凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的蛋白組學(xué)分析

趙 珊 周全興 劉冬梅 吳 暉 李 理 許喜林

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣州510640）

凝結(jié)芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，兼性厭氧，具有極強的耐酸、耐鹽、耐高溫能力，最適生長溫度約45 ℃[1]。與一般乳酸菌相比，凝結(jié)芽孢桿菌對營養(yǎng)底物需求低，培養(yǎng)溫度高，不易染雜菌，產(chǎn)物中乳酸含量高[2-3]。1989年，美國FDA 批準(zhǔn)凝結(jié)芽孢桿菌用于飼料業(yè)；2004年，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布第1126 號公告批準(zhǔn)凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品用于畜牧業(yè)；2016年，國家衛(wèi)計委把凝結(jié)芽孢桿菌列入《可用于食品的菌種名單》[4]。

同步糖化發(fā)酵（Simultaneous saccharification and fermentation，SSF）是一個糖化和發(fā)酵同時進行的過程，在碳水化合物被迅速發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乙醇的同時，糖化相關(guān)的酶促反應(yīng)也在進行[5]。該技術(shù)在一定程度上可以提高產(chǎn)量，降低能耗，節(jié)約成本，并廣泛應(yīng)用于工業(yè)中[6]。趙國振等[7]以馬鈴薯淀粉為原料，經(jīng)同步糖化發(fā)酵制備乳酸，產(chǎn)量高達196.99 g/L。Wingren等[8]分別以同步糖化發(fā)酵和傳統(tǒng)分步糖化發(fā)酵2種方法生產(chǎn)乙醇，經(jīng)核算，傳統(tǒng)分步糖化發(fā)酵的生產(chǎn)成本比同步糖化發(fā)酵高35.1%。

乳酸有2種手性異構(gòu)體，分別為L-乳酸和D-乳酸。其中，只有L-乳酸能被人體代謝。高光學(xué)純度的L-乳酸可用于高端食品、生物、醫(yī)療和化工等行業(yè)，篩選能發(fā)酵產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸的菌種，探索先進的發(fā)酵技術(shù)及其理論成為當(dāng)下研究的熱點[9]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌可用于發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸。Zhou等[10]使用凝結(jié)芽孢桿菌同步糖化發(fā)酵甘蔗渣亞硫酸鹽漿，可獲得110 g/L 的L-乳酸。Wang等[11]使用凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵白米糠，可得117 g/L 的L-乳酸。此外，嗜熱凝結(jié)芽孢桿菌可以以污泥為營養(yǎng)物發(fā)酵18 h，獲得99.6 g/L的L-乳酸[12]。

蛋白組學(xué)技術(shù)是研究生物體分子變化的一種方法，可以全面了解細胞、組織、器官和體液中所有的蛋白質(zhì)及其相互作用[13]。目前，通過同位素相對標(biāo)記與絕對定量（Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)可以對蛋白質(zhì)進行定性、定量分析[14]。季青等[15]采用iTRAQ 蛋白組學(xué)技術(shù)研究大腸癌和肝癌術(shù)后肝腎陰虛證血漿的差異表達蛋白質(zhì)，篩選出用于診斷的生物標(biāo)志物。宋春花等[16]對志賀菌敏感株與基因轉(zhuǎn)移耐多藥株全菌蛋白質(zhì)進行組間比較，尋找到細菌耐多藥相關(guān)蛋白質(zhì)。

目前，已有許多關(guān)于凝結(jié)芽孢桿菌利用不同有機物質(zhì)生產(chǎn)L-乳酸的研究，然而均沒有從分子生物學(xué)角度分析其代謝機制。本研究首先采用不同碳源凝結(jié)芽孢桿菌BCS13002 同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，然后，利用蛋白組學(xué)技術(shù)分析3種碳源條件下（葡萄糖、玉米淀粉糊化液和玉米淀粉液）凝結(jié)芽孢桿菌BCS13002 發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸差異的原因，旨在為工業(yè)上提高L-乳酸的產(chǎn)量提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株 凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）BCS 13002，由華南理工大學(xué)食品質(zhì)量與安全實驗室從發(fā)酵蔬菜中分離得到，已于2013年4月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC），保藏編號為CGMCC No.7431。

1.1.2 材料和試劑 MnSO4·H2O、MgCl2·6H2O、NaOH，分析純級，天津市福晨化學(xué)試劑廠；耐高溫α-淀粉酶（酶活力≥70 000 U/mL）、葡萄糖淀粉酶（酶活力≥130 000 U/mL），廣州裕立寶生物科技有限公司；DTT 二硫蘇糖醇、IAM 碘乙酰胺、氨水、三乙基碳酸氫銨緩沖液、PBS，美國Sigma 公司；胰蛋白酶，北京華利世科技有限公司；十二烷基硫酸鈉SDS、丙酮，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；蛋白質(zhì)富集大/小容量試劑盒Protein Enrichment Large/Small-Capacity Kit，美國伯樂Bio-Rad 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、SDSPAGE 凝膠配制試劑盒、考馬斯亮藍染色液（常規(guī)法）、蛋白質(zhì)階梯（非預(yù)染），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乙腈、甲醇、甲酸，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.1.3 試劑溶液及培養(yǎng)基的配制

1）發(fā)酵培養(yǎng)基：無水葡萄糖46 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏25 g，MgCl2·6H2O 0.4 g，MnSO4·H2O 0.7 g，溶解于1 L 純凈蒸餾水中，pH 6.8，混合均勻，于121 ℃，0.1 MPa 條件下滅菌20 min。

2）為比較不同碳源凝結(jié)芽孢桿菌BCS 13002 發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的差異，按如下方案設(shè)置3組比較試驗。培養(yǎng)基按發(fā)酵培養(yǎng)基配制，每組分別使用不同碳源替代無水葡萄糖，具體配制如下：

第1 組：碳源為46 g/L 無水葡萄糖。

第2 組：碳源為6.25%的玉米淀粉糊化液（所產(chǎn)生葡萄糖的量與第1 組相當(dāng)，即按葡萄糖終質(zhì)量濃度46 g/L 折算，需玉米淀粉87.6 g/L）。具體操作如下：取玉米淀粉8.76 g 加入10 μL 耐高溫α-淀粉酶（酶活力≥70 000 U/mL），70 ℃攪拌水浴20 min，制成玉米淀粉水解液，加入32 μL 耐高溫葡萄糖淀粉酶（酶活力≥130 000 U/mL）。

第3 組：碳源為6.25%的玉米淀粉液（所產(chǎn)生葡萄糖的量與第1 組相當(dāng)，即按葡萄糖終質(zhì)量濃度46 g/L 折算，需玉米淀粉87.6 g/L）。

將上述3 組碳源分別與5%凝結(jié)芽孢桿菌BCS13002種子活化液一同接入裝有2 L 無糖發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L 全自動發(fā)酵罐中，于45 ℃，120 r/min 同步糖化發(fā)酵72 h，期間以8 mol/L NaOH作為中和劑調(diào)節(jié)pH 為6.5～7.0。發(fā)酵結(jié)束后，將培養(yǎng)液攪拌充分但不起泡沫，取適量樣品，于3 000 r/min，4 ℃條件下離心15 min，棄上清液，加入適量無菌PBS 溶液，用移液槍反復(fù)吹打數(shù)次混勻，于3 000 r/min，4 ℃條件下離心15 min 后得到菌泥，每個樣品重復(fù)3～5 次。取清洗干凈的菌泥，分裝入1.5 mL 離心管中，封口膜封口，澆淋液氮冷凍，保存于-40 ℃冰箱，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍離心機，德國艾本德公司；超聲波細胞破碎儀，江蘇波場智能科技股份有限公司；垂直電泳槽，上海天能科技有限公司；Biostat Aplus 5L 自動發(fā)酵罐系統(tǒng)，德國布朗公司；高效液相色譜儀，美國沃特世公司；純水儀，密理博中國有限公司；恒溫混勻儀，合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；softmax pro 酶標(biāo)儀，美國美谷分子公司；全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國賽默飛公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白質(zhì)的提取 參照Goeminne等[17]的方法提取蛋白質(zhì)：液氮研磨組織至粉末狀，稱取一定量研磨后樣品，加入芐基三苯基氯化磷（BPP）溶液，室溫渦旋振蕩10 min；加入適量Tris-飽和酚，室溫渦旋振蕩10 min 后離心；取酚相，加入BPP溶液，室溫渦旋振蕩10 min 后離心；取酚相加入適量預(yù)冷乙酸銨-甲醇溶液，-20 ℃過夜沉淀蛋白；4 ℃離心30 min，棄上清；向沉淀中加入預(yù)冷丙酮混勻后4 ℃離心20 min，棄上清；沉淀用裂解液溶解；4 ℃離心5 min，取上清液得到蛋白質(zhì)。

1.3.2 蛋白質(zhì)烷基化和酶解 參照Randall等[18]的方法進行烷基化，參照Trusek-Holownia等[19]的方法進行酶解：取蛋白質(zhì)樣品100 μg，用裂解液補充體積到100 μL；加入終濃度10 mmol/L TCEP，在37 ℃下反應(yīng)60 min；加入終濃度40 mmo/L 碘乙酰胺（Iodoacetamide），于室溫下避光反應(yīng)40 min；每管各加入預(yù)冷的丙酮（丙酮：樣品體積比=6∶1），-20 ℃沉淀2 min，10 000 r/min 離心20 min，取沉淀；用100 μL 100 mmol/L TEAB 充分溶解樣品；按照質(zhì)量比1∶25（酶∶蛋白質(zhì)）加入胰蛋白酶在37℃條件下酶解過夜。

1.3.3 對樣品進行iTRAQ 標(biāo)記 參照Randall等[18]的方法對酶解后的樣品進行iTRAQ 標(biāo)記，加標(biāo)流程如下：胰蛋白酶消化后，用真空泵抽干肽段；用0.5 mol/L TEAB 復(fù)溶肽段；取出iTRAQ 試劑恢復(fù)到室溫，離心后加入異丙醇，經(jīng)渦旋、離心后，每100 μg 多肽加入一管iTRAQ 試劑，室溫孵育2 h；加入50 μL 超純水，室溫放置30 min；將每組中等量標(biāo)記產(chǎn)物混合于一管中，真空濃縮儀抽干。每組樣品有2 個生物學(xué)重復(fù)。

1.3.4 高pH-RPLC 分離 用HPLC上樣緩沖液復(fù)溶1.3.3 節(jié)中真空濃縮的多肽樣品，采用反相C18 柱進行高pH 液相分離。分離條件如下：色譜儀器為Waters UPLC；A 相為水（氨水、甲酸調(diào)至pH 10）；B 相為100% 甲酸銨溶液（CAN）；紫外檢測波長為214 nm/280 nm；流速為400 μL/min；時間為90 min。根據(jù)峰型和時間共收取40 個餾分，合并成10 個餾分，真空離心濃縮后備用。

1.3.5 液相-質(zhì)譜分析 參照Sun等[20]的方法分析用質(zhì)譜上樣緩沖液溶解1.3.4 節(jié)中的真空濃縮樣品。質(zhì)譜條件如下：數(shù)據(jù)采集軟件為Thermo Xcalibur 4.0（Thermo，USA）；Thermo-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；色譜儀器為EASY-nLC 1200；質(zhì)譜儀器為Q-Exactive（Thermo，USA）；色譜分離時間為120 min；A 相為含有0.1%甲酸的2% ACN；B 相為含有0.1%甲酸的80% ACN；流速為300 μL/min。MS 掃描范圍（m/z）350～1300，采集模式DDA，一級質(zhì)譜分辨率70 000，碎裂方式HCD，二級分辨率17 00，動態(tài)排除時間18 s。

1.3.6 序列數(shù)據(jù)庫搜索和數(shù)據(jù)分析 經(jīng)過HPLC-MS/MS 分析，得到了所有的樣品組肽片段信息，經(jīng)R 語言匯編后登錄Uniprot 分類數(shù)據(jù)庫進行信息解讀。查詢數(shù)據(jù)庫使用的軟件為Proteome Discoverer TM Software 2.1。查詢數(shù)據(jù)時將圖像文件提交至該軟件服務(wù)器，選擇已建立的數(shù)據(jù)庫，進行數(shù)據(jù)庫搜索，具體的質(zhì)譜上樣與相關(guān)生物學(xué)信息分析，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

把各樣本鑒定得到的蛋白質(zhì)進行交叉對比，使用R 語言中的t 檢驗函數(shù)計算樣本間差異的顯著性。本研究設(shè)定的顯著差異表達蛋白質(zhì)篩選標(biāo)準(zhǔn)為：差異基因閾值＜0.67 倍或＞1.5 倍，其中P＜0.05 的差異蛋白質(zhì)定義為顯著差異，P＜0.01 的差異蛋白質(zhì)定義為極顯著差異。

1.3.7 生物信息學(xué)分析 通過GO（Gene Ontology，http：//www.geneontology.org/）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，http：//www.genome.jp/kegg/）數(shù) 據(jù)庫分析，確定可能富集具有特定生物學(xué)特性的差異表達蛋白質(zhì)。同時，通過差異蛋白質(zhì)GO 功能顯著性富集分析軟件Goatools（https：//github.com/tanghaibao/GOatools）和差異蛋白質(zhì)KEGG 顯著性富集分析軟件KOBAS（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do）對差異蛋白進行功能顯著性富集分析和蛋白質(zhì)富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源條件下凝結(jié)牙孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的差異

圖1 為凝結(jié)芽孢桿菌在3種不同碳源條件下發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的量及其光學(xué)純度。由圖1a可知，第2 組的L-乳酸含量最高，可達27.75 g/L，高于第1 組（14.23 g/L），而第3 組幾乎沒有L-乳酸的產(chǎn)生。由圖1b可知，凝結(jié)芽孢桿菌BSC13002 發(fā)酵產(chǎn)生的L-乳酸光學(xué)純度可達99.5%。

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌BSC13002 蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)總體描述

蛋白質(zhì)組學(xué)全譜分析是在蛋白質(zhì)水平上全面認識有機體生理、病理等過程，目前iTRAQ 技術(shù)已廣泛的應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域[21]。通過蛋白質(zhì)組全譜的GO 富集分析（圖2a）進行蛋白質(zhì)功能注釋，并通過KEGG 分類分析這些蛋白質(zhì)的相關(guān)代謝途徑（圖2b）。其中，GO 富集分析可分為生物過程、細胞組成和分子功能；KEGG 途徑可分為新陳代謝、遺傳信息加工、環(huán)境信息加工、細胞過程、生物體系統(tǒng)等不同的分支。由圖2a，2b可知，差異表達蛋白質(zhì)主要參與碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝、膜轉(zhuǎn)運、翻譯及脂質(zhì)代謝，差異表達蛋白質(zhì)數(shù)量分別為206，170，95，81，79，75。絕大部分差異表達蛋白質(zhì)與代謝途徑相關(guān)，部分差異表達蛋白質(zhì)與處理環(huán)境信息相關(guān)的通路、信號轉(zhuǎn)換、跨膜轉(zhuǎn)運有關(guān)，這可能是由于碳源差異導(dǎo)致了菌體中蛋白質(zhì)的適應(yīng)性表達，即不同碳源對菌體整體代謝情況造成了不同影響。

圖1 不同碳源條件下凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的量及L-乳酸純度Fig.1 The amount of L-lactic acid produced by fermentation of B.coagulans under different carbon source conditions and the purity of L-lactic acid

2.3 差異表達蛋白質(zhì)總體分析

通過分析差異表達蛋白質(zhì)可以比較不同生物體在不同時間或不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達的變化，其具有重要的實踐意義[22]。在3種不同碳源條件下凝結(jié)芽孢桿菌共鑒定出454種差異表達蛋白質(zhì)（上調(diào)蛋白質(zhì)差異倍數(shù)>1.2，下調(diào)蛋白質(zhì)差異倍數(shù)<0.8，P<0.05）。由圖3a，3b可知，第1 組Vs 第2組中有43種蛋白質(zhì)上調(diào)，21種蛋白質(zhì)下調(diào)；第1組Vs 第3 組中有170種蛋白質(zhì)上調(diào)，175種蛋白質(zhì)下調(diào)；第2 組Vs 第3 組中有141種蛋白質(zhì)上調(diào)，154種蛋白質(zhì)下調(diào)。此外，第1 組Vs 第3 組與第2 組Vs 第3 組有217種差異共表達蛋白質(zhì)，而第1 組Vs 第2 組與第2 組Vs 第1 組有22種差異共表達蛋白質(zhì)，第1 組Vs 第2 組與第1 組Vs第3 組僅有11種差異共表達蛋白質(zhì)。

圖2 凝結(jié)芽孢桿菌GO 功能分類及KEGG 代謝途徑Fig.2 GO function classification and KEGG metabolic pathway of B.coagulans

圖3 3種不同碳源條件下凝結(jié)芽孢桿菌差異表達蛋白質(zhì)的數(shù)量及差異表達蛋白質(zhì)的維恩圖Fig.3 The number of differentially expressed proteins of B.coagulans under three different carbon sources and the Venn diagram of differentially expressed proteins

2.4 差異表達蛋白質(zhì)代謝途徑分析

幾乎所有的代謝反應(yīng)都是在酶的催化作用下進行的，多種酶構(gòu)成了酶體系，以催化得到目標(biāo)產(chǎn)物[23]。通過比較3種不同碳源條件下產(chǎn)L-乳酸的KEGG 代謝途徑，發(fā)現(xiàn)差異表達蛋白質(zhì)主要導(dǎo)致糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝、碳代謝、果糖代謝、HIF-1 信號傳導(dǎo)、泛酸和輔酶A 生物合成、雙組分調(diào)節(jié)等代謝途徑不同。由2.1 節(jié)可知，第1 組、第2 組和第3 組的L-乳酸產(chǎn)量不同。由圖4a 第1 組Vs 第2 組的KEGG 代謝途徑可知，雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)、泛酸和輔酶A 生物合成、果糖代謝等途徑對L-乳酸的產(chǎn)量量具有重要的影響。因此，可以通過這些代謝途徑比較和分析第1組和第2 組凝結(jié)芽孢桿菌BCS 13002 發(fā)酵產(chǎn)物中L-乳酸差異的原因。由圖4b可知，第2 組Vs第3 組中有顯著差異的代謝途徑是糖酵解/糖原異生、三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝、碳代謝。由圖4c可知，第1 組Vs 第3 組中差異顯著的代謝途徑是糖酵解/糖原異生、三羧酸循環(huán)、碳代謝和HIF-1信號通路。由此，可以發(fā)現(xiàn)，糖酵解/糖異生和三羧酸循環(huán)在圖4b 和圖4c 的KEGG 代謝途徑中都有重要的影響作用。

2.5 第1 組Vs 第2 組產(chǎn)L-乳酸的代謝差異途徑

由2.1 節(jié)可知，第2 組的L-乳酸含量要高于第1 組。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能有以下2 個：一是參與糖酵解/糖異生和三羧酸循環(huán)的差異表達蛋白質(zhì)對L-乳酸的產(chǎn)生起顯著作用；二是其它代謝途徑影響第1 組和第2 組中丙酮酸及L-乳酸的產(chǎn)生。圖5a，圖5b，圖5c 分別為雙組分調(diào)節(jié)、泛酸和輔酶A 生物合成及果糖代謝途徑的反應(yīng)過程。由圖5a所示的雙組分調(diào)節(jié)途徑可知，下調(diào)蛋白質(zhì)為響應(yīng)調(diào)節(jié)受體蛋白（SpoOF），差異倍數(shù)為0.49，SpoOF可促進凝結(jié)芽孢桿菌BCS13002 孢子膜的形成，使得第2 組的發(fā)酵程度高于第1 組。

由圖5b所示的泛酸和輔酶A 的生物合成過程可知，上調(diào)蛋白質(zhì)為二羥酸脫水酶（EC：4.2.1.9）和泛酸-β-丙氨酸連接酶（EC：6.3.2.1），差異倍數(shù)分別為1.58，1.53。其中，二羥酸脫水酶可催化反應(yīng)：2，3-二羥基-3-間乙基丁酸鹽?H2O+3-甲基-2-氧代丁醇[24]。與第1 組相比，第2 組中的3-甲基-2-氧代丁酸酯的產(chǎn)量進一步提高，3-甲基-2-氧代丁酸酯將進一步轉(zhuǎn)化為纈氨酸。此外，泛酸-β-丙氨酸連接酶可促進第2 組中的（R）-泛酸的生成，且該酶屬于連接酶，可作為酸-D-氨基酸連接酶形成碳氮鍵[25]，最終會促進并轉(zhuǎn)化為輔酶A。纈氨酸和輔酶A 都可促進三羧酸循環(huán)中丙酮酸的產(chǎn)生，丙酮酸又可在糖酵解/糖異生途徑中轉(zhuǎn)化為L-乳酸。由圖5c所示的果糖代謝過程可知，下調(diào)蛋白質(zhì)是PTS 果糖轉(zhuǎn)運蛋白亞基（EC：2.7.1.69），差異倍數(shù)為0.42，該酶可催化化學(xué)反應(yīng)：蛋白質(zhì)Npi-磷酸-L-組氨酸+糖?蛋白組氨酸+糖磷酸[26]，該酶促進了D-果糖-1-磷酸的產(chǎn)生，與L-乳酸的形成無關(guān)，但反過來可加速D-果糖的消耗，最終導(dǎo)致第2 組中L-乳酸的含量較高。

圖5 第1 組Vs 第2 組差異表達蛋白質(zhì)主要涉及的KEGG 代謝途徑反應(yīng)過程Fig.5 The metabolic pathway of KEGG involved in the differential expression protein between group 1 and group 2

總之，這些差異表達蛋白質(zhì)的表達情況可在一定程度上說明第2 組的L-乳酸含量較第1 組高（P<0.05）的原因。就碳源的成本而言，第2 組的材料成本為（3.00±0.14）元/kg，低于第1 組（6.00±0.37）元/kg，并且第2 組的L-乳酸產(chǎn)量高于第1組，該數(shù)據(jù)具有一定的工業(yè)應(yīng)用價值。

2.6 第2 組Vs 第3 組中差異表達蛋白質(zhì)的糖酵解/糖異生和三羧酸循環(huán)代謝

圖6a，6b 為第2 組Vs 第3 組中差異表達蛋白質(zhì)的糖酵解/糖異生和三羧酸循環(huán)代謝途徑，通過KEGG 數(shù)據(jù)庫對不同碳源條件下的凝結(jié)芽孢桿菌BCS13002 代謝通路進行分析。

糖酵解/糖異生在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起重要作用，可參與碳水化合物的降解與合成[27]。由圖6a可知，與第2 組相比，第3 組的糖酵解/糖異生代謝中差異表達蛋白質(zhì)在直接或間接地催化不同底物產(chǎn)生不同靶生物中起主導(dǎo)作用。第2 組的蔗糖-異麥芽糖酶酶活性強于第3 組（P<0.05），該酶可催化第2 組中的糊精形成葡萄糖，而對第3 組中的淀粉并無催化作用。

圖6a 中影響糖酵解/糖異生途徑的主要上調(diào)蛋白質(zhì)是果糖-1，6-二磷酸酶（EC：3.1.3.11）和丙酮酸脫氫酶（EC：1.2.4.1），差異倍數(shù)分別為2.97，4.73，此外，還包括丙酮酸脫氫酶E1 組分α 亞基、脫氫酶E1 組分、特定的TPP 依賴性乙炔脫氫酶、丙酮酸脫氫酶E1 組分β 亞基，差異倍數(shù)分別為2.15，4.34，2.60，4.85，作為抑制劑的果糖-1，6-二磷酸酶可防止β-D-果糖-1，6-二磷酸轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)[28]。與第3 組相比，第2 組中的丙酮酸脫氫酶可減弱丙酮酸對2-羥基-乙基-Thpp 的抑制作用，使得第2 組中的丙酮酸含量較高[29]。主要下調(diào)蛋白質(zhì)是葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（EC：5.3.1.9）、磷酸甘油酸激酶（EC：2.7.2.3）、磷酸甘油酸變位酶（EC：5.4.2.12）、磷酸丙酮酸水合酶（EC：4.2.1.11）、丙酮酸激酶（EC：2.7.1.40）和L-乳酸脫氫酶（EC：1.1.1.27），這些酶的差異倍數(shù)分別為0.64，0.59，0.59，0.51，0.55，0.52。其中，葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶催化葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為果糖6-磷酸，即與第3 組相比，第2 組中果糖6-磷酸的產(chǎn)量更高[30]。磷酸甘油酸激酶作為糖酵解/糖異生的關(guān)鍵酶，對催化三磷酸腺苷（ATP）的形成起著至關(guān)重要的作用[31]。磷酸丙酮酸水合酶是一種多功能糖酵解酶，可催化2-磷酸-D-甘油酸脫水形成磷酸烯醇丙酮酸[32]，該酶導(dǎo)致第2 組中磷酸烯醇丙酮酸的產(chǎn)量高于第3組。丙酮酸激酶在調(diào)節(jié)細胞代謝中起重要作用，其可在糖酵解/糖異生中催化磷酸烯醇丙酮酸和ADP 轉(zhuǎn)化為丙酮酸和ATP[33]。相比于第3 組，第2組中丙酮酸可被L-乳酸脫氫酶催化產(chǎn)生更多的L-乳酸[34]。此外，甘油醛-3-磷酸脫氫酶是一種同工酶，可作為1，3-二磷酸甘油酸和甘油醛-3-磷酸相互轉(zhuǎn)化的催化物質(zhì)。綜上所述，在糖酵解/糖異生代謝途徑中，可充分說明第2 組的L-乳酸含量高于第3 組。

三羧酸循環(huán)是微生物生命活動中物質(zhì)和能量代謝的主要途徑，其主要有2 個功能：能量的產(chǎn)生和前體的合成[35]。由圖6b可知，與第2 組相比，第3 組三羧酸循環(huán)中的差異表達蛋白質(zhì)均發(fā)生下調(diào)，主要包括檸檬酸（Si）-合酶（EC：2.3.3.1）、蘋果酸脫氫酶（EC：1.1.1.37）、蘋果酸脫氫酶（EC：1.1.5.4）、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（ATP）（EC：4.1.1.49）及丙酮酸脫氫酶（EC：1.2.4.1），差異倍數(shù)分別為2.72，2.51，2.61，2.05，4.73。其中，檸檬酸（Si）-合成酶在細胞代謝中起重要作用并可催化三羧酸循環(huán)：乙酰-CoA+H2O+草酰乙酸→檸檬酸鹽+CoA-SH[36]，在第2 組中的檸檬酸含量高于第3組。蘋果酸脫氫酶通過將NAD+還原為NADH，可逆地催化蘋果酸氧化成草酰乙酸[37]，該反應(yīng)使得第2 組草酰乙酸的含量較第3 組高。蘋果酸脫氫酶可催化化學(xué)反應(yīng)：（S）-蘋果酸+醌?草酰乙酸+還原醌[38]，該反應(yīng)也導(dǎo)致第2 組草酰乙酸含量的增加。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶可催化化學(xué)反應(yīng)：ATP+草酰乙酸?ADP+磷酸烯醇丙酮酸+CO2[39]。由上可知，在丙酮酸合成中由于檸檬酸（Si）-合成酶、蘋果酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶的共同催化作用，使得第2 組中的草酰乙酸的含量遠大于第3組。然而，在草酰乙酸轉(zhuǎn)換為磷酸烯醇丙酮酸的過程中，第3 組磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的豐度是第2 組的2.36 倍，簡而言之，第2 組中磷酸烯醇丙酮酸的形成率較低，但草酰乙酸含量的影響大于磷酸烯醇丙酮酸羧激酶催化生成磷酸烯醇丙酮酸的的影響。從三羧酸循環(huán)中生成磷酸烯醇丙酮酸只是作為磷酸烯醇丙酮酸的一個途徑，并不起主導(dǎo)作用?？傊?，在丙酮酸的合成過程中，第2 組磷酸烯醇丙酮酸的總含量高于第3 組。同時，丙酮酸脫氫酶可抑制丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。因此，在三羧酸循環(huán)中，第2 組中丙酮酸的含量較第3 組多。

綜上可知，在糖酵解/糖異生和三羧酸循環(huán)代謝中，第2 組丙酮酸的含量、L-乳酸脫氫酶的酶活性均高于第3 組，第2 組中糊精可經(jīng)酶的催化形成乳酸，而第3 組中的淀粉并不能形成乳酸。因此，第2 組L-乳酸的含量較第3 組高。

圖6 第2 組Vs 第3 組差異表達蛋白質(zhì)的糖酵解/糖異生和三羧酸循環(huán)代謝Fig.6 Glycolysis/gluconeogenesis and TCA cycle metabolism of differential expressionproteins in group 2 Vs group 3

2.7 第1 組Vs 第3 組中差異表達蛋白質(zhì)的糖酵解/糖異生和三羧酸循環(huán)代謝途徑

由2.1 節(jié)可知，與第3 組相比，第1 組的L-乳酸含量較高。從蛋白質(zhì)組譜圖（圖3）可知凝結(jié)芽孢桿菌BCS13002 在第1 組和第3 組代謝途徑中存在許多對生產(chǎn)L-乳酸產(chǎn)量起至關(guān)作用的差異表達蛋白質(zhì)。其中，糖酵解/糖異生和三羧酸循環(huán)代謝中差異表達蛋白質(zhì)的數(shù)量最多。

圖7 第1 組Vs 第3 組差異蛋白的糖酵解/糖異生和三羧酸循環(huán)代謝Fig.7 Glycolysis/gluconeogenesis and TCA cycle metabolism of differential expression proteins in group 1 Vs group 3

由圖7a可知，糖酵解/糖異生途徑中存在大量上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)。與第1 組相比，第3 組中上調(diào)的蛋白質(zhì)包括果糖-1，6-二磷酸酶（EC：3.1.3.11）、丙酮酸脫氫酶（EC：1.2.4.1），差異倍數(shù)分別為3.34，5.46。丙酮酸脫氫酶含有丙酮酸脫氫酶E1 組分α 亞基、脫氫酶E1 組分，特定的TPP 依賴性乙炔脫氫酶、丙酮酸脫氫酶E1 組分β 亞基，差異倍數(shù)分別為2.38，4.82，5.45，2.65。與第1 組相比，第3 組中下調(diào)的蛋白質(zhì)為葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（EC：5.3.1.9）、磷酸甘油酸激酶（EC：2.7.2.3）、磷酸甘油酸變位酶（2，3-二磷酸化酶）（EC：5.4.2.12）、磷酸丙酮酸水合酶（EC：4.2.1.11）、丙酮酸激酶（EC：2.7.1.40）、L-乳酸脫氫酶（EC：1.1.1.27），差異倍數(shù)分別為0.55，0.52，0.36，0.45，0.52，0.42。此外，同工蛋白酶是磷酸丙糖異構(gòu)酶（EC：5.3.1.1）與甘油醛-3-磷酸脫氫酶（EC：1.2.1.12），2種酶的上調(diào)和下調(diào)的倍數(shù)分別為1.68 和0.40，2.99 和0.51。

圖7b所示為三羧酸循環(huán)，其主要上調(diào)蛋白質(zhì)是檸檬酸鹽（Si）-合成酶（EC：2.3.3.1）、蘋果酸脫氫酶（EC：1.1.1.37）、蘋果酸脫氫酶（EC：1.1.5.4）、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（ATP）（EC：4.1.1.49）、丙酮酸脫氫酶（EC：1.2.4.1），差異倍數(shù)分別為3.09，2.93，2.85，2.36，5.46。

由上可知，第1 組和第3 組之間的糖酵解/糖原異生和三羧酸循環(huán)代謝的差異與第2 組和第3組之間的糖酵解/糖異生和三羧酸循環(huán)代謝的差異相似。因此，可知糖酵解/糖異生和三羧酸循環(huán)代謝對L-乳酸的產(chǎn)生具有顯著影響。

3 結(jié)論

通過研究3種碳源凝結(jié)芽孢桿菌BCS13002同步糖化發(fā)酵對L-乳酸產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)可以用玉米淀粉糊化液代替葡萄糖同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，其具有成本低，產(chǎn)量高的優(yōu)點。此外，通過蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)L-乳酸產(chǎn)量差異的生物學(xué)機制是凝結(jié)芽孢桿菌BCS13002 在3種碳源下蛋白質(zhì)表達水平不同，并且其中的部分差異表達蛋白質(zhì)所屬的代謝途徑與L-乳酸含量差異相關(guān)，這些途徑主要為糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)、HIF-1 信號通路、丙酮酸代謝、碳代謝、泛酸和輔酶A 生物合成、果糖代謝、雙組分調(diào)節(jié)，其中最重要作用的代謝途徑為糖酵解/糖異生和三羧酸循環(huán)。本研究對工業(yè)上使用玉米淀粉糊化液代替葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸提供了一定的理論基礎(chǔ)，具有重要的工業(yè)實用價值。