淫羊藿甙促進(jìn)活性氧表達(dá)誘導(dǎo)甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞凋亡的研究

鄭傳銘，葛明華，王佳峰，劉小珍.浙江省腫瘤醫(yī)院頭頸外科，浙江　杭州　300；.浙江省腫瘤醫(yī)院生物標(biāo)本庫(kù)，浙江　杭州　300

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淫羊藿甙促進(jìn)活性氧表達(dá)誘導(dǎo)甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞凋亡的研究

鄭傳銘1，葛明華1，王佳峰1，劉小珍2
1.浙江省腫瘤醫(yī)院頭頸外科，浙江杭州310022；2.浙江省腫瘤醫(yī)院生物標(biāo)本庫(kù)，浙江杭州310022

［摘要］背景與目的：淫羊藿甙（icariin，ICA），是從檗科淫羊藿屬植物中提取的重要黃酮類(lèi)活性化合物。研究表明，ICA對(duì)肺癌和胃癌等腫瘤有很好的抑制作用，有望開(kāi)發(fā)為療效較好的抗腫瘤藥，但其作為有前景抗腫瘤藥物在甲狀腺癌中的研究較少，其作用機(jī)制罕見(jiàn)報(bào)道。該研究擬探究不同濃度ICA對(duì)甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞系增殖凋亡、細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）及抗氧化酶系統(tǒng)的影響，探究ICA對(duì)甲狀腺癌活性影響機(jī)制是否具有濃度-時(shí)間依賴(lài)性。方法：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測(cè)不同濃度ICA對(duì)B-CPAP細(xì)胞系增殖的影響，采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)ICA對(duì)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)ROS的影響，采用超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒檢測(cè)ICA對(duì)細(xì)胞內(nèi)SOD表達(dá)影響，采用丙二醛（malondialdehyd，MDA）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ICA對(duì)細(xì)胞內(nèi)MDA表達(dá)的影響，采用蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測(cè)Bcl-2及γ-HA2X蛋白的表達(dá)。結(jié)果：ICA處理48h后B-CPAP細(xì)胞活性降低，細(xì)胞凋亡率上升，呈劑量-時(shí)效依賴(lài)性（P＜0.01）。ICA50和200mg/L處理組ROS生成量依次是對(duì)照組（Control組）的（2.12±0.14）倍和（2.41±0.12）倍。ICA促進(jìn)細(xì)胞膜脂質(zhì)化產(chǎn)物MDA的累積，降低抗氧化酶SOD活性，活性比Control組下降（9.35±1.45）%和（21.5±1.52）%。ICA200mg/L處理組抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低（13.64±1.71）%。結(jié)論：ICA具有良好的抑制甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞活性的作用，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，其主要作用途徑可能是促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS高表達(dá)，抑制SOD表達(dá)，抗凋亡蛋白Bcl-2低表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞不可逆損傷，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

［關(guān)鍵詞］淫羊藿甙；甲狀腺癌；活性氧；超氧化物歧化酶

《2012中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》數(shù)據(jù)顯示，甲狀腺癌已進(jìn)入高發(fā)范圍，在全國(guó)范圍內(nèi)的惡性腫瘤排名中，甲狀腺癌發(fā)病率已上升至第10位，在城市及沿海地區(qū)甲狀腺癌發(fā)病率已上升至第4位。淫羊藿甙（icariin，ICA）是一種極具應(yīng)用前景的抗癌中藥，對(duì)肺癌、胃癌、肝癌以及血液系統(tǒng)腫瘤等有很好的抑制作用［1-3］，但I(xiàn)CA在抗甲狀腺癌中的研究較少，其作用機(jī)制探究不深。本研究擬觀(guān)察不同濃度ICA對(duì)甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞系增殖凋亡、細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen soecies，ROS）及抗氧化酶系統(tǒng)的影響，探究ICA對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞活性的影響機(jī)制。

1　材料和方法

1.1細(xì)胞及培養(yǎng)

人甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞系獲贈(zèng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2主要試劑

ICA（大于98%）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，WST法總超氧化物歧化酶試劑盒、脂質(zhì)氧化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒皆購(gòu)自南京碧云天生物技術(shù)有限公司，β-actin、Bcl-2和γ-H2AX等抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司，DCFH-DA購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.3CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)

以每孔1×103個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板中，每孔100μL，溫育過(guò)夜后依次加入ICA 12.5（ICA12.5組）、25（ICA25組）、50（ICA50組）、100（ICA100組）和200 mg/L（ICA200組），未經(jīng)ICA處理的細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組（Control組），培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔換終濃度10%的CCK-8培養(yǎng)基溫育2 h，然后在酶標(biāo)儀450 nm處讀取吸光度（D）值。

1.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)

收集ICA 50和200mg/L處理48h的B-CPAP細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞1×106個(gè)，置于離心管中，1000×g離心3min，去除上清液，按照Invitrogen凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，每管加入100μL緩沖液，依次加入5μL Annexin V-FITC，1μL PI，室溫溫育15min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化，收集1×104個(gè)細(xì)胞。

1.5細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)

采用胰蛋白酶消化ICA50和200mg/L處理48h的B-CPAP細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞。每管采用10μmol/LDCFH-DA工作液，37℃避光溫育15min后采用BD雙波長(zhǎng)激光流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度來(lái)分析細(xì)胞內(nèi)ROS水平。每個(gè)樣品收集1×104個(gè)細(xì)胞。

1.6細(xì)胞內(nèi)丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)

采用脂質(zhì)氧化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同處理組細(xì)胞內(nèi)MDA（操作方法參照試劑說(shuō)明書(shū)），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算待測(cè)樣品內(nèi)MDA含量，其中采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒對(duì)所有樣品的總蛋白進(jìn)行定量，無(wú)任何處理為對(duì)照組細(xì)胞。

1.7超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)

從數(shù)據(jù)來(lái)看，M0/(M1-M0)、M0/M1的比率繼續(xù)下降，到2011年開(kāi)始有所回升。M1/(M2-M1)、M0/(M2-M1)的比率總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這個(gè)結(jié)論與我們當(dāng)前的實(shí)際情況也是不相吻合的。

ICA50和200mg/L分別處理B-CPAP細(xì)胞48h后，采用細(xì)胞刮棒輕緩刮脫細(xì)胞，每孔加入150μL含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，轉(zhuǎn)至于預(yù)冷EP管中；充分混勻強(qiáng)力渦旋振蕩15s，16000×g離心5min；吸取上清液置于EP管待測(cè)檢測(cè)。細(xì)胞內(nèi)SOD表達(dá)量采用WST法總SOD試劑盒進(jìn)行檢測(cè)（操作方法參照試劑說(shuō)明書(shū)），其中采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒對(duì)所有樣品的總蛋白進(jìn)行定量。計(jì)算公式：樣品中SOD酶活力單位=檢測(cè)體系中SOD酶活力單位=抑制百分率/（1-抑制百分率）units，抑制百分率=（A空白對(duì)照1-A樣品）/ （A空白對(duì)照1-A空白對(duì)照2）×100%，無(wú)任何處理為對(duì)照組。

1.8蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測(cè)

同上1.6操作收集獲取細(xì)胞總蛋白液，加入適量SDS上樣緩沖液于100℃金屬浴解交聯(lián)。蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜并用脫脂奶粉封閉非特異性結(jié)合，然后依次溫育一抗及二抗后，用化學(xué)發(fā)光法顯影，檢測(cè)50和200mg/L ICA處理的B-CPAP細(xì)胞中Bcl-2及γ-H2AX相關(guān)蛋白水平的變化，無(wú)任何處理為對(duì)照組。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)　果

2.1ICA抑制甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞增殖

通過(guò)不同ICA濃度的動(dòng)態(tài)觀(guān)察，與對(duì)照組比較，ICA在24h時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯的抑制作用，48h處理抑制效果明顯，表明ICA抑制細(xì)胞活性具有時(shí)間依賴(lài)性。同對(duì)照組比，ICA12.5組、ICA25組、ICA50組、ICA100組和ICA200組48h后，細(xì)胞活性依次下降（8.84±1.21）%、（17.80±2.19）%、（19.50±0.54）%、（24.02±4.30）%和（43.0±1.58）%；ICA不同濃度處理組對(duì)細(xì)胞活性的影響呈劑量依賴(lài)性，200mg/L細(xì)胞活性抑制作用最強(qiáng)。ICA處理72h對(duì)細(xì)胞活性抑制趨勢(shì)同48h相似，與Control組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

圖1　ICA抑制B-CPAP細(xì)胞增殖Fig.1　ICA inhibited the proliferation of B-CPAP cells

與對(duì)照組比，ICA處理B-CPAP細(xì)胞48h后，細(xì)胞凋亡數(shù)明顯提高，細(xì)胞生存率下降（P＜0.01），ICA50組和ICA200組細(xì)胞凋亡率分別提高（10.00±1.70）%和（20.06±2.72）%，ICA濃度越高細(xì)胞凋亡率上升，呈劑量依賴(lài)性（圖2）。

2.3ICA提高B-CPAP細(xì)胞內(nèi)ROS生成

用ICA50和200mg/L處理48h后，B-CPAP細(xì)胞內(nèi)ROS明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），ICA50組和ICA200組細(xì)胞內(nèi)ROS生成量分別是CTRL組（2.12±0.14）倍和（2.41±0.12）倍。同時(shí)，ICA提高細(xì)胞內(nèi)ROS生成呈劑量依賴(lài)性，ICA200組ROS生成比ICA50組提高（13.9±5.45）%（圖3）。

2.4ICA提高B-CPAP細(xì)胞內(nèi)MDA累積

收集ICA50和200mg/L處理B-CPAP細(xì)胞48h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ICA200組促使細(xì)胞內(nèi)膜脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA累積，提高（44.67±19.58）%（圖4）。

2.5ICA對(duì)B-CPAP細(xì)胞內(nèi)SOD生成影響

ICA50和200mg/L處理B-CPAP細(xì)胞48h后，明顯降低細(xì)胞內(nèi)SOD生成，分別下降（9.35±1.45）%和（21.5±1.52）%。ICA組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），ICA200組SOD生成量比ICA50組降低（13.5±1.7）%，呈劑量依賴(lài)性（圖5）。

圖2　ICA促進(jìn)B-CPAP細(xì)胞凋亡Fig.2　ICA promoted the apoptosis of B-CPAP cells

圖3　ICA促使B-CPAP細(xì)胞內(nèi)ROS生成Fig.3　ICA improved the intracellular ROS of B-CPAP cells

圖4　ICA促使B-CPAP細(xì)胞內(nèi)MDA累積Fig.4　ICA improved the accumulation of MDA in B-CPAP cells

圖5　ICA降低B-CPAP細(xì)胞內(nèi)SOD生成Fig.5　ICA reduced the intracellular SOD of B-CPAP cells

2.6ICA對(duì)Bcl-2及γ-H2AX蛋白水平的影響

ICA處理48h后，采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抑制凋亡蛋白Bcl-2及DNA雙鏈損傷修復(fù)蛋白γ-H2AX表達(dá)。與對(duì)照組相比，ICA200組Bcl-2表達(dá)降低（13.64±1.71）%（圖6A），與流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果相對(duì)應(yīng)。ICA處理能明顯降低γ-H2AX表達(dá)，對(duì)照組γ-H2AX依次是ICA50組、ICA200組的1.71倍和1.70倍（圖6B）。

圖6　ICA降低B-CPAP細(xì)胞內(nèi)Bcl-2（A）、γ-H2AX（B）表達(dá)Fig.6　ICA reduced the expression of Bcl-2（A） and γ-H2AX（B） in B-CPAP cells

3　討　論

ICA是淫羊藿植物中主要黃酮類(lèi)藥用成分，被喻為最有潛力的抗癌中藥之一，對(duì)肺癌、胃癌、肝癌及血液系統(tǒng)腫瘤等有很好的抑制作用，而ICA對(duì)甲狀腺癌的影響研究較少。近年來(lái)隨著對(duì)ROS生物學(xué)功能研究的深入，ROS殺傷腫瘤細(xì)胞的作用也逐漸被認(rèn)識(shí)，并形成了新興的自由基生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。作為有前景抗癌藥物ICA對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS和抗氧酶（SOD、H2O2酶等）影響相關(guān)研究鮮見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，ICA明顯降低高甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞活性，提高細(xì)胞凋亡率并呈濃度-時(shí)間依賴(lài)性，同時(shí)ICA處理組B-CPAP細(xì)胞內(nèi)ROS呈濃度依賴(lài)性增加，則顯示ICA處理細(xì)胞凋亡率與細(xì)胞內(nèi)ROS量呈正相關(guān)。ROS是指由分子氧直接或間接轉(zhuǎn)化而來(lái)、具有比分子氧更活潑的化學(xué)反應(yīng)性的一類(lèi)含氧物，ROS作用方式與其濃度相關(guān)，微摩爾水平的ROS可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，毫摩爾水平的ROS引起細(xì)胞的損傷死亡［4-5］，細(xì)胞凋亡的3條途徑：線(xiàn)粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路均與ROS密切相關(guān)。Li等［6］研究表明，ISA可通過(guò)依賴(lài)線(xiàn)粒體的ROS/c-Jun氨基末端激酶（ROS/JNK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721。馬振秋等［7］研究發(fā)現(xiàn)，二氫青蒿素（DHA）能濃度和時(shí)間依賴(lài)性抑制大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，DHA作用2h后，C6細(xì)胞內(nèi)ROS增多，這種效應(yīng)與DHA的濃度呈正相關(guān)。膜脂過(guò)氧化重要產(chǎn)物MDA，能加劇膜的損傷。本研究顯示，ICA處理組MDA生成量增加，這與ROS介導(dǎo)的膜損傷有關(guān)。細(xì)胞膜、線(xiàn)粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜易遭到ROS攻擊，致使膜的結(jié)構(gòu)和功能受損。線(xiàn)粒體膜受到ROS攻擊后發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化、MDA生成量增加，膜的通透性改變，導(dǎo)致Ca2+外流和細(xì)胞色素C釋放，激活caspase-3從而引起細(xì)胞凋亡［8］，本研究與此相符。SOD是普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)的重要抗氧化酶，主要功能是消除體內(nèi)自由基。本研究顯示，ICA處理組SOD表達(dá)量顯著減少，對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS清除率下降，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與凋亡數(shù)據(jù)相符。同理，本研究顯示，高濃度ICA處理組Bcl-2蛋白表達(dá)量下降，ROS高表達(dá)，細(xì)胞氧化損傷嚴(yán)重，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)途徑。ROS介導(dǎo)的DNA氧化損傷，若對(duì)DNA的氧化損傷嚴(yán)重以致無(wú)法修復(fù)，則可直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

γ-H2AX是組蛋白H2A家族中的一員H2AX的磷酸化形式（亞型），參與DNA損傷早期反應(yīng)，為評(píng)估DNA損傷、修復(fù)的指標(biāo)。而本研究ICA各處理組γ-H2AX表達(dá)量降低，這可能是細(xì)胞同時(shí)在進(jìn)行的DNA的修復(fù)作用超過(guò)了損傷作用，γ-H2AX的去磷酸化水平超過(guò)了磷酸化水平，這與鄒鵬等［9］的研究結(jié)果相一致。

綜上所述，ICA可以降低甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞活性，提高凋亡率，且降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性，提高脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA升高，這與細(xì)胞內(nèi)ROS提高引起的氧化損傷有關(guān)。更多與ICA促進(jìn)生成的ROS與細(xì)胞凋亡相關(guān)的調(diào)控分子機(jī)制有待進(jìn)一步探究，這為將ICA應(yīng)用與甲狀腺癌臨床治療提供新思路，利于推進(jìn)中藥抗腫瘤的進(jìn)程。

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DOI：10.3969/j.issn.1007-3969.2016.05.006

中圖分類(lèi)號(hào)：R736.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-3639（2016）05-0388-06

收稿日期：（2015-08-09修回日期：2016-02-10）

基金項(xiàng)目：2014年浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2014ZB025）。通信作者：葛明華E-mail：gemingh@163.com

Icarrin induces apoptosis of the thyroid carcinoma cell line B-CPAP via promotion of reactive oxygenspecies

ZHENG Chuanming1， GE Minghua1， WANG Jiafeng1， LIU Xiaozhen2
（1. Department of Head and Neck Surgery， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou 310022， Zhejiang Province， China； 2. The Biospecimen Repository of Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou 310022， Zhejiang Province， China）Correspondence to： GE Minghua E-mail： gemingh@163.com

［Abstract］Background and purpose： Icariin （ICA） is the important active flavonoids extracted from Berberidaceae epimedium. It has been shown to be effective in suppressing cancers including lung cancer and gastric cancer. Thus， it is expected to be developed for cancer treatment. However， there were few studies on icariin as a promising anticancer drug for the treatment of thyroid cancer. The mechanisms underlying anticancer effects of ICA in thyroid cancer are rarely reported. This study was to explore the proliferation and apoptosis， intracellular ROS and antioxidant enzyme systems of the thyroid carcinoma cell line B-CPAP treated with different concentrations of ICA. It aimed to explore the mechanism underlying anticancer effects of ICA， and to determine whether it is concentrationor time-dependent manner. Methods： The proliferation of B-CPAP cell line treated with different concentrations of ICA was detected by cell counting kit-8 （CCK-8）. The cell apoptosis and intracellular ROS were observed by flow cytometry. The expression of intracellular superoxide dismutase and intracellular malondialdehyde were measured by SOD detection kit and MDA assay kit， respectively. Bcl-2 and γ-HA2X were detected by Western blot. Results： ICAreduced B-CPAP cell activity， increased the rate of apoptosis in a dose- and time-dependent manner after 48 h （P＜0.01）. The ROS of ICA 50 mg/L and 200 mg/L groups were （2.12±0.14）-fold and （2.41±0.12）-fold of the control group，respectively. ICA promoted accumulation of malondialdehyde， and reduced antioxidant enzyme SOD activity. The SOD activity was decreased by （9.35±1.45）% （ICA 50 mg/L group） and （21.5±1.52）% （ICA 200 mg/L group） compared with the control group， respectively. The anti-apoptotic protein Bcl-2 in ICA 200 mg/L group was decreased by （13.64±1.71）% compared with the control group. Conclusion： Icariin inhibited activity of thyroid cancer B-CPAP cells in a dose- and time-dependent manner. It plays an important role in promoting intracellular ROS expression， inhibiting superoxide dismutase expression and decreasing Bcl-2， which leads to irreversible damage to the cell， thereby inducing apoptosis.

［Key words］Icariin； Thyroid carcinoma； Reactive oxygen species； Superoxide dismutase