超聲協(xié)同酶法提取紫花苜蓿多酚及其抗氧化性質(zhì)

施偉梅，吳龍火，楊 翔，楊 莎

(贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000)

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超聲協(xié)同酶法提取紫花苜蓿多酚及其抗氧化性質(zhì)

施偉梅，吳龍火，楊 翔，楊 莎

(贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000)

摘要：采用超聲協(xié)同酶法提取紫花苜蓿多酚。以多酚提取量為指標，考察了液料比、加酶量、酶解時間、超聲時間、超聲溫度及pH 6個因素對多酚提取效果的影響，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化該提取工藝。同時探討其抗氧化活性。結(jié)果表明，超聲協(xié)同酶法提取紫花苜蓿多酚的最佳工藝條件為酶量4.9%、超聲時間74 min、超聲溫度49 ℃，多酚提取量可達3.642 mg·g-1。此外，紫花苜蓿多酚具有較好的抗氧化活性，其清除DPPH和·OH自由基的半數(shù)抑制濃度IC50分別為10.78和19.28 μg·mL-1。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；超聲波；多酚；紫花苜蓿

紫花苜蓿(Medicagestativa)為多年生豆科苜蓿屬植物，在我國長江西北、華北、東北、西北地區(qū)均有種植，是我國的主產(chǎn)牧草之一，因其強適應(yīng)性、高產(chǎn)草量、營養(yǎng)均衡且品質(zhì)極佳等優(yōu)點而被譽為是“牧草之王”[1-3]。研究表明,紫花苜蓿中含有蛋白質(zhì)、黃酮、多糖、揮發(fā)油、香豆素以及多酚等多種活性成分，具有很高的藥用價值[4-9]。多酚類化合物是形成植物固體部分的重要組成物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防高血壓、抗血栓、抗菌、抗炎等生物活性及具有皮膚保健、美容等功能[10-14]，因而受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。但目前為止有關(guān)紫花苜蓿中多酚類物質(zhì)的研究報道仍然較少。劉杰等[15]采用Folin-Ciocaileu 比色法對苜蓿種子中總多酚的含量進行了檢測，其含量為3.03～4.88 mg·g-1；燕雪花等[16]采用乙醇回流法對新疆不同地區(qū)紫花苜?？偠喾舆M行了提取，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地紫花苜?？偠喾雍看嬖陲@著差異。

超聲協(xié)同酶提取方法能最大限度破壞細胞壁、增大其通透作用，有利于細胞內(nèi)含物滲出，進而大大增加植物有效成分的提取量，且能保持其它物質(zhì)的原生結(jié)構(gòu)，成為目前植物成分提取的熱門方法之一[17-19]。筆者采用超聲協(xié)同酶法對河北省懷來縣紫花苜蓿多酚的提取工藝進行了探討，建立紫花苜蓿中多酚提取的新方法，并研究了其提取物清除DPPH自由基和·OH自由基的能力，旨在為紫花苜蓿的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試驗材料

紫花苜蓿，2015年2月采集于河北省懷來縣，用去離子水洗凈晾干后，于50 ℃烘箱中烘干24 h，粉碎，過0.25 mm篩，于干燥器中保存?zhèn)溆谩]食子酸對照品(HPLC≥98%)，中國藥品生物制品檢定所；纖維素酶為江蘇銳陽生物科技有限公司生產(chǎn)，5萬U·g-1；維生素C(Vc)標準品(HPLC≥99%)，上海金穗生物科技有限公司；K3Fe(CN)6、FeCl3、磷酸氫二鈉、鄰二氮菲、檸檬酸及乙醇等試劑均為分析純。

1.2試驗方法

1.2.1沒食子酸標準曲線的建立精密稱取沒食子酸對照品19.70 mg，加50%乙醇溶解定容至50 mL，配成濃度為394.0 μg·mL-1溶液，再移取4 mL該溶液用50%乙醇稀釋成100 mL, 配成濃度為15.76 μg·mL-1的沒食子酸標準溶液備用。精確量取沒食子酸標液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL，分別置于10 mL容量瓶中，依次加入濃度均為0.100 mol·L-1的HCl溶液、FeCl3溶液和K3Fe(CN)6溶液各0.5 mL，搖勻，用50%乙醇定容后于室溫避光放置20 min，以不加沒食子酸標液的相應(yīng)溶液作空白，在700 nm處測定吸光度，重復(fù)3次，取平均值繪制沒食子酸質(zhì)量濃度與吸光度的標準曲線。所得回歸方程為：y=0.198 1x+0.001 33，R2=0.999 2，式中y為標液的吸光度，x為沒食子酸的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)。

1.2.2紫花苜蓿多酚含量的提取工藝及測定精確稱取適量的紫花苜蓿粉末于10 mL比色管中，加入一定量纖維素酶，用50%乙醇溶液定容至刻度，在適當?shù)拿附鉁囟取r間和pH下，按照設(shè)定的條件進行酶法提取后，升溫到90 ℃滅酶10 min，再轉(zhuǎn)入超聲儀中，用按照設(shè)定的程序進行超聲波輔助法提取紫花苜蓿中的多酚，抽濾，濾液定容待測。

取2.0 mL上述提取液，按一定比例稀釋，用紫外分光光度計按照1.2.1法測定其吸光度，根據(jù)回歸方程標準曲線，按下式計算紫花苜蓿多酚的提取率。

式中，ρ為紫花苜蓿提取液多酚的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)；n為提取液稀釋因子；V為提取液體積(mL)；W為紫花苜蓿粉末的質(zhì)量(g)。

1.3試驗設(shè)計

1.3.1單因素試驗分別對液料比、加酶量、酶解時間、超聲時間、超聲溫度及pH共6個因素進行單因素試驗，探究各因素對紫花苜蓿多酚提取效果的影響。

1.3.2響應(yīng)面試驗設(shè)計采用響應(yīng)面法中Box-Behnken Design(BBD)中心組對紫花苜蓿多酚的超聲協(xié)同酶法提取工藝進行優(yōu)化。在對單因素結(jié)果進行分析后，應(yīng)用Design-Expert V 8.0.6軟件進行試驗設(shè)計，以加酶量(X1),超聲時間(X2)及超聲溫度(X3)為獨立變量，以紫花苜蓿多酚提取量為響應(yīng)值，以二次多項式逐步回歸分析優(yōu)化提取條件，響應(yīng)面因素與水平見表1。

表1　響應(yīng)面因素與水平表

1.3.3驗證與比較試驗過軟件分析獲得最佳提取工藝條件后，按照優(yōu)化條件進行提取測定，比較試驗結(jié)果和方程計算值的差異。

1.4紫花苜蓿多酚的抗氧化性試驗

依據(jù)上述最佳工藝條件提取紫花苜蓿多酚，并參照陳瑋琦等[20]純化蘋果(Malussieversii)枝條多酚的方法，采用AB-8大孔吸附樹脂對提取液進一步純化，再將純化液稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度的溶液備用。以清除DPPH和·OH自由基的能力為指標，Vc作為參照，對比紫花苜蓿多酚及Vc在同一質(zhì)量濃度下抗氧化活性的大小。

1.4.1清除DPPH自由基 各取2.0 mL不同質(zhì)量濃度的紫花苜蓿多酚純化液于10 mL具塞試管中，分別加入2.0 mL 0.08 mg·mL-1的DPPH 溶液，搖勻，待反應(yīng)30 min后，離心，于517 nm處測定其上清液的吸光度，標記為Ax1；另各取2.0 mL 不同質(zhì)量濃度的紫花苜蓿多酚純化液于10 mL具塞試管中，分別加入2.0 mL無水乙醇，在波長517 nm 處測其吸光度，標記為 Ax2；反應(yīng)30 min后的2.0 mL 0.08 mg·mL-1的DPPH溶液和2.0 mL 無水乙醇混合液做為參比，其吸光度標記為A0。平行測定3次，取平均值，依照下式計算DPPH的清除率。VC清除DPPH的對照試驗方法同上。

1.4.2清除·OH自由基取8支20 mL容量瓶，分別加入4.0 mL pH為7.4的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液、1.5 mL 7.5 mmol·L-1的鄰二氮菲溶液、1.0 mL 7.5 mmol·L-1FeSO4和 1.0 mL 0.1% H2O2，再加入2.0 mL一定質(zhì)量濃度梯度的紫花苜蓿多酚純化液，搖勻，用9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液定容。放置于37 ℃ 恒溫水浴中反應(yīng)60 min，測定其在536 nm 處的吸光度，標記為Ax；以不加紫花苜蓿多酚純化液的上述溶液為空白對照，其在536 nm 處的吸光度標記為A0。平行測定3次，取平均值，依照下式計算·OH自由基的清除率。VC清除·OH自由基的對照試驗方法同上。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1液料比對多酚提取量的影響固定酶量為2%、酶解時間為60 min、超聲時間為30 min、超聲溫度為50 ℃、pH為4.8，考察不同液料比對多酚提取效果的影響(圖1a)。隨著液料比的增大，紫花苜蓿多酚的提取量隨之增加，提取液質(zhì)量濃度則呈先增加后減少的趨勢(圖1b)，在液料比為30︰1時，多酚提取量基本達到平衡，而提取液質(zhì)量濃度達到最大值。這可能是因為隨著液料比的增大，溶劑所占比例增加，使得紫花苜蓿粉末與溶劑的接觸面積大大增加，有利于多酚類物質(zhì)的溶出，減小傳質(zhì)阻力，但同時也增加了濃縮成本，為此本試驗選擇最佳料液比為30︰1。

2.1.2加酶量對多酚提取率的影響固定液料比為30︰1、酶解時間為60 min、超聲時間為30 min、超聲溫度為50 ℃、pH為4.8，考察不同酶添加量對多酚提取量的影響(圖1c)。添加纖維素酶1%～5%(酶與紫花苜蓿粉的質(zhì)量百分數(shù))比未添加纖維素酶(0)的提取效果明顯增加，隨著纖維素酶含量的增加，提取量隨之增加，到4%時趨于平衡。這是因為在酸性條件下，纖維素酶能通過催化作用破壞紫花苜蓿的細胞壁，增加其通透性，降低多酚溶出的傳質(zhì)阻力，但是隨著纖維素酶含量的增加，溶液中酶與底物濃度達到飽和狀態(tài)，故多酚含量不再增加。因此，本試驗選擇纖維素酶的最佳添加量為4%。

2.1.3酶解時間對多酚提取率的影響固定液料比為30︰1、加酶量4%、超聲時間為30 min、超聲溫度為50 ℃、pH為4.8，考察添加不同酶解時間對多酚提取量的影響(圖1d)。紫花苜蓿的提取量隨著酶解時間的增加而增加，當酶解時間達到105 min后達到最大值。這是因為隨著反應(yīng)時間延長，酶解反應(yīng)越充分，多酚含量溶出越完全，當酶解時間為105 min時，多酚類物質(zhì)已基本溶出，因此，延長酶促時間并不能提高提取效果，反而有可能會導(dǎo)致多酚類物質(zhì)遭到破壞。為此，本試驗選擇最佳酶解時間為105 min。

2.1.4超聲時間對多酚提取量的影響固定液料比為30︰1、加酶量4%、酶解時間為105 min、超聲溫度為50 ℃、pH為4.8，考察不同超聲時間對多酚提取量的影響(圖1e)。超聲波的破壁效應(yīng)和熱效應(yīng)能使埋藏在細胞內(nèi)部的多酚類物質(zhì)徹底溶解出來，隨著時間增長，細胞通透性增加，多酚的自溶速率增快，因此紫花苜蓿多酚提取量逐漸增加。當達到60 min時多酚提取量達到最大值，而后提取效果急劇減弱，這可能是因為隨著時間的延長細胞內(nèi)外多酚類物質(zhì)濃度差減小，傳質(zhì)阻力增加，不利于多酚的溶出，且由于時間過長，易導(dǎo)致多酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞。故本試驗選擇最佳超聲時間為60 min。

2.1.5超聲溫度對多酚提取量的影響固定液料比為30︰1、加酶量4%、酶解時間為105 min、超聲時間為60 min、pH為4.8，考察不同超聲溫度對多酚提取量的影響(圖1f)。在40～50 ℃范圍內(nèi)紫花苜蓿多酚的提取量隨著超聲溫度的升高而明顯增大，這是因為隨著溫度升高，溶劑和多酚類物質(zhì)的滲透、擴散和溶解能力大大增加，使得多酚類物質(zhì)提取量明顯增大。當超聲溫度超過50 ℃時，可能由于多酚類物質(zhì)發(fā)生氧化，品質(zhì)發(fā)生變化而導(dǎo)致檢測不出，因而提取量出現(xiàn)明顯下降。為此，本試驗選擇最適宜提取的超聲溫度為50 ℃。

圖1　各影響因素對多酚提取量的影響

2.1.6pH對多酚提取率的影響固定液料比為30∶1、酶量為4%、酶解時間為105 min、超聲時間為30 min、超聲溫度為50 ℃，考察不同pH值對多酚提取量的影響(圖1g)， pH為5.6時，紫花苜蓿多酚的提取量達到最大值，這說明pH=5.6為纖維素酶提取紫花苜蓿多酚的最佳pH值。在此pH值時，纖維素酶能發(fā)揮其最大活性，最大限度地破壞紫花苜蓿的細胞壁，降低傳質(zhì)阻力，提高紫花苜蓿多酚的溶出效率。此外，多酚類物質(zhì)容易以氫鍵的方式鍵合在一起，在弱酸性條件下有利于破壞氫鍵促使多酚類物質(zhì)的徹底釋放，因此，本研究選擇pH為5.6作為最佳試驗pH值。

2.2響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面試驗結(jié)果及方差分析根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，選取對紫花苜蓿多酚提取效果影響較大的3個因素：酶量(X1)、超聲時間(X2)和超聲溫度(X3)進行優(yōu)化試驗，試驗因素和水平設(shè)計表見表2，響應(yīng)面分析方案見表3。

由方差分析可知，一次項X1、X2、X3及二次項X22、X32的P值均小于0.05(表3)，表明酶量、超聲時間和超聲溫度對紫花苜蓿多酚的提取量均有顯著影響，其中超聲時間及超聲溫度都達到了極顯著水平(P<0.001)，各個因素對紫花苜蓿多酚提取量的影響大小順序為超聲溫度>超聲時間>酶量。交互項X1X2、X1X3、X2X3的P值均大于0.05，表明交互因子對紫花苜蓿多酚的影響并不顯著。

2.2.2最佳工藝條件的優(yōu)化及驗證對所建立的模型進行參數(shù)優(yōu)化，得到該模型的最佳提取工藝為酶量4.86%，超聲時間74.44 min，超聲溫度49.17 ℃，在此條件下提取量最大預(yù)測值可達3.665 mg·g-1。為檢驗該回歸模型預(yù)測結(jié)果的可靠性，對上述預(yù)測的最佳工藝條件進行優(yōu)化驗證。為方便操作，將此工藝條件修正為酶量4.9%，超聲時間74 min，超聲溫度49℃，進行3次平行試驗，得到的實際提取量為3.642 mg·g-1，略低于理論預(yù)測值，相對誤差僅為0.63%，說明該模型較好地預(yù)測了理論提取量，超聲聯(lián)合酶法提取紫花苜蓿多酚的工藝具有實際應(yīng)用價值。

表2　響應(yīng)曲面試驗以及響應(yīng)值

表3　響應(yīng)曲面方差分析表

注Note：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

3紫花苜蓿多酚的抗氧化性

3.1樣品對DPPH自由基的清除能力

在2.79～25.13 μg·mL-1范圍內(nèi)DPPH的清除率與紫花苜蓿多酚的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，當質(zhì)量濃度為25.13 μg·mL-1時，紫花苜蓿多酚對DPPH自由基的清除率可達到76.23%(圖2)。與Vc相比，紫花苜蓿多酚對DPPH的清除率呈先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢，而Vc則始終保持增加的狀態(tài)。當質(zhì)量濃度低于19.54 μg·mL-1時紫花苜蓿多酚及Vc對DPPH的清除率基本一致。紫花苜蓿多酚質(zhì)量濃度(X) 與清除率(Y) 的回歸方程為Y=12.70+4.174X-0.060 31X2(R2=0.961 1), 紫花苜蓿多酚清除50%DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度IC50值為10.78 μg·mL-1，Vc的質(zhì)量濃度(X) 與清除率(Y) 的回歸方程為Y=16.53+3.472X-0.024 42X2(R2=0.989 4), Vc的IC50為10.54 μg·mL-1，兩者數(shù)值相近，表明紫花苜蓿多酚具有較強清除DPPH自由基的能力。

圖2　紫花苜蓿多酚純化液及Vc對DPPH的清除效果

3.2樣品對·OH自由基的清除能力

隨著質(zhì)量濃度的增加，紫花苜蓿提取液多酚和Vc對·OH自由基的清除率不斷增大，且兩者的趨勢基本一致(圖3)。當紫花苜蓿多酚質(zhì)量濃度為28.54 μg·mL-1時，其對DPPH自由基的清除率達到70.58%。紫花苜蓿多酚清除50%·OH自由基的半數(shù)抑制濃度IC50值為19.28 μg·mL-1與Vc的IC50值(18.13 μg·mL-1)相差不大，表明紫花苜蓿多酚同樣具有較強清除·OH自由基的能力。

圖3　紫花苜蓿多酚純化液及Vc對·OH的清除效果

4結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲協(xié)同酶法提取紫花苜蓿多酚的工藝，同時對提取產(chǎn)物進行了一系列清除DPPH和·OH自由基的體外抗氧化性試驗研究。得出提取紫花苜蓿多酚的最佳工藝條件為：酶量4.9%，超聲時間74 min，超聲溫度49 ℃，多酚提取量可達3.642 mg·g-1，與預(yù)測值相比相對誤差僅為0.63%；此外，紫花苜蓿多酚對DPPH和·OH自由基均具有有較好的清除效果，IC50分別為10.78 μg·mL-1和19.28 μg·mL-1，表明紫花苜蓿多酚可作為一種天然、有效的抗氧化劑，有望廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及美容等行業(yè)。

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(責(zé)任編輯張瑾)

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0419

*收稿日期：2015-07-25接受日期：2015-10-09

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81360277)；贛南醫(yī)學(xué)院科研課題(YB201429)

通信作者：施偉梅(1985-)，女，福建云霄人，講師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物活性成分研究。E-mail: maisi540@163.com

中圖分類號：S816;S541+.1

文獻標識碼：A

文章編號：1001-0629(2016)3-0519-08* 1

Corresponding author:Shi Wei-meiE-mail:maisi540@163.com

Ultrasonic-enzyme synergistic extraction and antioxidant activity analysis of alfalfa polyphenols

Shi Wei-mei, Wu Long-huo, Yang Xiang, Yang Sha

(College of Pharmacy, Gannan Medical University, Ganzhou 341000, China)

Abstract:The polyphenols from alfalfa were extracted by ultrasonic-enzyme synergistic method. The effects of liquid-solid ratio, enzyme addition volume, enzyme incubation time, ultrasonic time, ultrasonic temperature and pH on phenol yield of alfalfa were investigated, and the extraction technology was optimized by response surface experiment. The antioxidant activities of alfalfa phenols were also studied. The results showed that the optimum technology factors for extracting alfalfa phenols were as follows: enzyme addition was 4.9%, ultrasonic time was 74 min and ultrasonic temperature was 49 ℃. Under this condition, the highest extraction quantity of total phenols could reach 3.642 mg·g-1. In addition, the phenols showed strong activities for DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) and hydroxyl radical scavenging, and the half scavenging concentration (IC50) of DPPH and ·OH radicals were 10.78 μg·mL-1and 19.28 μg·mL-1, respectively.

Key words:cellulase; ultrasonic; polyphenols; alfalfa

施偉梅，吳龍火，楊翔，楊莎.超聲協(xié)同酶法提取紫花苜蓿多酚及其抗氧化性質(zhì).草業(yè)科學(xué),2016,33(3)：519-526.

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