丙烯酰胺對(duì)小鼠成體神經(jīng)發(fā)生及增殖相關(guān)基因的影響

張亞妹，王久濤，宋玲珍，張　偉，李玲玲，顏潤川，胡新德，趙善廷

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

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丙烯酰胺對(duì)小鼠成體神經(jīng)發(fā)生及增殖相關(guān)基因的影響

張亞妹，王久濤，宋玲珍，張偉，李玲玲，顏潤川，胡新德，趙善廷

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 探討丙烯酰胺對(duì)成年小鼠海馬成體神經(jīng)發(fā)生及增殖相關(guān)基因的影響，為了解丙烯酰胺的毒性機(jī)理提供參考。【方法】 將20只10周齡雄性成年昆白小鼠(體質(zhì)量(30±2) g/只)，隨機(jī)均分為丙烯酰胺染毒組和生理鹽水對(duì)照組，丙烯酰胺染毒組通過腹腔注射丙烯酰胺進(jìn)行染毒，注射劑量為50 mg/kg，連續(xù)注射14 d，第15天注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU，50 mg/kg，2次/d，共3 d)，觀察2組小鼠體質(zhì)量及行為活動(dòng)的變化。用BrdU標(biāo)記和免疫組織化學(xué)染色方法分析丙烯酰胺染毒對(duì)小鼠齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量的影響，用RT-PCR法研究丙烯酰胺對(duì)小鼠海馬增殖相關(guān)基因JNK3、Akt1、Gsk-3β、RhoA和Rac1 mRNA表達(dá)的影響?！窘Y(jié)果】 丙烯酰胺染毒組小鼠體質(zhì)量極顯著低于對(duì)照組，精神萎靡、后肢無力，走路時(shí)后肢偶成劈叉姿勢(shì)；與對(duì)照組相比，丙烯酰胺染毒組小鼠齒狀回亞顆粒細(xì)胞層中的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量極顯著降低(P<0.01)，海馬組織中JNK3和Rac1的mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，Akt1、Gsk-3β和RhoA的mRNA表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)?！窘Y(jié)論】 丙烯酰胺中毒能顯著抑制小鼠齒狀回中成體神經(jīng)干細(xì)胞增殖，可使海馬組織中增殖相關(guān)基因JNK3、Akt1、Gsk-3β、Rac1和RhoA的表達(dá)量發(fā)生明顯變化。

[關(guān)鍵詞]丙烯酰胺中毒；成體神經(jīng)發(fā)生；免疫組織化學(xué)；增殖相關(guān)基因

丙烯酰胺是一種工業(yè)常用的化學(xué)藥品，用于制造聚丙烯酰胺，在人們的日常生活中經(jīng)常會(huì)接觸到丙烯酰胺，如化妝品、洗滌劑和除臭劑等[1]。在實(shí)驗(yàn)室中，丙烯酰胺常用于電泳和凝膠層析等。除了工業(yè)和實(shí)驗(yàn)室使用之外，含糖量較高的食品經(jīng)過高溫加熱，也會(huì)形成丙烯酰胺[2-4]。有研究報(bào)道顯示，丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性和生殖毒性，對(duì)動(dòng)物具有致癌作用，導(dǎo)致動(dòng)物體質(zhì)量降低和神經(jīng)綜合征等[5-6]。

在哺乳動(dòng)物中，成體神經(jīng)干細(xì)胞主要局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的兩個(gè)部位：海馬結(jié)構(gòu)中的齒狀回(dentate gyrus,DG)和側(cè)腦室壁的室周帶(subventricular zone，SVZ)[7]。齒狀回的神經(jīng)干細(xì)胞主要存在于亞顆粒細(xì)胞層(subgranular zone,SGZ)，其新生的神經(jīng)干細(xì)胞遷移入亞顆粒細(xì)胞層，其中85%～95%的新生干細(xì)胞發(fā)育分化成神經(jīng)元[8]。SVZ區(qū)新生的神經(jīng)干細(xì)胞先是通過喙側(cè)遷移流(rostral migratory stream,RMS)到達(dá)嗅球(olfactory bulb)，然后在嗅球中發(fā)育分化成幾種中間神經(jīng)元[9]。

5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)注射標(biāo)記法是目前研究成體神經(jīng)發(fā)生最常用的方法，BrdU 是一種胸腺嘧啶脫氧核苷的類似物，可以代替胸腺嘧啶插入并整合到正在合成的DNA鏈中，同時(shí)不影響細(xì)胞的正常功能，因此BrdU是研究細(xì)胞增殖較為理想的標(biāo)記物[10]。SGZ區(qū)新生的神經(jīng)干細(xì)胞能標(biāo)記上BrdU，且一旦標(biāo)記上BrdU，該細(xì)胞將會(huì)始終帶有BrdU。SGZ區(qū)被BrdU標(biāo)記的細(xì)胞可能是神經(jīng)干細(xì)胞，也可能是已經(jīng)發(fā)生分裂或分化的神經(jīng)干細(xì)胞的子細(xì)胞。

為了研究丙烯酰胺對(duì)海馬組織中增殖相關(guān)基因的影響，筆者通過大量查閱前人在增殖相關(guān)基因方面的研究成果，發(fā)現(xiàn)JNK信號(hào)通路參與神經(jīng)元增殖、凋亡過程，而JNK3是JNK信號(hào)通路的關(guān)鍵分子。JNK有JNK1、JNK2和JNK3 3種亞型，前2個(gè)分布在機(jī)體大部分組織中，JNK3只特異性地在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)并起細(xì)胞保護(hù)作用[11]。另外，與細(xì)胞增殖相關(guān)的PI3K信號(hào)通路中有2個(gè)關(guān)鍵分子Akt和Gsk-3β。Akt又稱PKB，研究表明,Akt與成纖維母細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及神經(jīng)元的增殖相關(guān)[12]。Rho家族蛋白也是目前研究細(xì)胞增殖相關(guān)基因的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)觀察了丙烯酰胺中毒對(duì)小鼠形態(tài)的學(xué)影響及齒狀回中神經(jīng)干細(xì)胞的增殖變化，并對(duì)與增殖相關(guān)的基因進(jìn)行深入分析，以期為研究丙烯酰胺毒性機(jī)理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物10周齡昆白種小鼠20只，體質(zhì)量(30±2) g/只，雄性，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院。

1.1.2主要試劑和儀器丙烯酰胺分析純(含量≥99.9%，Amresco)、BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷，bromodeoxyuridine，Sigma)、大鼠抗BrdU IgG(Serotec，Düsseldorf，Germany)、生物素化兔抗大鼠IgG(武漢博士德)、SABC(Streptavidin，HRP conjugated,武漢博士德，bse-0437P)、Trizol(Invitrogen)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo scientific)和DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司)；VT1000S振蕩切片機(jī)(Leica)、Observer Z1結(jié)構(gòu)照明顯微鏡(Zessi)、PCR儀(Bio-Rad)、體視顯微鏡(浙江瞬宇)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與處理試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組(生理鹽水， 10只)和丙烯酰胺染毒組(50 mg/kg，10只，連續(xù)腹腔注射14 d)。試驗(yàn)第15天按50 mg/kg劑量腹腔注射BrdU，每只小鼠注射量為2 次/d(間隔12 h)，連續(xù)3 d，最后一次注射BrdU后24 h灌注取材。試驗(yàn)期間，小鼠自由飲水和取食，每天光照及黑暗各12 h，溫度(25±3) ℃，相對(duì)濕度30%～73%，每天觀察小鼠的進(jìn)食、活動(dòng)、反應(yīng)、死亡等情況并做好記錄。

(1)取材。先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.56%戊巴比妥鈉腹腔注射，待小鼠麻醉后，將其腹部朝上放置在蠟盤上固定四肢，用剪刀快速從腹腔中部剪開，經(jīng)兩側(cè)剪至膈膜直達(dá)胸腔，使小鼠心臟充分暴露。在小鼠未死亡狀態(tài)下將灌注針插入左心室，并迅速剪破右心房，灌注質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水使其通過血液循環(huán)系統(tǒng)排盡小鼠體內(nèi)血液，待流出液清亮?xí)r關(guān)閉生理鹽水閥門，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛(PFA)持續(xù)灌注固定10 min左右，至小鼠身體僵硬、肝臟和眼球發(fā)白時(shí)，開顱取小鼠大腦。用振蕩切片機(jī)進(jìn)行冠狀切片(厚度50 μm)，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

(2)染色。①取海馬冠狀切片，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3% H2O2漂洗10 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶；②0.1 mol/L PB(pH 7.4)充分漂洗，用蒸餾水緩沖處理10 min；③加入2 mol/L HCl在37 ℃條件下孵育30 min；④0.1 mol/L (pH 8.5)硼酸溶液充分漂洗(15 min/次，3次)；⑤加入一抗大鼠抗BrdU(1∶1 000)4 ℃孵育過夜；⑥PB漂洗，加入二抗生物素化兔抗大鼠(1∶300) 4 ℃孵育過夜；⑦PB漂洗，加入SABC(1∶300 Streptavidin)室溫孵育1 h；⑧PB漂洗，DAB顯色試劑盒顯色2 min，PB漂洗并經(jīng)梯度酒精脫水和二甲苯透明后中性樹膠封片觀察。

1.2.2BrdU陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)在結(jié)構(gòu)照明顯微鏡下觀察DAB染色切片，統(tǒng)計(jì)齒狀回SGZ區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量，測(cè)量整個(gè)齒狀回SGZ區(qū)的長度，門區(qū)(hilus)內(nèi)的BrdU陽性細(xì)胞不作統(tǒng)計(jì)，計(jì)算齒狀回SGZ區(qū)單位長度(1 000 μm)內(nèi)的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.3細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)本試驗(yàn)選取與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因,包括JNK3、Akt1、Gsk-3β、RhoA、Rac1，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)各基因的特異性引物(表1)，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。試驗(yàn)結(jié)束后，小鼠斷頸處死，體視顯微鏡下分離小鼠左右兩側(cè)的海馬組織，參照Trizol法提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板，RT-PCR檢測(cè)海馬中各增殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增結(jié)果，用Image J軟件對(duì)PCR產(chǎn)物條帶進(jìn)行灰度值分析，以各增殖基因與內(nèi)參基因GAPDH灰度值的比值作為該基因的相對(duì)表達(dá)量。

表 1　本研究RT-PCR中所用的引物序列Table 1　Primer sequence for RT-PCR

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism v5.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1丙烯酰胺對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)行為和體質(zhì)量的影響

試驗(yàn)開始前各組小鼠體質(zhì)量為(30±2) g/只，無明顯差異。試驗(yàn)后各組小鼠運(yùn)動(dòng)行為和體質(zhì)量變化如圖1所示。由圖1可知，對(duì)照組小鼠正常采食飲水，被毛整潔有光澤，行為活動(dòng)正常(圖1-A)，體質(zhì)量(31.38±1.21) g/只。經(jīng)過14 d丙烯酰胺腹腔注射染毒的染毒組小鼠被毛粗亂無光澤，精神萎靡，走路搖擺，后肢無力，有時(shí)走路后肢呈劈叉姿勢(shì)(圖1-B)，無法站立；染毒組小鼠采食量和飲水量均下降，體質(zhì)量(26.62±1.49) g/只，極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)(圖1-C)。

圖 1　丙烯酰胺對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)行為和體質(zhì)量的影響 A.對(duì)照組；B.丙烯酰胺染毒組；C.小鼠體質(zhì)量變化 *、**分別表示與對(duì)照組有顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)差異，下圖同F(xiàn)ig.1　Effect of acrylamide on motor behavior and body weight of mice A.Control group;B.Acrylamide poisoning group;C.Body weight change * and ** represent significantly(P<0.05) and very significantly(P<0.01) difference compared with the control group,respectively.The same below

2.2丙烯酰胺對(duì)小鼠齒狀回中成體神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響

對(duì)照組小鼠BrdU陽性細(xì)胞多成簇存在，胞體呈橢圓形、胞核多濃染(圖2-A,B)，丙烯酰胺染毒組小鼠BrdU陽性細(xì)胞胞體形態(tài)、胞核染色深淺程度(圖2-C,D)與對(duì)照組無明顯差異，神經(jīng)干細(xì)胞主要集中在齒狀回的亞顆粒細(xì)胞層。對(duì)每個(gè)小鼠的齒狀回SGZ區(qū)BrdU陽性細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠單位長度齒狀回中BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量平均為29.53個(gè)，丙烯酰胺染毒組陽性細(xì)胞數(shù)量平均為 19.86 個(gè)(圖2-E)，丙烯酰胺染毒組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照組極顯著降低了33.90%(P<0.01)。

圖 2　丙烯酰胺對(duì)小鼠齒狀回中成體神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響 A.對(duì)照組；B.圖A放大效果圖；C.丙烯酰胺染毒組;D.圖C放大效果圖；E.2組小鼠BrdU陽性細(xì)胞數(shù)比較 圖A、C標(biāo)尺長度為100 μm，B、D標(biāo)尺長度為10 μmFig.2　Influence of acrylamide on proliferation of adult neural stem cells in dentate gyrus of mice A.Control group;B.Amplification of picture A;C.Neural stem cell of dentate gyrus in acrylamide poisoning group; D.Amplification of picture C;E.Number of BrdU positive cells in the two groups; Scale length in picture A and C is 100 μm while that in B and D was 10 μm

2.3丙烯酰胺對(duì)小鼠海馬組織中增殖相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

圖3顯示，在JNK3、Akt1、Gsk-3β、RhoA、Rac1這些增殖相關(guān)基因中，mRNA表達(dá)量變化最為明顯的是Gsk-3β，丙烯酰胺染毒組小鼠海馬組織中Gsk-3β的mRNA表達(dá)量比對(duì)照組升高約3倍，差異極顯著(P<0.01)。其次是Akt1，其mRNA表達(dá)量比對(duì)照組升高2倍多，差異極顯著(P<0.01)。再次是RhoA，其mRNA表達(dá)量較對(duì)照組極顯著升高(P<0.01)。與對(duì)照組相比，丙烯酰胺染毒組小鼠海馬組織中JNK3和Rac1的mRNA表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)。丙烯酰胺染毒后引起小鼠海馬組織中各增殖相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生變化，說明丙烯酰胺中毒會(huì)導(dǎo)致小鼠海馬組織中這些基因表達(dá)量不同程度的升高。

圖 3　丙烯酰胺染毒后小鼠海馬組織中 各增殖相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.3　Relative expression of proliferation genes in hippocampus of mice after acrylamide poisoning

3討論

丙烯酰胺是一種中等毒性的親神經(jīng)毒物，水溶性強(qiáng)，可通過多種途徑進(jìn)入生物體內(nèi)，引起不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，Smith等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在高劑量丙烯酰胺中毒時(shí)，動(dòng)物機(jī)體不僅會(huì)出現(xiàn)周圍神經(jīng)受損的癥狀，而且還會(huì)出現(xiàn)中樞神經(jīng)受損癥狀。本試驗(yàn)中，對(duì)小鼠進(jìn)行丙烯酰胺染毒后，觀察到小鼠走路震顫,后肢無力,有時(shí)走路后肢呈劈叉姿勢(shì)等，這與Smith等[13]研究中所述癥狀相符，說明丙烯酰胺通過損傷小鼠神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙。

哺乳動(dòng)物成體神經(jīng)發(fā)生主要存在于海馬結(jié)構(gòu)中的齒狀回和側(cè)腦室壁的室周帶。通過改變環(huán)境條件和提高機(jī)體代謝可以刺激成體神經(jīng)發(fā)生，如加強(qiáng)鍛煉、豐富生存環(huán)境或限制飲食等[14]。本試驗(yàn)中丙烯酰胺染毒組小鼠齒狀回中的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量、體質(zhì)量均顯著降低，與Hee等[15]有關(guān)成體神經(jīng)發(fā)生的研究結(jié)果相符，但在Hee等[15]的試驗(yàn)中，染毒組小鼠與對(duì)照組小鼠體質(zhì)量沒有表現(xiàn)出明顯差異，可能是動(dòng)物品系、耐藥性等因素導(dǎo)致的。丙烯酰胺能影響小鼠成體神經(jīng)發(fā)生，推測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量降低是導(dǎo)致小鼠運(yùn)動(dòng)行為障礙的因素之一。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丙烯酰胺染毒組小鼠海馬組織中，JNK3 mRNA表達(dá)量升高，齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量減少，這與前人“JNK3高表達(dá)能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡”的研究結(jié)論[16-17]一致。研究發(fā)現(xiàn)，Gsk-3β與神經(jīng)干細(xì)胞增殖相關(guān)，在小鼠發(fā)育時(shí)期，敲除Gsk-3β后，整個(gè)腦中神經(jīng)前體細(xì)胞大量增殖[18]。據(jù)此可以推斷Gsk-3β是阻礙細(xì)胞增殖的一個(gè)因素。本研究中丙烯酰胺染毒小鼠海馬組織中Gsk-3β的mRNA表達(dá)量升高，齒狀回中神經(jīng)干細(xì)胞減少。

研究發(fā)現(xiàn)，活化的Akt能促進(jìn)細(xì)胞增殖，若雙敲除Akt1/Akt2，細(xì)胞增殖速度明顯減慢[19]。另外，Wu等[20]用一種降血脂藥物處理腦損傷小鼠后，其海馬組織中的Akt磷酸化水平升高，齒狀回SGZ區(qū)中的神經(jīng)干細(xì)胞增殖數(shù)量增加。但Akt2并不介導(dǎo)細(xì)胞增殖[21]，因此本試驗(yàn)只檢測(cè)了Akt1轉(zhuǎn)錄水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，丙烯酰胺染毒組小鼠Akt1的mRNA水平極顯著升高，但齒狀回中的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量卻極顯著降低，與Wu等[20]結(jié)果不同的原因可能在于蛋白表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄水平不同，蛋白水平上存在著活性調(diào)節(jié)，本試驗(yàn)結(jié)果說明，丙烯酰胺可能不是通過Akt1途徑來影響成體神經(jīng)發(fā)生的。

Rho家族蛋白是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子， 以多種信號(hào)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的行為與功能，如細(xì)胞收縮、分裂、遷移、凋亡等[22]。Pierre等[23]研究發(fā)現(xiàn)，RhoA的持續(xù)性激活能阻止細(xì)胞中DNA從G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而阻止細(xì)胞分裂。這與本試驗(yàn)中RhoA表達(dá)量升高、神經(jīng)干細(xì)胞增殖降低的結(jié)果相一致。另外，在大腦發(fā)育過程中，SVZ區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖和分化都需要Rac1的參與[24]。但是對(duì)于Rac1的具體功能尚不清楚，本試驗(yàn)中Rac1表達(dá)量升高，推測(cè)其可能也參與了成體神經(jīng)干細(xì)胞的增殖抑制。

由于本研究僅檢測(cè)了增殖相關(guān)基因mRNA水平的變化，而未檢測(cè)其蛋白水平的變化，因此對(duì)丙烯酰胺影響成體神經(jīng)發(fā)生的具體途徑，以及這種影響與增殖基因表達(dá)之間的關(guān)系，仍有待進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Exon J H.A review of the toxicology of acrylamide [J].Toxicol Environ Health B Crit Rev,2006,9:397-412.

[2]Parzefall W.Minireview on the toxicity of dietary acrylamide [J].Food and Chemical Toxicology,2008,6:1360-1364.

[3]Tardiff R G,Gargas M L,Kirman C R,et al.Estimation of safe dietary intake levels of acrylamide for humans [J].Food and Chemical Toxicology,2010,48:658-667.

[4]Haase N U,Grothe K H,Matthaus B,et al.Acrylamide formation and antioxidant level in biscuits related recipe and baking [J].Food Additives & Contaminants Part A,2012,29:1230-1238.

[5]Lopachin R M,Ross J F,Reid M L,et al.Neurological evaluation of toxic axonopathies in rats:Acrylamide and 2,5-hexanedione [J].Neurotoxicology,2002,23:95-110.

[6]Lopachin R M.The changing view of acrylamide neurotoxicity [J].Neurotoxicology,2004,25:617-630.

[7]Konefal S,Elliot M,Crespi B.The adaptive significance of adult neurogenesis:an integrative approach [J].Frontiers in Neuroanatomy,2013,7(21):1-21.

[8]Cameron H A,Mckay R D.Adult neurogenesis produces a lar-ge pool of new granule cells in the dentate gyrus [J].J Comp Neurol,2001,435(4):406-417.

[9]Zhao C M,Deng W,Gage F H.Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis [J].Cell,2008,132:645-660.

[10]Philippe T.BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis:Paradigms,pitfalls,limitations,and validation [J].Brain Research Reviews,2007,53(1):198-214.

[11]Kuan C Y,Whitmarsh A J,Yang D D,et al.A critical role of neural-specificJNK3 for ischemic apoptosis [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2003,25(100):15184-15189.

[12]Wu H T,Lu D Y,Jiang H,et al.Simvastatin-mediated upregulation of VEGF and BDNF,activation of the PI3K/Akt pathway,and increase of neurogenesis are associated with therapeutic improvement after traumatic brain injury [J].Journal of Neurotrauma,2008,25:130-139.

[13]Smith E A,Oehme F W．Acrylamide and polyacrylarnide：A review of production，use，environmental fate and neurotoxicity [J].Rev Environ Health,1991,9:215-228．

[14]Lee J,Duan W,Mattson M P.Evidence that brain-derived neurotrophic factor is required for basal neurogenesis and mediates,in part,the enhancement of neurogenesis by dietary restriction in the hippocampus of adult mice [J].Neurochem,2002,82:1367-1375.

[15]Hee R P,Kim M S,Kim S J.Acrylamide induces cell death in neural progenitor cells and impairs hippocampal neurogenesis [J].Toxicology Letters,2010,193(3):86-93.

[16]Mathias G,Sevgie E,Thomas H,et al.C-Jun N-terminal kinases (JNKs) and the cytoskeleton-functions beyond neurodegeneration [J].International Journal of Developmental Neuroscience,2004,22(7):559-564.

[17]Yang D D,Kuan C Y,Whitmarsh A J,et al.Absence of excitotoxicity-induced apoptosis in the hippocampus of mice lacking theJNK3 gene [J].Nature,1997,38(9):865-870.

[18]Kim W Y,Wang X S,Wu Y H,et al.GSK-3 is a master regulator of neural progenitor homeostasis [J].Nature Neuro Science,2009,12:1390-1397.

[19]Jennifer E,Skeen P T,Chen C C,et al.Akt deficiency impairs normal cell proliferation and suppresses oncogenesis in a p53- independent and mTORC1-dependent manner [J].Cancer Cell,2006,10(4):269-280.

[20]Wu H T,Lu D Y,Jiang H,et al.Increase in phosphorylation of Akt and its downstream signaling targets and suppression of apoptosis by simvastatin after traumatic brain injury [J].J Neurosurg,2008,109: 691-698.

[21]Lisa H M,Celine F,Vanessa R,et al.Only Akt1 is required for proliferation,whileAkt2 promotes cell cycle exit through p21 binding [J].Molecular and Cellular Biology,2006,26(22):8267-8280.

[22]宋雪慧,辛蓮,周俊松,等.Rac1蛋白表達(dá)與神經(jīng)前體細(xì)胞增殖分化的關(guān)系 [J].蘇州學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,29(2):201-203.

Song X H,Xin L,Zhou J S,et al.The relations between Rac1 expression and neural progenitor proliferation [J].Journal of Suzhou (Medicine Edition),2009,29(2):201-203.

[23]Pierre M,Cristin A F,Michael F.Olson constitutively activeRhoAinhibits proliferation by retarding G1 to S phase cell cycle progression and impairing cytokinesis [J].Eur J Cell Biol,2009,88(9):495-507.

[24]Dino P,Leone,Karpagam S,et al.The Rho GTPaseRac1 is required for proliferation and survival of progenitors in the developing forebrain [J].Dev Neurobiol,2010,70(9):659-678.

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-06-0816:2110.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.006

[收稿日期]2014-12-10

[基金項(xiàng)目]西北農(nóng)林科技大學(xué)人才引進(jìn)專項(xiàng)基金項(xiàng)目(Z-111021101)

[作者簡介]張亞妹(1991-)，女，安徽蚌埠人，在讀碩士，主要從事分子神經(jīng)生物學(xué)研究。E-mail：xinongzhangyamei@126.com [通信作者]趙善廷(1964-)，男，新疆烏魯木齊人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子神經(jīng)生物學(xué)研究。 E-mail：zhaoshanting@nwsuaf.edu.cn

[中圖分類號(hào)]S852.21

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)07-0039-06

Influence of acrylamide on adult neurogenesis and expression of proliferation associated genes of mouse

ZHANG Yamei,WANG Jiutao,SONG Lingzhen,ZHANG Wei,LI Lingling,YAN Runchuan,HU Xinde,ZHAO Shanting

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 This study investigated the influence of acrylamide poisoning on adult neurogenesis and expression of proliferation associated genes in hippocampus of mouse.【Method】 Twenty 10-week old male adult Kunbai mice with body weight of (30±2) g were randomly divided into control group and acrylamide exposure group.Acrylamide exposure group were exposed to acrylamide by intraperitoneal injection with a dose of 50 mg/kg for 14 days before injection of 50 mg/kg BrdU for 3 days and twice per day.The changes in body weight and behavioral activity was observed.Immunohistochemistry and BrdU labeling were used to investigate the effect on number of neural stem cells in the subgranular zone(SGZ).Influences of acrylamide on the expression of proliferation associated genes (JNK3,Akt1,Gsk-3β,RhoA and Rac1) were also examined using RT-PCR.【Result】 Result showed that the body weight of acrylamide exposed mice was significantly lower than that of the control group.The mice in acrylamide exposed group were listless with weak hind limbs,which showed splitting position when walking.BrdU-positive cells in experimentally acrylamide exposed mice were extremely significantly decreased compared with that in the control group (P<0.01).JNK3 and Rac1 mRNA expressions were remarkably increased (P<0.05),while Akt1,Gsk-3β and RhoA mRNA expressions were very significantly increased (P<0.01).【Conclusion】 Acrylamide poisoning suppressed the proliferation of adult neural stem cells of dentate gyrus in mouse and influenced the expression of JNK3,Akt1,Gsk-3β,Rac1 and RhoA in mouse hippocampus.

Key words:acrylamide poisoning;adult neurogenesis;immunohistochemistry;proliferation-associated gene

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