依西美坦聯(lián)合同期或序貫放射對MCF-7細胞放射敏感性的影響

陳　剛，金冶寧，張順康，王　鑫.上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院放療科，上?！?000；.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院放療科，上海　0005

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依西美坦聯(lián)合同期或序貫放射對MCF-7細胞放射敏感性的影響

陳剛1，金冶寧2，張順康1，王鑫1
1.上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院放療科，上海200002；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院放療科，上海200025

［摘要］背景與目的：放療和內分泌治療是乳腺癌術后輔助治療的重要組成部分，但關于二者相互作用的研究較少。輔助放療和內分泌治療的最佳時序至今尚無定論，而兩者的時序安排對臨床卻非常重要。本研究通過探討依西美坦同期或序貫放射對人乳腺癌MCF-7細胞株放射敏感性的影響及其可能的機制，為臨床制定最佳的治療模式提供理論依據(jù)。方法：將人乳腺癌MCF-7細胞株分成單純放射組、放射前加依西美坦組和放射后加依西美坦組，采用克隆形成試驗法檢測各組的放射敏感性，用MTT法檢測各組的細胞增殖率，用DAPI染色法檢測各組的細胞凋亡率，用蛋白［質］印跡法（Western blot）檢測各組Bcl-2和Bax蛋白的表達情況。結果：放射前加依西美坦組和放射后加依西美坦組的放射增敏比（sensitive enhancement ratio，SER）分別為1.51和1.37；與單純放射組相比，依西美坦聯(lián)合放射組腫瘤細胞抑制率和細胞凋亡率均明顯升高；依西美坦聯(lián)合放射組能明顯使Bax蛋白升高，Bcl-2蛋白降低，但放射與依西美坦的使用順序差異無統(tǒng)計學意義。結論：依西美坦對MCF-7細胞具有放射增敏作用，可能與促進細胞凋亡有關，放射與依西美坦的使用順序對效果無影響。

［關鍵詞］依西美坦；MCF-7細胞；放射敏感性

乳腺癌的綜合治療包括手術、放療、化療、內分泌治療和靶向治療等，作為術后輔助治療的重要手段，放療屬于局部治療，而化療與內分泌治療同屬全身治療范疇。目前認為，輔助化療與放療、內分泌治療聯(lián)合時應先化療再序貫放療和內分泌治療［1-3］。但輔助放療和內分泌治療的時序性研究至今尚無定論。依西美坦作為第三代芳香化酶抑制劑（aromatase inhibitors，AI），能提高絕經后受體陽性高復發(fā)風險的患者的無病生存率，不良反應低，成為這部分患者的一線治療用藥［4-5］。本研究通過觀察依西美坦聯(lián)合同期或序貫放射對人乳腺癌MCF-7細胞放射敏感性的影響，為臨床制定最佳的治療模式提供一定的理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料和試劑

人乳腺癌MCF-7細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；染色劑噻唑藍（MTT）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；依西美坦購自美國Selleckchem公司，溶解在二甲基亞砜中，半抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）為30μmol/L；抗Bcl-2（ab117115）、抗Bax（ab7997）和抗β-actin（ab6276）抗體購自英國Abcam公司。

1.2細胞培養(yǎng)

人乳腺癌MCF-7細胞用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3實驗分組

將MCF-7細胞分為單純放射組、依西美坦組、放射前加依西美坦組和放射后加依西美坦組。放射前加依西美坦組在放射前1天加入20μmol/L依西美坦，放射后加依西美坦組在放射后24h加入20μmol/L依西美坦。

1.4照射方法

采用美國Varian公司Clinac ix直線加速器。照射條件：6MV X線，劑量率為300cGy/min，源皮距100cm，照射野大小為20cm×20cm，加1cm等效補償膜。

1.5克隆形成實驗

取指數(shù)生長期細胞，用0.25%的胰酶消化后制成單細胞懸液，按照射劑量0、2、4、6和8Gy分別在96孔中接種200、200、400、600和800個細胞，每個劑量點設3個平行樣本，按上述方法分為放射組、放射前加依西美坦組和放射后加依西美坦組，照射后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)14d，待出現(xiàn)集落時終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，用calceinAM染色10min，計數(shù)細胞大于50個以上的集落數(shù)，計算存活分數(shù)繪制劑量效應曲線?？寺÷剩╬lating efficiency，PE）=對照組每孔克隆數(shù)/每孔種植細胞數(shù)×100%，并以PE作為校正系數(shù)計算存活分數(shù)（surviving fraction，SF）。SF=實驗組每組克隆數(shù)/（每孔細胞種植數(shù)×克隆率）。數(shù)據(jù)分析使用GraphPade Prism5.0軟件，以單靶多擊擬合細胞存活曲線，并計算平均致死劑量（mean lethal dose，Do）、準閾劑量（quasithreshold，Dq），SF2值和放射增敏比（sensitive enhancement ratio，SER）。

1.6MTT法檢測細胞增殖情況

采用MTT法檢測依西美坦對MCF-7細胞增殖情況。將指數(shù)生長期的細胞，以每孔5×103個細胞接種于96孔板，按上述實驗分組方法分為放射組、放射前加依西美坦組和放射后加依西美坦組，同時加細胞組不作處理作為對照組以及空白組。照射方法為單次照射4Gy，培養(yǎng)6d后進行檢測。每組設立4個復孔，每孔加入20μL MTT（以磷酸緩沖鹽溶液PBS配成5mg/mL），37℃溫育4h后，每孔加二甲基亞砜100μL，在酶聯(lián)免疫檢測儀上以490nm波長測定各孔吸光度（D）值，計算細胞生長抑制率。抑制率=（1-D實驗組）/ D對照組×100%。

1.7DAPI染色法檢測細胞凋亡情況

將指數(shù)生長期的MCF-7細胞，以每孔5×103個細胞接種于96孔板，細胞按上述方法分4個處理，設立空白對照。照射方法為單次照射4Gy，藥物濃度為20μmol/L。培養(yǎng)10d后進行細胞檢測，檢測時PBS洗3遍，加DAPI熒光染色劑（質量濃度為10μg/mL）反應30min，用熒光顯微鏡觀察細胞核凋亡情況，并計數(shù)統(tǒng)計。

1.8蛋白［質］印跡法（Western blot）檢測Bcl-2 和Bax蛋白表達情況

將指數(shù)生長期的MCF-7細胞以每孔6×106個細胞接種于10mm培養(yǎng)皿，按上述實驗分組分為依西美坦組、放射組、放射前加依西美坦組和放射后加依西美坦組，照射方法為單次照射4Gy，藥物濃度為20μmol/L。培養(yǎng)10d后刮取細胞用于檢測。首先用BAC對蛋白進行定量。用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，凝膠上的蛋白帶轉移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，以5%脫脂奶粉室溫封閉1h，然后加入一抗（抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗β-actin1︰5000）4℃溫育過夜，增強化學發(fā)光法顯色。用FluorChem軟件（美國CB公司）掃描分析。

1.9統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5.0軟件分析，數(shù)據(jù)用±s 表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1依西美坦增強放射敏感性

根據(jù)各組克隆數(shù)得出克隆形成率和存活分數(shù)，運用單擊多靶模型進行曲線擬合（圖1），并得出放射學參數(shù)（表1）。結果表明，依西美坦具有放射增敏作用，放射前或放射后加入的放射增敏比分別為1.51和1.37，放射前加入放射敏感性更強。

2.2依西美坦聯(lián)合放射明顯抑制細胞增殖

MTT結果顯示，單純依西美坦雖然可以抑制MCF-7細胞增殖，跟對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（t=1.809，P=0.1447），而單純放療能明顯抑制細胞增殖（t=3.127，P=0.0353），兩者聯(lián)合能明顯加強細胞生長抑制的程度（t=6.875， P=0.0023；t=7.486，P=0.0017），但同期組和序貫組對細胞的抑制率差異無統(tǒng)計學意義（t=2.019，P=0.1136，圖2）。

圖1　MCF-7細胞經不同處理后的細胞存活曲線Fig.1　Survival curves of MCF-7 cells after different treatment modalities

表1　MCF-7細胞經不同處理后的放射生物學參數(shù)Tab.1　Radio-biological parameters of MCF-7 cells after different treatment modalities

圖2　MCF-7細胞經不同處理后的細胞生長抑制率曲線Fig.2　Growth-inhibition rate curves of MCF-7 cells after different treatment modalities

2.3依西美坦聯(lián)合放射促進細胞凋亡

用DAPI染色法觀察并計算細胞核凋亡情況。結果顯示，與對照組相比，單純依西美坦對細胞凋亡影響不顯著（t=2.00，P=0.1161），而單純放射能促進細胞凋亡（t=9.400，P=0.0007），依西美坦聯(lián)合放射能進一步促進細胞凋亡（t=19.00，P＜0.0001），但同期組和序貫組間差異無統(tǒng)計學意義（t=0.6325，P=0.5614，圖3、4）。

圖3　DAPI染色法熒光顯微鏡下觀察各組細胞核凋亡Fig.3　Fluorescence and electron microscopic observation of nucleus apoptosis in each group of cells with DAPI stain method

圖4　MCF-7細胞經不同處理后細胞凋亡情況Fig.4　Apoptosis of MCF-7 cells after different treatment modalities

2.4依西美坦聯(lián)合放療促進Bcl-2降低和Bax升高

Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，Bcl-2抗凋亡指數(shù)各組都有降低（t值分別為15.02、12.94、14.60和17.56，P值分別為0.0001、0.0002、0.0001和0.0001），但同期組和序貫組間差異無統(tǒng)計學意義（t=1.436，P=0.2244）；處理組對Bax的表達均有影響（與對照組比較，t值分別為4.276、3.865、7.171和8.357，P值分別為0.0129、0.0181、0.0020和0.0011），均能使Bax升高，但同期組和序貫組間差異無統(tǒng)計學意義（t=1.290，P=0.2666，圖5）。

圖5　MCF-7細胞經不同處理后Bcl-2、Bax表達情況Fig.5　Expressions of Bcl-2 and Bax in MCF-7 cells after different treatment modalities

3　討　論

乳腺癌內分泌治療目前應用于臨床安全有效的藥物以三苯氧胺（tamoxifen，TAM）和第三代AI為代表［6］。

以阿那曲唑、來曲唑和依西美坦為代表的第三代AI的出現(xiàn)是乳腺癌內分泌治療史上的一個轉機，目前有多個大型臨床試驗均顯示其具有比TAM更好的療效［7-8］。ATAC試驗的10年隨訪結果顯示，阿那曲唑組的無病生存期、無病生存率、復發(fā)時間及復發(fā)率均優(yōu)于TAM組，且對側乳腺癌的發(fā)生率顯著降低；但是兩組的總生存率差異無統(tǒng)計學意義［9］。BIGl-98試驗中位隨訪時間為74個月，其研究結果顯示，來曲唑組較TAM組能顯著改善患者的無病生存期，顯著降低絕經后激素受體陽性乳腺癌患者的死亡和遠處復發(fā)風險［10］。IES試驗中位隨訪時間為91個月，該研究結果顯示，與5年TAM組比較，TAM治療2～3年后改為依西美坦治療2～3年組的無病生存期及總生存期有顯著提高［11］。因此，在乳腺癌內分泌治療上，無論起始治療、序貫或轉換治療還是后期延續(xù)治療，第三代AI對于絕經后激素受體陽性的乳腺癌患者在長期療效和安全性方面更具有優(yōu)勢［12-15］。

由于第三代AI上市時間短，國內外為數(shù)不多的研究主要集中于來曲唑與放療的相互作用［16-18］。

同是第三代AI，但依西美坦和來曲唑作用機制不同，來曲唑為非甾體類的AI，主要作用于芳香化酶的細胞色素P450酶，其作用是可逆的；而依西美坦為甾體類芳香化酶致死性抑制劑，它結構上與該酶的自然底物雄烯二酮和睪酮結構相似，為芳香酶的偽底物，通過不可逆地與該酶的活性位點結合而使其失活，形成中間產物而引起永久性的酶滅活，從而抑制雌激素的合成，明顯降低絕經婦女血液循環(huán)中的雌激素水平［19-20］，而且不影響可的松和醛固酮的合成。但依西美坦與放療的相互作用情況目前尚缺乏相關的研究。

本研究的成克隆試驗結果顯示，無論放射前或放射后聯(lián)合依西美坦處理MCF-7細胞，依西美坦均具有放射增敏作用，MTT結果也進一步說明兩者聯(lián)合應用時細胞生長明顯受到抑制。本研究還發(fā)現(xiàn)，依西美坦放射增敏機制可能與促進細胞凋亡有關。因為通過DAPI染色法觀察細胞核固縮情況，結果顯示，單純依西美坦對細胞凋亡影響不明顯，但聯(lián)合放射能促進細胞凋亡，而且使抗凋亡指數(shù)Bcl-2降低和促凋亡指數(shù)Bax升高，能進一步增加放射誘導的細胞毒作用［21］。

但實驗室研究與臨床研究結論往往存在不一致性。本研究結果顯示，依西美坦聯(lián)合同期或序貫放射均能提高人乳腺癌MCF-7細胞的放射敏感性，其具有放射增敏作用。同期依西美坦是否會導致增加患者放療的不良反應，另一方面，延遲依西美坦的起始時間是否會影響療效，或在放射治療預防局部復發(fā)的同時是否會失去全身治療的保障，這些問題仍需我們進一步開展前瞻性臨床隨機對照研究來探討乳腺癌術后放療聯(lián)合AI內分泌治療的時序性，尋找最佳治療模式來指導臨床實踐，使患者獲得更好的生存受益。

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DOI：10.3969/j.issn.1007-3969.2016.05.017

中圖分類號：R737.9

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3639（2016）05-0452-06

收稿日期：（2015-10-09修回日期：2015-12-30）

基金項目：上海市黃浦區(qū)衛(wèi)計委優(yōu)秀學科帶頭人培養(yǎng)項目課題［（2013）HWR/D-10］。通信作者：陳剛E-mail：fodeng73@163.com

Effect of concurrent or sequential exemestane combined with radiation on radiosensitivity of MCF-7cells

CHEN Gang1， JIN Yening2， ZHANG Shunkang1， WANG Xin1
（1. Department of Radiation Oncology，Huangpu District Central Hospital， Shanghai 200002， China； 2. Department of Radiotherapy， Ruijin Hospital， Shanghai Jiao Tong University， School of Medicine， Shanghai 200025， China）Correspondence to： CHEN Gang E-mail： fodeng73@163.com

［Abstract］Background and purpose： Radiotherapy and endocrine therapy are both important parts of adjuvant therapy for breast cancer， yet few studies have been conducted focusing on the interaction between radiation and endocrine therapy. Up to now， no conclusion has been drawn on the timing sequence of adjuvant radiation and endocrine therapy， which is indeed crucial in clinical practice. This study intended primarily to investigate the effect of concurrent or sequential exemestane combined with radiation on radiosensitivity of MCF-7 cells and its possible mechanism， and further to provide rationale for optimal clinical treatment modality. Methods： MCF-7 cells were arranged into three trial groups： the radiation group， exemestane sequenced with radiation group and exemestane followed radiation group. Radiosensitivity was evaluated by clonogenic assay， cell proliferation was measured by MTT assay， the ability to induce cell apoptosis was evaluated by DAPI staining assay， the changes of Bcl-2 and Bax were detected by Western blot. Results： Sensitive enhancement ratios （SER） were 1.51 and 1.37 in the exemestane sequenced with radiation group and exemestane followed radiation group， respectively. Compared with the radiation group， the percentage of cellular proliferation inhibition and apoptosis increased obviously in the exemestane sequenced with radiation group and exemestane followed radiation group. Exemestane combined with radiation made the Bax protein increase obviously and the Bcl-2 protein lowered significantly. Conclusion： Exemestane can enhance the radiosensitivity of MCF-7 cells， whose mechanism might be relevant to the promotion of cellular apoptosis. However，the treatment sequence does not affect the outcome.

［Key words］Exemestane； MCF-7 cell； Radiosensitivity