口蹄疫病毒誘導(dǎo)PK-15細胞發(fā)生自噬的研究

范許許， 郜 原， 郭慧琛， 孫世琪

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，國家口蹄疫參考實驗室，甘肅蘭州 730046)

?

口蹄疫病毒誘導(dǎo)PK-15細胞發(fā)生自噬的研究

范許許， 郜 原， 郭慧琛， 孫世琪*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，國家口蹄疫參考實驗室，甘肅蘭州 730046)

摘要[目的] 探究Asia1型口蹄疫病毒感染PK-15細胞后能否誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，分析細胞自噬對口蹄疫病毒復(fù)制的影響。[方法] 用未經(jīng)處理的PK-15細胞和自噬抑制劑3-MA處理的PK-15細胞分別感染口蹄疫病毒，通過蛋白免疫印跡和共聚焦激光顯微鏡檢測自噬的誘導(dǎo)情況。[結(jié)果] 自噬標(biāo)志分子LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白水平的比值增加，并且LC3特異的綠色熒光聚集；自噬抑制劑3-MA處理細胞后口蹄疫病毒復(fù)制水平顯著上調(diào)。[結(jié)論] Asia1型口蹄疫病毒感染PK-15細胞后能夠誘導(dǎo)發(fā)生自噬，而自噬又促進口蹄疫病毒的復(fù)制。

關(guān)鍵詞口蹄疫病毒；自噬；LC3

口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，F(xiàn)MDV)隸屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，因其感染偶蹄動物后引起發(fā)病動物口腔黏膜、四肢末端和乳房等處出現(xiàn)病理性水泡變化而得名。該病一旦暴發(fā)將會對畜牧業(yè)和肉產(chǎn)品市場造成不可估量的經(jīng)濟損失?？谔阋卟《居?個血清型(O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3)，每個血清型均具有廣泛的抗原變異特性，不能形成交叉免疫保護，從而極大地增加了該疫病防控的難度[1]。歷史上該疫病的數(shù)次大暴發(fā)造成了巨大的經(jīng)濟損失，因此研究口蹄疫病毒的致病機理及其有效防控措施已迫在眉睫[2]。

自噬(Autophagy)是最早發(fā)現(xiàn)的一種自食現(xiàn)象，是指真核細胞內(nèi)來自粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的沒有核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細胞內(nèi)需要降解的細胞器、長壽命蛋白質(zhì)等成分形成自噬體(Autophagosome)，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，可以簡單理解為是依賴溶酶體的細胞內(nèi)降解過程。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的自噬基因有30多種，共同參與調(diào)控自噬的起始、延伸、閉合和降解這4個過程[3-4]。自噬的生理意義是在細胞受到應(yīng)激性的死亡威脅時保持細胞的存活，是真核細胞維持穩(wěn)態(tài)與實現(xiàn)更新的一種重要的保守機制。最新的研究發(fā)現(xiàn)自噬與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病、肝功能紊亂、心力衰竭、傳染性疾病、炎癥性疾病、糖尿病及肥胖癥等[5-7]。

在小RNA病毒科脊髓灰質(zhì)炎病毒的研究中發(fā)現(xiàn)，細胞自噬促進該病毒的復(fù)制，因而有人推測自噬可能同樣有利于口蹄疫病毒在宿主細胞內(nèi)的復(fù)制。GLADUEDP等[8]用自噬誘導(dǎo)劑——雷帕霉素處理細胞，促進病毒的復(fù)制，用3-MA處理抑制病毒的復(fù)制。然而，Berryman等[9]自噬抑制劑處理細胞，對病毒的復(fù)制卻沒有影響。研究表明，口蹄疫病毒激活的細胞自噬與其他小RNA病毒有明顯差異，在其他小RNA病毒上發(fā)現(xiàn)的自噬特征并沒有出現(xiàn)在口蹄疫病毒上，主要體現(xiàn)在能否利用自噬體膜方面。脊髓灰質(zhì)炎病毒、庫克薩基病毒都可以利用自噬體膜促進自身復(fù)制，但口蹄疫病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬體并不能給病毒復(fù)制提供膜結(jié)構(gòu)，但其作用機理目前尚不清楚[9-11]。筆者用未經(jīng)處理的PK-15細胞和自噬抑制劑3-MA處理的PK-15細胞分別感染口蹄疫病毒，通過蛋白免疫印跡和共聚焦激光顯微鏡檢測自噬的誘導(dǎo)情況。

1材料與方法

1.1材料口蹄疫病毒毒株Asia1/Jiangsu/China/2005(GeneBankAccessionNo.EF149009)，由國家口蹄疫參考實驗室保存；幼倉鼠腎傳代細胞(BHK-21)、豬腎傳代細胞(PK-15)由家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室保存；兔抗LC3、小鼠抗ATG5-ATG12單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、TRITC標(biāo)記的兔抗豬IgG和FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG，均購自Sigma公司；小鼠抗β-actin單克隆抗體，購自SantaCruz公司。

細胞培養(yǎng)用PBS、DMEM、0.25%-EDTA胰酶、青霉素和鏈霉素，均購自Gibco公司；胎牛血清、3-MA和多聚甲醛，均購自Sigma公司；蛋白預(yù)染Marker，購自全式金公司；ECL底物發(fā)光試劑盒，購自Thermo公司；蛋白酶抑制劑，購自Invitrogen公司；硝酸纖維素膜，購自Pall公司；DAPI購自碧云天公司。

1.2方法

1.2.1病毒的處理。

1.2.1.1病毒的傳代。將Asia1/Jiangsu/China/2005(GenBank登錄號EF149009)FMDV病毒株感染BHK-21單層細胞進行傳代，待細胞完全病變脫落后貯存于-70 ℃冰箱中，使用前反復(fù)凍融3次后，0.22μm濾膜過濾，分裝并保存。

1.2.1.2病毒滴度的測定。用含5%胎牛血清的DMEM懸浮BHK-21，取懸液分別接種于96微孔板，每孔50μL，每個孔的細胞密度約為1.5×106cells/mL，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，依次加入用無血清DMEM倍比稀釋的病毒液，每個稀釋比例添加在8個孔內(nèi)，培養(yǎng)60h后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察細胞病變，并根據(jù)Reed-Muench方法計算出病毒的TCID50。

1.2.1.3病毒感染。培養(yǎng)的單層PK-15，加入感染復(fù)數(shù)(Multiplicityofinfection，MOI)為1或25的FMDV原液，4 ℃下孵育1h后，棄去毒液，并用冷PBS清洗掉未結(jié)合的病毒，然后加入含2%胎牛血清的DMEM維持液于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，不添加病毒液的細胞為對照。在感染的不同時間段1～3h，加入4%多聚甲醛固定細胞，然后進行間接免疫熒光試驗，以共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察。此外，收集感染不同時間點的細胞，用于Westernblot分析。

1.2.2蛋白免疫印跡(Westernblot)。待收取的細胞棄掉培養(yǎng)基，用冷的PBS漂洗2次，加入1mL冷的PBS，將細胞刮下后將細胞懸液移入離心管中，4 ℃ 1 000r/min離心5min。輕輕棄上清，加入300μL改良的RIPA裂解緩沖液，振蕩充分混勻后，冰上靜置30min，每隔5min振蕩1次。然后，4 ℃下 10 000r/min離心5min，收取上清，加入適量的5×SDS緩沖液，混勻后在金屬浴100 ℃煮樣10min。SDS-PAGE凝膠的配制參照《分子生物學(xué)實驗指南》，然后進行SDS-PAGE電泳，每個泳道蛋白樣品上樣量為30μg，同時單獨選泳道加入預(yù)染蛋白Marker作為指示。蛋白樣品在上層濃縮膠中，設(shè)置電壓為80V；待蛋白樣品進入下層分離膠后，調(diào)節(jié)電壓至120V，直至電泳結(jié)束。轉(zhuǎn)印前，根據(jù)SDS-PAGE凝膠的大小剪取適當(dāng)大小(約為5.0cm×7.5cm)硝酸纖維素膜(NC膜)，與濾紙一同在轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡，按照“膜正膠負”順序放置蛋白膠，如同一個“夾心三明治”的結(jié)構(gòu)：負極-海綿-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-海綿-正極，應(yīng)嚴(yán)格控制放置過程中不能出現(xiàn)氣泡，夾好后將其放置到濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印槽內(nèi)，加入足夠多預(yù)冷的轉(zhuǎn)印緩沖液，接通電源，設(shè)置參數(shù)(恒流200mA轉(zhuǎn)印2h)，轉(zhuǎn)印槽外部用冰輔助降溫。待轉(zhuǎn)印結(jié)束后，用封閉液室溫封閉NC膜1h，加入TBST稀釋的一抗，室溫孵育1h或者4 ℃輕搖振蕩過夜，TBST漂洗3次后，加入TBST稀釋的二抗，室溫輕搖1h，TBST漂洗3次后，進行顯色反應(yīng)。

1.2.3激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。4%多聚甲醛固定細胞10min，PBS洗2次；0.1%TritonX-100通透細胞膜5min，PBS洗2次；用5%NBS封閉20min；加入1%NBS稀釋的一抗(1∶100)37 ℃孵育1h，PBST洗2次；分別加入FITC和TRITC標(biāo)記的IgG稀釋液，37 ℃孵育1h，PBST洗2次；加入DAPI稀釋液，室溫孵育5min，PBS洗2次；利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察自噬的誘導(dǎo)作用。

2結(jié)果與分析

2.1FMDV感染PK-15細胞后激活LC3和ATG5-ATG12LC3是檢測自噬發(fā)生的標(biāo)志性分子，LC3有2種形式，其中LC3-Ⅰ彌散地分布在胞質(zhì)中，一旦自噬發(fā)生，LC3-Ⅰ就會轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ并且特異地結(jié)合在自噬泡的內(nèi)外膜上。利用Westernblot檢測LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值的變化，是判斷自噬發(fā)生的經(jīng)典途徑。此外，ATG5-ATG12復(fù)合體誘導(dǎo)自噬體膜的彎曲延伸，該復(fù)合體蛋白水平的變化也可作為檢測自噬是否被激活的有力證據(jù)。研究表明，O型FMDV在人的癌細胞上激活自噬，并且發(fā)生在感染的初期階段，即感染后3h內(nèi)。筆者用MOI=1的Asia1型FMDV感染PK-15細胞，收集感染不同時間點的細胞樣品進行Westernblot檢測，使用灰度分析軟件ImageJ對LC3和ATG5-ATG12的條帶進行灰度分析，發(fā)現(xiàn)與對照相比，在病毒感染后30min即可檢測到LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加，在感染后1hLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值達到最高峰，隨后出現(xiàn)下降的趨勢(圖1)，說明FMDV激活宿主細胞發(fā)生自噬，且在3h內(nèi)完成整個過程。此外，ATG5-ATG12復(fù)合體的變化與LC3-Ⅱ/LC3-I的變化大致相同。

注：FMDV(MOI=1)感染PK-15細胞，分時間段收集感染細胞，Western blot檢測LC3-Ⅱ和LC3-I蛋白水平的變化。Note: PK-15 cells were infected with FMDV(MOI=10), infection cells were collected at different time period, the protein level change of LC3-Ⅱ and LC3-I was detected by Western blot. 圖1　FMDV感染PK-15細胞LC3和ATG5-ATG12的變化Fig.1　The change of LC3 and ATG5-ATG12 after the PK-15 cells infected with FMDV

2.2FMDV感染PK-15細胞后引起LC3聚集自噬發(fā)生的另一標(biāo)志性現(xiàn)象也與LC3有關(guān)，通過熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)點狀聚集的綠色熒光，即可判斷細胞是否發(fā)生自噬。筆者用MOI=10的亞洲1型FMDV感染PK-15細胞，收集感染不同時間點的細胞樣品進行間接免疫熒光試驗，最后在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察細胞熒光。從圖2可以看出，與對照組相比，感染FMDV的細胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光的點狀聚集，與Westernblot檢測結(jié)果相符合，證實FMDV感染宿主細胞后能夠激活自噬。

注：FMDV(MOI=10)感染 PK-15 細胞，進行間接免疫熒光試驗，然后借助共聚焦激光顯微鏡(CLSM)觀察LC3綠色熒光的點狀聚集。綠色代表LC3，藍色代表細胞核。Note: PK-15 cells were infected with FMDV(MOI=10), after indirect immunofluorescence, then the green LC3 puncta were observed by CLSM. Green presented LC3 and blue presented nucleus.圖2　FMDV感染宿主細胞引起LC3的點狀聚集Fig.2　The observation of LC3 puncta in PK-15 cells infected with FMDV

2.3自噬抑制劑3-MA處理細胞促進口蹄疫病毒的復(fù)制3-MA是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路的抑制劑，3型PI3K激活后促進3，4，5-三磷脂酰肌醇(PIP3)在脂質(zhì)雙層膜上的形成，啟動自噬的發(fā)生。用3-MA處理PK-15細胞1h,然后感染口蹄疫病毒(MOI=1), 收集感染不同時間點的細胞樣品進行Westernblot檢測，發(fā)現(xiàn)3-MA處理過的PK-15細胞中口蹄疫病毒的復(fù)制水平顯著上調(diào)(圖3)，灰度分析結(jié)果如圖4所示。

注：100 mmol/L的3-MA處理PK-15細胞1 h，感染FMDV(MOI=1)，分時間段收集感染細胞，Western blot檢測口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白的變化。Note: PK-15 cells were processed with 3-MA(100 mmol/L) and were infected with FMDV(MOI=1), then they were collected at different time points, the change of FMDV structure protein was detected by Western blot. 圖3　3-MA處理促進口蹄疫病毒在PK-15細胞內(nèi)的復(fù)制Fig.3　The replication of FMDV in PK-15 cells promoted by 3-MA treatment

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。Note: * stands for significant difference(P<0.05); ** stands for extremely significant difference(P<0.01). 圖4　灰度分析3-MA處理后口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達水平Fig.4　Expression level of structural protein of FMDV after gray analysis of 3-MA treatment

3討論

近年來，自噬研究已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點，在很多病毒的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)自噬與病毒感染宿主細胞密切相關(guān)，但是在口蹄疫病毒上關(guān)于自噬的研究還停留在初級階段，這些研究表明口蹄疫病毒感染人的癌細胞系引起自噬的激活，但是激活的途徑和方式尚不清楚。該研究以口蹄疫病毒的宿主細胞PK-15為研究對象，研究口蹄疫病毒在感染PK-15細胞后能否激活自噬作用。自噬抑制劑3-MA抑制PI3K通路從而抑制自噬，筆者發(fā)現(xiàn)在用3-MA處理細胞后，口蹄疫病毒的復(fù)制水平反而有所上升。研究發(fā)現(xiàn)，自噬的抑制劑3-MA并不抑制口蹄疫病毒激活的自噬，所以對病毒的復(fù)制沒有任何影響，推測口蹄疫病毒激活的自噬不依賴于PI3K途徑[9]。據(jù)報道，PI3K的另一個抑制劑渥曼青霉素處理BHK-21細胞后，可以促進病毒的復(fù)制[12]。這些爭議的出現(xiàn)，很可能與口蹄疫病毒血清型種類的不同和細胞種屬特異性有關(guān)。此外，也有學(xué)者認為口蹄疫病毒激活細胞自噬可能通過非經(jīng)典自噬途徑。因此，口蹄疫病毒感染細胞引起宿主細胞發(fā)生自噬的激活途徑和自噬的類型仍然需要大量試驗進行探究驗證。

4結(jié)論

筆者以PK-15為研究對象,在口蹄疫病毒感染的PK-15細胞中檢測自噬的激活。根據(jù)自噬發(fā)生的典型特征，即蛋白水平LC3-Ⅱ與LC3-I比值的升高和共聚焦激光顯微鏡下LC3熒光的聚集，驗證了FMDV感染宿主細胞PK-15激活自噬，為了進一步探究自噬對口蹄疫病毒復(fù)制的影響，筆者用自噬的抑制劑3-MA處理PK-15細胞，檢測到病毒復(fù)制的增強，說明自噬促進口蹄疫病毒的復(fù)制?？偠灾撗芯孔C實了口蹄疫病毒激活宿主細胞PK-15發(fā)生自噬，并且3-MA處理的PK-15細胞能促進口蹄疫病毒的復(fù)制。

參考文獻

[1]DOMINGOE,BARANOWSKIE,ESCARMISC,etal.Foot-and-mouthdiseasevirus[J].CompImmunolMicrobiolInfectDis, 2002, 25(5/6): 297-308.

[2]KNIGHT-JONESTJD,RUSHTONJ.Theeconomicimpactsoffootandmouthdisease-whatarethey,howbigaretheyandwheredotheyoccur[J].PrevVetMed, 2013, 112(3/4): 161-173.

[3]MIZUSHIMAN.Autophagy:Processandfunction[J].GenesDev, 2007, 21(22): 2861-2873.

[4]XIEZP,KLIONSKYDJ.Autophagosomeformation:Coremachineryandadaptations[J].NatCellBiol, 2007, 9(10): 1102-1109.

[5]KLIONSKyDJ,EMRSD.Autophagyasaregulatedpathwayofcellulardegradation[J].Science, 2000, 290(5497): 1717-1721.

[6]KUNDUM,THOMPSONCB.Autophagy:Basicprinciplesandrelevancetodisease[J].AnnuRevPathol, 2008, 3: 427-455.

[7]MIZUSHIMAN,LEVINEB,CUERVOAM,etal.Autophagyfightsdiseasethroughcellularself-digestion[J].Nature, 2008, 451(7182): 1069-1075.

[8]GLADUEDP,O′DONNELLV,BAKER-BRANSTETTERR,etal.Foot-and-mouthdiseasevirusnonstructuralprotein2CinteractswithBeclin1,modulatingvirusreplication[J].JVirol, 2012, 86(22): 12080-12090.

[9]BERRYMANS,BROOKSE,BURMANA,etal.Foot-and-mouthdiseasevirusinducesautophagosomesduringcellentryviaaclassIIIphosphatidylinositol3-kinase-independentpathway[J].JVirol,2012,86(23): 12940-12953.

[10]O’DONNELLV,LAROCCOM,BURRAGET,etal.Foot-and-mouthdiseasevirusutilizesanautophagicpathwayduringviralreplication[J].Virology, 2011, 410(1): 142-150.

[11]GLADUEDP,O'DONNELLV,BAKER-BRANSTETTERR,etal.Foot-and-mouthdiseasevirusmodulatescellularvimentinforvirussurvival[J].JVirol, 2013, 87(12): 6794-6803.

[12]HANSC,GUOHC,SUNSQ,etal.Productiveentryoffoot-and-mouthdiseasevirusviamacropinocytosisindependentofphosphatidylinositol3-kinase[J].Scientificreports,2016,6:19294.

基金項目國際科技合作專項(2014DFA31890)；國家科技支撐計劃項目 (2013BAD12B00)。

作者簡介范許許(1992- )，女，河南洛陽人，碩士研究生，研究方向：口蹄疫病毒分子病原學(xué)研究。*通訊作者，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事口蹄疫病毒分子致病機理研究和口蹄疫疫苗的研發(fā)。

收稿日期2016-05-06

中圖分類號S 855.3

文獻標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)16-160-04

FootandMouthDiseaseVirusInducedAutophagyinPK-15Cells

FANXu-xu,GAOYuan,GUOHui-chen,SUNShi-qi*

(NationalFootandMouthDiseaseReferenceLaboratory,StateKeyLaboratoryofVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou,Gansu730046)

Abstract[Objective] To explore whether Asia1 type foot and mouth disease virus (FMDV) induces autophagy in PK-15 cells, and whether autophagy has effect on FMDV replication. [Method] PK-15 cells were infected with FMDV after treating with autophagy inhibitor 3-MA or not. The induction of autophagy was detected by western blot and confocal laser microscope. [Result] The ratio of autophagy marker LC3-Ⅱ and LC3-Ⅰ protein levels was up-regulated, and LC3 fluorescent gathered phenomenon was observed. Furthermore, the capside protein of FMDV increased in 3-MA treated cells. [Conclusion] FMDV induces autophagy in PK-15 cells, and the autophagy promotes the replication of FMDV.

Key wordsFoot and mouth disease virus; Autophagy; LC3