HPLC法同時(shí)測(cè)定生發(fā)片中二苯乙烯苷和特女貞苷的含量

曲珍儀　胡　燕　劉　穎*

1. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東　廣州　510006；2. 廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣西　南寧　530000

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HPLC法同時(shí)測(cè)定生發(fā)片中二苯乙烯苷和特女貞苷的含量

曲珍儀1胡燕2劉穎1*

1. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006；2. 廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣西南寧530000

【摘要】目的：建立HPLC同時(shí)測(cè)定生發(fā)片中二苯乙烯苷和特女貞苷含量的方法。方法：樣品用70%甲醇超聲提取。色譜柱：Inertsil ODS-3-C18(5μm，250mm×4.6mm)；流動(dòng)相：乙腈-水(17∶83)；檢測(cè)波長(zhǎng)：224nm；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：10ml。結(jié)果：二苯乙烯苷在0.01618～0.2426mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999)，平均加樣回收率為100.1%(n=6)，RSD=1.84%；特女貞苷在0.0816～1.224mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9998)，平均加樣回收率為100.6%(n=6)，RSD=1.38%。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，可作為生發(fā)片的質(zhì)量控制方法。

【關(guān)鍵詞】生發(fā)片；二苯乙烯苷；特女貞苷；高效液相色譜法；含量測(cè)定

Simultaneous determination of the content of 2,3,5,4′-tetrahydroxystibene-2-O-β-D-glucoside and

生發(fā)片收載于《中藥成方制劑》第十七冊(cè)[1]，由何首烏、女貞子、山藥、黑棗、黑豆、茯苓、牡丹皮、地黃、墨旱蓮、澤瀉、桑葚、麥冬12味中藥組成，具有滋補(bǔ)肝腎、益氣養(yǎng)血、生發(fā)烏發(fā)之功效，主要用于肝腎不足、氣血虧虛所致的頭發(fā)早白、脫落、斑禿、全禿和脂溢性脫發(fā)。二苯乙烯苷是何首烏特有的生物活性成分[2]，研究表明二苯乙烯苷能夠誘導(dǎo)小鼠 B16 細(xì)胞色素沉著[3]，并且通過(guò)誘導(dǎo)休眠毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期促進(jìn)頭發(fā)的生長(zhǎng)[4]。特女貞苷是女貞子中重要的水溶性活性成分[5]，女貞子水煎劑能增強(qiáng)小鼠毛囊肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)mRNA的表達(dá)，對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠觸須毛囊有明顯的促生長(zhǎng)作用[6-7]。生發(fā)片原標(biāo)準(zhǔn)中只有還原糖的鑒別，無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，為了更好地控制生發(fā)片的質(zhì)量，研究采用HPLC同時(shí)測(cè)定了本品中二苯乙烯甘和特女貞苷含量。

1儀器與材料

1.1儀器Agilent 1200高效液相色譜儀(VWD檢測(cè)器，Agilent1200化學(xué)工作站)；賽多利斯BSA224S-CW型電子天平(精確度為十萬(wàn)分之一)；SB-4200 DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)。

1.2材料特女貞苷對(duì)照品(批號(hào)：111926-201404)、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào)：110844-201512)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；生發(fā)片(批號(hào)：1512079 T家);乙腈為色譜純；水為超純水;其他試劑為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Inertsil ODS-3-C18(5μm，250mm×4.6mm)；流動(dòng)相：乙腈-水(17∶83)；柱溫：25℃；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：224nm；進(jìn)樣量：10ml。

2.2溶液制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取特女貞苷和二苯乙烯苷對(duì)照品適量，置25ml容量瓶中，加70%甲醇溶解定容到刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度分別為1.02和0.202mg/ml的特女貞苷和二苯乙烯苷混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取上述儲(chǔ)備液1.0ml置10ml容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得0.102mg/ml的特女貞苷和0.0202mg/ml的二苯乙烯苷混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備取本品20片，除去包衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取約4.0g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50ml 70%甲醇，稱(chēng)定重量，超聲(功率 400W，頻率 40kHz)30min，放冷，再稱(chēng)定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液的制備按照生發(fā)片的制備工藝，分別制備不含何首烏和女貞子的陰性樣品，參照供試品溶液的制備方法同法操作，制備陰性對(duì)照溶液。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，按照“2.1” 項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)。記錄色譜圖，理論塔板數(shù)按二苯乙烯苷峰計(jì)不低于6000，按特女貞苷峰計(jì)算不低于7000；二苯乙烯苷和特女貞苷與其他組分的分離度均>1.5；供試品溶液中二苯乙烯苷和特女貞苷的色譜峰與對(duì)照品溶液一致，陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3.2線性關(guān)系考察分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.3、0.5、1、2、3ml，置25ml容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以混合對(duì)照品的進(jìn)樣量(mg)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到二苯乙烯苷的回歸方程為Y=3787.6X+1.4319，r=0.9999；特女貞苷的回歸方程為Y=985.26X+5.5701，r=0.9998。線性范圍分別為0.01618～0.2426mg、0.0816～1.224mg，結(jié)果表明，各成分在各自濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3.3精密度試驗(yàn)精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下的對(duì)照品溶液， 按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得二苯乙烯苷峰面積的RSD=0.33%、特女貞苷峰面積的RSD=0.12%，結(jié)果表明精密度良好。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)取生發(fā)片(批號(hào)：1512079)，按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法，平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別測(cè)定含量。得二苯乙烯苷和特女貞苷的平均含量分別為0.1643mg/g、1.5631mg/g，RSD分別為0.71%、1.2%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取生發(fā)片(批號(hào)：1512079)，按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別在制備后的第0、2、4、6、8、12h進(jìn)樣，記錄二苯乙烯苷和特女貞苷的峰面積，計(jì)算RSD分別0.34%和0.92%，結(jié)果表明，供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好，能夠滿足試驗(yàn)要求。

2.3.6加樣回收試驗(yàn)精密稱(chēng)定已知含量的生發(fā)片(批號(hào)：1512079，二苯乙烯苷含量約為0.3286mg、特女貞苷含量約為3.1262mg)6份，每份約2.0g，精密加入混合對(duì)照品溶液(含二苯乙烯苷0.06604mg/ml、特女貞苷0.6252mg/ml)5ml，按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果二苯乙烯苷的平均回收率為100.1%，RSD=1.84%；特女貞苷的平均回收率為100.6%，RSD=1.38%。

2.4樣品測(cè)定取5批供試品，按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下的色譜條件下進(jìn)行進(jìn)樣分析，測(cè)定二苯乙烯苷和特女貞苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

3討論

3.1流動(dòng)相的選擇分別對(duì)甲醇-水、乙腈-水和乙腈-酸三個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了考察，結(jié)果乙腈-水系統(tǒng)的分離度和峰形均比甲醇-水系統(tǒng)好，乙腈-酸系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)差別不大，考慮到色譜柱的使用壽命和操作問(wèn)題，選擇乙腈-水做為流動(dòng)相。

表1　生發(fā)片中二苯乙烯苷和特女貞苷的含量測(cè)定　(n=5)

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇分別用70%甲醇配制二苯乙烯苷和特女貞苷的對(duì)照品溶液，在波長(zhǎng)200～400nm范圍內(nèi)掃描，圖譜顯示在224nm處特女貞苷有最大吸收，二苯乙烯苷在224nm和320nm處均與較強(qiáng)吸收，因此，選擇224nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。見(jiàn)圖2。

3.3對(duì)提取溶劑的考察比較了甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇和稀乙醇在相同提取條件下對(duì)二苯乙烯苷和特女貞苷的提取率，結(jié)果表明，70%甲醇和甲醇的提取率均較高，考慮到生產(chǎn)成本，確定70%甲醇為提取溶劑。

3.4提取方法和提取時(shí)間的考察比較了超聲和加熱回流兩種提取方法對(duì)二苯乙烯苷和特女貞苷提取率的影響，結(jié)果表明，兩種方法的提取率接近，由于超聲提取的操作更加簡(jiǎn)單，所以選擇超聲提取。分別對(duì)15、30、45、60min超聲時(shí)間做了對(duì)比，結(jié)果顯示30min即可將上述兩種成分提取完全，所以將超聲時(shí)間定為30min。

綜上所述，本方法可以簡(jiǎn)單快速地測(cè)定生發(fā)片中二苯乙烯苷和特女貞苷的含量，專(zhuān)屬性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，可以更好地控制生發(fā)片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)性，同時(shí)為含有何首烏和女貞子的制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考，可以提高分析效率，降低分析成本。

參考文獻(xiàn)

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作者簡(jiǎn)介：曲珍儀(1990-)，女，碩士研究生。E-mail：littlefish929@163.com 通信作者： 劉穎(1974-)，女，博士，教授，主要從事中藥有效物質(zhì)的基礎(chǔ)研究。E-mail：2404600230@qq.com

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)12-0011-03

(收稿日期：2016.04.21)

Specnuezhenide in Shengfa Tablets by HPLC

QU Zhenyi1HU Yan2LIU Ying1*

1. College of traditional Chinese medicine of Guang Dong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China;2. Bai hui Pharmaceutical Co．Ltd．Guangxi,Nanning 530000,China

Abstract:Objective To determine the content of 2,3,5,4′-tetrahydroxystibene-2-O-β-D-gluco side and Specnuezhenide in Shengfa Tablets by HPLC. Methods Samples were extracted by 70%methanol ultrasonic，then analyzed on the Inertsil ODS-3-C18(5μm，250mm×4.6mm)with the mobile phase acetonitrile-water(17∶83). Detect wavelength was 224nm，f-low rate was 1.0ml/minand injection volume was 10ml．Results The linear range of 2,3,5,4′-tetrahydroxystibene-2-O-β-D-glucoside was 0.01618～0.2426mg(r=0.9999)，and the average recovery was 100.1% with RSD of 1.84%(n=6)． The linear range of Specnuezhenide was 0.0816～1.224mg(r=0.9998)，and the average recovery was 100.6% with RSD of 1.38%(n=6)．Conclusion The method is simple and accurate for the quality control of Shengfa Tablets．

Key words:Shengfa Tablets；2,3,5,4′-tetrahydroxystibene-2-O-β-D-glucoside；Specnuezhenide；HPLC；determination of content