。紅松松仁營養(yǎng)豐富，富含脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物及多種微量元素，具有美容養(yǎng)顏、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、延年益壽、延緩衰老等功效［3-7］。

近年來，健康飲食已備受關(guān)注。其中膳食纖維被稱為“第七大營養(yǎng)素”，是維持人體生命和健康所必需的，具有降血糖、降血脂、改善腸道健康等多種生理功能［8-10］。目前，制備膳食纖維和探究其理化及功能性質(zhì)已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。膳食纖維制備的原料主要來源于麩皮、果渣等［11］，對于松仁膳食纖維制備的研究鮮見報道，松仁經(jīng)提油后所剩副產(chǎn)物松仁粕中含有大量可利用的膳食纖維，從中提取膳食纖維不僅可以減少資源的浪費(fèi)，而且提高了松仁的利用價值，在功能性食品開發(fā)及改善人體健康方面有重要的意義。

本研究以紅松松仁粕為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化膳食纖維制備工藝條件，并分析了所得膳食纖維的持水性、持油性、膨脹力、溶解性，旨在通過蛋白酶酶解分離松仁粕中膳食纖維并研究其性質(zhì)，為松仁的精深加工利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松仁粕 黑龍江省宏泰松果有限公司；高溫α-淀粉酶上海源葉生物科技有限公司；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100型高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴槽 上海普渡生化科技有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；TDL-40B-W型離心機(jī) 上海標(biāo)儀儀器有限公司；KSW-5-12A型馬弗爐 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

松仁粕→粉碎過60 目篩→高溫α-淀粉酶酶解（加酶量2 000 U/g，pH 6.0，95 ℃，40 min）→蛋白酶酶解→滅酶（沸水浴10 min）→95%乙醇溶液醇沉，靜置過夜→抽濾→50 ℃烘干→膳食纖維

1.3.2 基本成分含量測定

蛋白質(zhì)含量測定：參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》；脂肪含量測定：參照GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測定》；灰分含量測定：參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》；水分含量測定：參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》；膳食纖維含量測定：參照GB/T 5009.88—2008《食品中膳食纖維的測定》。

1.3.3 蛋白酶活力測定

蛋白酶活力測定采用福林酚法［12-13］。

1.3.4 蛋白酶的篩選

分別采用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶在其最適條件下對松仁粕進(jìn)行酶解，制備膳食纖維，以膳食纖維含量為衡量指標(biāo)，篩選制備膳食纖維最適蛋白酶。

1.3.5 膳食纖維制備單因素試驗(yàn)

1.3.5.1 pH值對膳食纖維含量的影響

稱取2.5 g松仁粕，加入50 mL蒸餾水，α-淀粉酶酶解，分別調(diào)節(jié)pH值為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，加入堿性蛋白酶6 000 U/g，45 ℃水解2 h，滅酶，醇沉過夜，烘干后測量。

1.3.5.2 加酶量對膳食纖維含量的影響

稱取2.5 g松仁粕，加入50 mL蒸餾水，α-淀粉酶酶解，調(diào)節(jié)pH 9.0，堿性蛋白酶加酶量分別為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g，45 ℃水解2 h，滅酶，醇沉過夜，烘干后測量。

1.3.5.3 酶解溫度對膳食纖維含量的影響

稱取2.5 g松仁粕，加入50 mL蒸餾水，α-淀粉酶酶解，調(diào)節(jié)pH 9.0，添加堿性蛋白酶10 000 U/g，分別在35、40、45、50、55、60 ℃條件下水解2 h，滅酶，醇沉過夜，烘干后測量。

1.3.5.4 酶解時間對膳食纖維含量的影響

稱取2.5 g松仁粕，加入50 mL蒸餾水，α-淀粉酶酶解，調(diào)節(jié)pH 9.0，添加堿性蛋白酶10 000 U/g，分別在50 ℃條件下水解1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，滅酶，醇沉過夜，烘干后測量。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計原理，選擇pH值、加酶量、酶解溫度、酶解時間為試驗(yàn)因素，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)因素和水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used for resp on se surfacedesign

1.3.7 膳食纖維性質(zhì)測定

1.3.7.1 持水力的測定

按照Chau等［14］的方法進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的樣品于離心管，按1∶20（g/mL）加入去離子水，振蕩均勻，室溫靜置24 h，2 000 r/min離心10 min，取出，傾去上清液，稱量樣品濕質(zhì)量。持水力計算如式（1）所示：

1.3.7.2 膨脹力的測定

按照Femenia等［15］的方法進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的樣品于刻度試管中，記錄干樣品初始體積，按1∶20（g/mL）加入去離子水，混合均勻，室溫靜置24 h，記錄樣品膨脹后體積，膨脹力計算如式（2）所示：

1.3.7.3 溶解性的測定

按照黎冬明［16］的方法進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的樣品于離心管中，按3∶100（g/mL）加入蒸餾水，85 ℃恒溫保持30 min，每5 min攪拌一次，3 000 r/min離心20 min，將上清液于100 ℃烘干，然后105 ℃烘至恒質(zhì)量，溶解性計算如式（3）所示：

1.3.7.4 持油力的測定

按照Sangnark等［17］的方法進(jìn)行，并稍作修改。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量樣品于離心管中，按質(zhì)量比1∶8加入食用花生油，混勻，37 ℃靜置1 h，3 000 r/min離心20 min，傾去上層油，用濾紙吸干殘渣游離的花生油，記錄吸附花生油后樣品質(zhì)量，持油力計算如式（4）所示：

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活測定及蛋白酶篩選

經(jīng)測定得到3 種酶活力見表2。不同蛋白酶處理對膳食纖維含量的影響見圖1。

表2 蛋白酶活力及酶解條件Table 2 Proteaseactivity and c orresp on d in g reacti on c on diti on s

圖1 不同蛋白酶對膳食纖維含量的影響Fig.1 Effect of different proteases on dietary fiber content of pine kernel meal

由圖1可見，與空白組相比，經(jīng)蛋白酶酶解所得膳食纖維含量均有所提高。其中，堿性蛋白酶酶解得到的膳食纖維含量最高，其次為中性蛋白酶，效果最差的為木瓜蛋白酶，因此，選擇堿性蛋白酶進(jìn)行膳食纖維的制備，并優(yōu)化其制備工藝。

2.2 膳食纖維制備單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 pH值對膳食纖維含量的影響

圖2 p H 值對膳食纖維含量的影響Fig.2 Effect of hydrolysis pH on dietary fiber content of pine kernel meal

由圖2可知，當(dāng)pH值小于9.0時，膳食纖維含量隨pH值的升高而增大，當(dāng)pH值為9.0時達(dá)到最大，為69.90%，之后隨著pH值的升高，膳食纖維含量略有下降，這是因?yàn)閜H值過大或過小，不僅能夠影響酶本身的空間構(gòu)象，使酶活力降低，還會使酶和底物的帶電狀態(tài)發(fā)生改變，從而影響二者結(jié)合［18-20］。

2.2.2 加酶量對膳食纖維含量的影響

圖3 加酶量對膳食纖維含量的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on dietary fiber content of pine kernel meal

由圖3可知，隨著加酶量的增大，膳食纖維含量不斷增大，當(dāng)加酶量達(dá)到10 000 U/g時，膳食纖維含量達(dá)到71.62%，之后隨加酶量增大，膳食纖維含量無顯著變化，這是因?yàn)槊概c底物的作用趨于飽和狀態(tài)，剩余部分蛋白因被纖維結(jié)構(gòu)包裹過于緊密而不容易被酶解［21-22］。

2.2.3 酶解溫度對膳食纖維含量的影響

圖4 酶解溫度對膳食纖維含量的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on dietary fiber content of pine kernel meal

由圖4可知，隨酶解溫度的升高，膳食纖維含量先增大后減小。在35～50 ℃范圍內(nèi)，膳食纖維含量呈增大趨勢，50 ℃以后，升高溫度，含量逐漸下降；在酶解溫度達(dá)到50 ℃時達(dá)到最大為73.07%。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)升高溫度能夠提高蛋白酶活力，但溫度太高則會導(dǎo)致酶活性降低，蛋白酶解不完全，膳食纖維含量減小［23］。

2.2.4 酶解時間對膳食纖維含量的影響

圖5 酶解時間對膳食纖維含量的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on dietary fiber content of pine kernel meal

由圖5可知，在酶解時間1.5～3.0 h范圍內(nèi)，膳食纖維含量隨酶解時間的延長而增大，當(dāng)酶解時間達(dá)到3.0 h后，含量保持基本穩(wěn)定，無顯著變化。這是因?yàn)樵诿附膺^程中，增加酶解時間有利于酶與作用底物充分接觸，提高酶解率，但當(dāng)時間足夠長，酶解已完全，膳食纖維含量趨于穩(wěn)定［24-25］。

2.3 膳食纖維制備響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 膳食纖維制備響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計方案與結(jié)果Table 3 Experimentald esign and results for resp on sesurface analysis

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析方法，確定膳食纖維最佳制備工藝條件，響應(yīng)面試驗(yàn)共29 個試驗(yàn)點(diǎn)，其中包括24 個析因點(diǎn)，5 個中心點(diǎn)，試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表3。

2.3.2 膳食纖維制備回歸模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

用Design-Expert 8.0軟件對表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到膳食纖維含量（Y）對自變量pH（X1）、加酶量（X2）、酶解溫度（X3）、酶解時間（X4）的二次多項(xiàng)回歸模型：

表4 響應(yīng) 面方 差分 析Table 4 Analysis of variance of resp on sesurfaceregressi on model

由表4可知，各因素中一次項(xiàng)X1、X2、X4均是極顯著（P＜0.01），X3不顯著（P＞0.05）；二次項(xiàng)X1X3、X2X3、X3X4是不顯著的，其他均為極顯著。由此可見，各試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響并不是簡單的線性關(guān)系。此模型P＜0.01，響應(yīng)回歸模型達(dá)到了極顯著水平，相關(guān)系數(shù)R2=0.983 5，表明98.35%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以用此方程來解釋。因此，回歸方程可以用來分析和預(yù)測膳食纖維制備的工藝結(jié)果，具有實(shí)用價值。由F值大小可知，影響膳食纖維制備效果的顯著性順序依次為酶解時間＞pH值＞加酶量＞酶解溫度。

2.3.3 膳食纖維制備響應(yīng)面分析

由圖6可知，酶解時間對應(yīng)的響應(yīng)面曲線較陡、等高線較密集，對膳食纖維提取影響最為顯著，pH值次之，最不顯著的為酶解時間。因此，4 個因素對膳食纖維制備影響次序?yàn)椋好附鈺r間＞pH值＞加酶量＞酶解溫度，與方差分析結(jié)果一致。

圖6 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction parameters on dietary fiber content of pine kernel meal

2.3.4 膳食纖維制備最優(yōu)工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過軟件Design-Expert 8.0對數(shù)學(xué)模型進(jìn)行計算，得到最優(yōu)工藝條件為pH 9.2、加酶量10 148 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間3.1 h，模型分析預(yù)測膳食纖維含量為77.43%。為驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，在此最優(yōu)條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，得到實(shí)際測得的膳食纖維含量平均值為77.67%，與預(yù)測值基本吻合。因此，所得的膳食纖維最優(yōu)制備工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價值。

2.4 松仁粕及膳食纖維成分分析

表5 松仁粕和膳食纖維的組成成分（x±s ，n=3）Table 5 Proximate compositi on s of p in ekernelmeal and dietary fiber ex tra cted f romit（x± s，n= 3）

松仁粕及最優(yōu)工藝條件下膳食纖維的組成成分測定結(jié)果見表5，經(jīng)過酶解后，松仁粕經(jīng)酶解后得到的膳食纖維蛋白質(zhì)、淀粉含量分別由19.62%、9.31%降至3.12%和2.13%，灰分、水分含量也有小幅度的降低。其中松仁膳食纖維粉中總膳食纖維含量達(dá)到77.67%，相對于松仁粕有極顯著提高。

2.5 膳食纖維性質(zhì)測定

由表6可知，松仁粕經(jīng)酶解后得到的膳食纖維持水力、膨脹力、持油力都有明顯提高。其中，持水力由4.84 g/g升至6.01 g/g，提高了24.17%；膨脹力由5.28 mL/g升至6.65 mL/g，提高了25.95%；持油力由3.61 g/g升至5.07 g/g，提高了40.44%。但膳食纖維的溶解性由16.78%降低至6.05%，這可能是由于松仁粕中含有較高含量的蛋白質(zhì)，具有一定的溶解性。

表6 膳食纖維及松仁粕的物化特性（x±s ，n=3）Table 6 Physical and c hemical properties of p in e kernelm eal and dietar y fibe r ex tra cted from it（x±s ，n= 3）

3 結(jié) 論

研究采用酶法制備松仁膳食纖維，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面法優(yōu)化膳食纖維制備工藝條件，得到最優(yōu)工藝參數(shù)為pH 9.2、加酶量10 148 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間3.1 h，該條件下膳食纖維含量為77.67%。經(jīng)方差分析得出影響膳食纖維制備的因素排序?yàn)椋好附鈺r間＞pH值＞加酶量＞酶解溫度。在此條件下制備得到的松仁膳食纖維持水力為6.01 g/g，比報道的葡萄皮渣膳食纖維（3.12 g/g）、米糠膳食纖維（4.52 g/g）、西番蓮果渣膳食纖維（5.64 g/g）等持水力好［26-28］；松仁膳食纖維膨脹力為6.65 mL/g，優(yōu)于玉米皮膳食纖維（3.55 mL/g）、荔枝渣膳食纖維（1.64 mL/g）的膨脹力［29-30］；此外，松仁膳食纖維持油力為5.07 g/g，明顯高于江蘺藻膳食纖維持油力（1.08 g/g）［31］。證實(shí)了采用酶法制備松仁膳食纖維方法可靠，且制備得到的膳食纖維具有較好的性質(zhì)，是功能性食品開發(fā)及應(yīng)用的良好資源。

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Dietary Fiber from Pine Kernel Meal: Optimization of Extraction Process by Response Surface Methodology and Physicochemical Properties

BAO Yihong， FENG Yanbo
（College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

Dietary fiber was extracted from pine kernel meal and its physicochemical properties were examined.Response surface methodology was used to optimize the extraction conditions.Alcalase was selected as the best enzyme to hydrolyze the protein in pine kernel meal.pH， enzyme dosage， reaction temperature and reaction time were chosen as the significant variables influencing the extraction of dietary fiber.Using one-factor-at-a-time method and response surface methodology，the levels of these four variables were optimized as follows: pH， 9.2； enzyme dosage， 10 148 U/g； reaction temperature，50 ℃， and reaction time， 3.1 h.Under these optimized conditions， the dietary fiber content of pine kernel meal was determined to be 77.67%.Compared with pine kernel meal， its water-holding capacity， swelling capacity and oil-binding capacity were increased by 24.17%， 25.95%， and 40.44%， respectively and its solubility was decreased by 63.94%.The dietary fiber obtained from pine kernel meal exhibited good functional properties， which are important for practical applications.

pine kernel meal； dietary fiber； response surface methodology； property

10.7506/spkx1002-6630-201614003

TS209

A

1002-6630（2016）14-0011-07

包怡紅， 馮雁波.響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化紅松松仁膳食纖維制備工藝及其理化性質(zhì)分析［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（14）: 11-17.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614003. http://www.spkx.net.cn

BAO Yihong， FENG Yanbo.Dietary fiber from pine kernel meal: optimization of extraction process by response surface methodology and physicochemical properties［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 11-17.（in Chinese with English abstract）DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614003. http://www.spkx.net.cn

2015-11-23

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2572014EA02）；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目（2015RAXXJ010）

包怡紅（1970—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)與功能食品。E-mail：baoyihong@163.com