MTBDRplus在初治2個月末涂陽肺結(jié)核治療中的應(yīng)用*

黃富禮，周祖模，劉 偉，孫 峰，黃何清，吳 剛，金嘉琳△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染科，四川瀘州 646000；2.浙江諸暨市人民醫(yī)院感染科，311800；3.杭州市疾病預(yù)防控制中心，310021；4.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科，上海200040)

MTBDRplus在初治2個月末涂陽肺結(jié)核治療中的應(yīng)用*

黃富禮1，周祖模2，劉 偉3，孫 峰4，黃何清2，吳 剛1，金嘉琳4△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染科，四川瀘州 646000；2.浙江諸暨市人民醫(yī)院感染科，311800；3.杭州市疾病預(yù)防控制中心，310021；4.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科，上海200040)

目的 運(yùn)用分子線性探針技術(shù)(MTBDRplus)對2個月末涂片陽性的初治肺結(jié)核患者進(jìn)行快速耐藥檢測及個體化治療指導(dǎo)，并觀察其預(yù)后。方法 選擇基線及2個月末痰涂片仍為陽性的初治肺結(jié)核患者隨機(jī)分兩組，分別予以傳統(tǒng)直接觀察(或面視)下的短程化療(Directly Observed Treatment +short course chemotherapy，DOTs)方案及分子藥敏指導(dǎo)治療，并比較預(yù)后。結(jié)果 在分子藥敏指導(dǎo)治療組中成功率，完全敏感的為74.4%，單耐異煙肼為87.5%，單耐利福平100.0%，耐多藥結(jié)核75.0%；DOTs方案組中，成功率為單耐異煙肼25.0%，單耐利福平耐和耐多藥結(jié)核均為0.0%。兩組預(yù)后χ2分析顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.044)。結(jié)論 MTBDRplus應(yīng)用在2個月末涂陽初治肺結(jié)核患者中可改善預(yù)后。

結(jié)核,肺；分子探針技術(shù)；預(yù)后；MTBDRplus；初治，2個月末涂陽

WHO評估了全球新發(fā)耐多藥結(jié)核(multiple drug resistant tuberculosis，MDR-TB)病患者的數(shù)量，其中超過50%的患者分布在3個國家，即印度、中國和俄羅斯[1]。中國耐多藥結(jié)核病在初治與復(fù)治中的發(fā)病率分別為5.7%和25.6%[2]，而目前只有18.0%的初治患者和9.0%的復(fù)治患者實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)的抗癆方案[3]。傳統(tǒng)藥敏試驗耗時很長和生物安全性要求高等缺點(diǎn)，限制了其在臨床的應(yīng)用。無藥敏結(jié)果的DOT(directly observed treatment)和DOTs(directly observed treatment +short course chemotherapy)結(jié)核治療方案可能是耐多藥甚至是廣泛耐藥結(jié)核發(fā)生的原因之一[4]?？焖贆z測結(jié)核分支桿菌耐藥性已成為2011～2015年全球結(jié)核病伙伴關(guān)系計劃的重要組成部分[5]。運(yùn)用分子線性探針技術(shù)(MTBDRplus)和MTBDRsl快檢測MDR-TB和廣泛耐藥結(jié)核(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)并指導(dǎo)其治療可以顯著提高復(fù)治結(jié)核患者第6個月痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰率[6]。課題組前期研究表明在2個月末凃陽的患者中，其耐藥發(fā)生率及治療失敗率明顯高于涂陰患者[7]。所以有必要對2個月末仍凃陽的患者進(jìn)行個體化指導(dǎo)治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取浙江省諸暨市人民醫(yī)院2011年2月到2013年1月(包括隨訪的6個月時間)就診并完成治療療程的430例基線涂片陽性的痰標(biāo)本，經(jīng)常規(guī)治療2個月后痰涂片仍然陽性的初治患者77例，按照患者發(fā)現(xiàn)的順序依次編號，根據(jù)編號的順序及其對應(yīng)的分組號進(jìn)行分組。試驗組與對照組，其中試驗組為線性探針快速藥敏檢測組，根據(jù)分子藥敏結(jié)果調(diào)整治療方案，對照組為傳統(tǒng)的DOTs方案(無藥敏結(jié)果的治療方案)。結(jié)核菌的分離培養(yǎng)在諸暨市人民醫(yī)院臨床實(shí)驗室進(jìn)行，結(jié)核菌的鑒定及傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗在浙江省杭州市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行，結(jié)核菌的快速分子檢測在復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科實(shí)驗室進(jìn)行。倫理學(xué)審查在華山醫(yī)院倫理審查委員會表決通過。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 年齡18歲以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：惡性腫瘤患者，HIV感染，吸毒史，復(fù)治患者，非結(jié)核分枝桿菌感染，肝硬化，慢性腎能衰竭和血糖控制不佳者。采集所有患者的人口學(xué)數(shù)據(jù)。

1.3 預(yù)后判定、藥敏檢測及治療方案調(diào)整 治療結(jié)果分類根據(jù)WHO結(jié)核治療指南進(jìn)行[8]。所有對照組患者菌株的傳統(tǒng)藥敏均在隨訪結(jié)束后統(tǒng)一進(jìn)行檢測。參照中國防癆協(xié)會1995 年制定的結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗規(guī)程[9]，以對硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼(PNB/TCH)試驗進(jìn)行菌群鑒定，藥敏試驗采用世界衛(wèi)生組織推薦的比例法。結(jié)核菌DNA的提取及MTBDRplusPCR擴(kuò)增，根據(jù)DNA抽提試劑盒及MTBDRplus說明書進(jìn)行操作。所有檢測在8 h內(nèi)完成，包括rpoB基因檢測及耐異煙肼熱點(diǎn)突變基因katG和inhA。治療方案的調(diào)整，參考WHO及中國耐藥結(jié)核治療指南進(jìn)行調(diào)整[10-11]。初治患者前2個月按照2HREZ/4HR方案進(jìn)行治療，2個月末涂片陽性的患者如果入組快速分子藥敏檢測指導(dǎo)治療組則根據(jù)檢測結(jié)果調(diào)整方案其中單耐異煙肼調(diào)整為3REZLfx/6RELfx；利福平耐藥調(diào)整為 3HEZLfx/9HELfx；耐多藥結(jié)核調(diào)整6ZKmLfxCsPAS/12ZLfxCsPAS(R：利福平；E：乙胺丁醇；Z：吡嗪酰胺；Lfx：左氧氟沙星；Cs：環(huán)絲氨酸；PAS：對氨基水楊酸)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 所有分析均使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行，計數(shù)資料以率表示，比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌耐藥情況 2011年2月至2013年1月，總計有430例基線痰涂片陽性患者納入本研究，其中除去復(fù)治、遷出者、非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)、合并腫瘤者、不愿意加入本試驗者、2個月末涂片陰性者，最終有77例初治且2個月末涂陽的患者入組。按照2∶1的比例進(jìn)行隨機(jī)分組，其中試驗組有52例患者，包括全敏感患者39例，單耐異煙肼(isoniazid，H)8例，單耐利福平(rifampin，R)1例及MDR-TB 4例；對照組25例，包括全敏患者18例，單耐H 4例，單耐R 1例及MDR-TB 2例。見圖1。

HRR：耐藥；s：敏感。

圖1 治療流程圖

2.2 入組患者人口學(xué)特點(diǎn) 試驗組患者中男性占76.9%，55歲及以上患者為57.7%，76.9%患者為浙江本地人，65.4%的患者有肺部空洞，86.5%患者有合并癥，51.9%患者為小學(xué)及以下文化程度，59.6%的患者基線痰涂片結(jié)核菌載量大于++；對照組中男性為80.0%，55歲及以上患者為36.0%，80.0%患者為浙江本地人，68.0%患者有空洞，80.8%患者有合并癥，60.0%患者為小學(xué)及以下文化程度。通過對兩組患者研究變量進(jìn)行χ2分析(Fisher確切概率法)，研究變量包括性別、年齡、籍貫、是否有空洞、BMI值、受教育程度、是否有合并癥、基線痰菌載量、耐異煙肼及耐利福平的情況，發(fā)現(xiàn)對照組與試驗組其變量分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 兩組變量分析[n(%)]

2.3 MTBDRplus結(jié)果 檢測結(jié)果提示試驗組與對照組發(fā)生耐藥基因突變的菌株共20株，其中試驗組有13例發(fā)生突變，對照組有7例發(fā)生突變。其中rpoB基因突變較少，且位點(diǎn)較分散。單獨(dú)出現(xiàn)該基因突變的有2例，單獨(dú)katG和(或)inhA基因突變的有12例， rpoB聯(lián)合katG和(或)inhA突變6例，katG基因突變位點(diǎn)都集中在其MUT1位點(diǎn)，inhA基因突變的有2例。所有耐藥基因 (rpoB、katG、inhA) 突變位點(diǎn)分布情況見表2、3。

表2 分子藥敏指導(dǎo)治療組MTBDRplus 結(jié)果

-：該基因沒有發(fā)生突變或缺失；Δ：其對應(yīng)的基因有缺失；ΔWT8：WT8位點(diǎn)的基因有缺失，表明有耐藥發(fā)生；MUT：對應(yīng)的位點(diǎn)有基因的突變，也代表有耐藥發(fā)生。

表3 傳統(tǒng)藥敏指導(dǎo)治療組MTBDRplus結(jié)果

-：該基因沒有發(fā)生突變或缺失；Δ：其對應(yīng)的基因有缺失；ΔWT8：WT8位點(diǎn)的基因有缺失，表明有耐藥發(fā)生；MUT：對應(yīng)的位點(diǎn)有基因的突變，也代表有耐藥發(fā)生。

2.4 治療結(jié)果 在分子藥敏指導(dǎo)治療組中，治療成功率依次為全敏感患者74.4%，單耐異煙肼87.5%(7/8)，單耐利福平100.0%，MDR-TB 75.0%；在傳統(tǒng)DOTs治療組中，治療成功率依次為單耐異煙肼25.0%，單耐利福平0%，MDR-TB 0%?？ǚ椒治鲲@示，在全部敏感患者中，分子藥敏指導(dǎo)組與傳統(tǒng)組比較其治療結(jié)果沒有顯著差異(P=0.54)，而在單耐異煙肼和(或)利福平組中其治療結(jié)局差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.017)，見圖2。分子藥敏指導(dǎo)治療組與傳統(tǒng)治療組其預(yù)后有差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.044)，見圖3。

圖2 分子藥敏及傳統(tǒng)DOTs方案治療組敏感者與耐藥者成功率比較

圖3 分子藥敏組與傳統(tǒng)DOTs方案組總治療成功率比較

3 討 論

耐藥結(jié)核是影響結(jié)核控制的重要因素[12-13]。初治結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)方案中強(qiáng)化期為2個月，如果在2個月末未獲得較好的痰涂片陰轉(zhuǎn)率可能導(dǎo)致較差的治療結(jié)局[14]，所以本研究選擇了初治2個月末痰抗酸染色仍為陽性的患者進(jìn)行研究 。18個月時間內(nèi)所有初治且2個月末涂陽的患者共77例，卡方分析提示兩組患者研究變量分布均勻，具有可比性。其中有52例患者入組分子藥敏指導(dǎo)治療組，25例患者入組傳統(tǒng)方案治療組。分子藥敏指導(dǎo)治療組中有8例單耐異煙肼，1例單耐利福平，及4例MDR-TB。25例傳統(tǒng)DOTs治療組中有4例單耐異煙肼，2例耐多藥結(jié)核。其總耐多藥患者比例為7.8%(6/77)，高于我國初治結(jié)核耐多藥5.7%的平均發(fā)病率[2]，同時單耐利福平的有兩例，占2.6%。單獨(dú)的rpoB基因突變較少，一般是伴隨有katG或(和)inhA的突變，故WHO從2010年即推薦用快速分子藥敏檢測rpoB基因來早期發(fā)現(xiàn)MDR-TB患者。MTBDRplus結(jié)果顯示， rpoB 基因突變主要集中在ΔWT7 (526-529 code)、ΔWT3/4MUT1 (531-539 code和ΔWT8MUT3 (530-533 code)，位點(diǎn)較分散，而katG 基因突變主要集中在 Δ WT,MUT1 (codon 315),且占異煙肼總的耐藥基因突變的88.9% (16/18),inhA 基因突變僅有2例患者,均為 ΔWTMUT1 (-15 code)，這與利福平及異煙肼突變好發(fā)位點(diǎn)有關(guān)，利福平rpoB基因突變位點(diǎn)范圍較廣，而異煙肼的katG基因突變主要就集中在315密碼子。 分子藥敏指導(dǎo)治療組成功率高于傳統(tǒng)DOTs治療組，χ2分析其預(yù)后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.044)，其中在全敏患者中，分子藥敏指導(dǎo)組與傳統(tǒng)組預(yù)后沒有顯著差異，而在單耐H和(或)R組中有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.017)。而兩組內(nèi)MDR-TB預(yù)后比較無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與耐藥結(jié)核患者樣本量偏少有關(guān)。

在分子藥敏指導(dǎo)治療的13例耐藥患者(8例單耐異煙肼，1例單耐利福平，4例MDR-TB)中有10例患者治愈。調(diào)整方案為單耐異煙肼及利福平者改用左氧氟沙星，其中單耐異煙肼患者療程為9個月(3REZLfx/6RELfx)，單耐利福平者為12個月(3HEZLfx/9HELfx)。對于MDR-TB患者則改用6PASLfxZKmCs/12 PASLfxZCs。在這些耐藥患者中，8例異煙肼單耐患者，有7例治療成功，1例失敗(在治療過程因肺結(jié)核導(dǎo)致呼吸衰竭死亡)，這例患者為78歲男性，因服用胃腸道藥物不良反應(yīng)明顯，依從性不好，治療效果不佳，在治療第3月死亡，這與多數(shù)耐藥產(chǎn)生及治療失敗的原因類似[15]。因為藥物不良反應(yīng)導(dǎo)致患者不能堅持服藥，依從性相對較差，從而又誘發(fā)新的耐藥，最終導(dǎo)致治療失敗。1例利福平單耐患者為38歲男性，盡管肺部有空洞，但更改治療方案后治療成功。4例MDR-TB患者中，平均年齡為32.5歲，最大55歲，最小18歲，其中3例治療成功，1例失敗。傳統(tǒng)藥敏治療組中，2例MDR-TB患者及1例單耐利福平的患者均治療失敗。

MTBDRplus能快速檢測出耐藥結(jié)核，用于指導(dǎo)初治肺結(jié)核治療可以改善2個月末涂片仍陽性的患者預(yù)后。

本研究的不足之處為僅選擇2個月末仍涂陽且為初治患者作為入組條件，大多數(shù)初治患者經(jīng)正規(guī)抗結(jié)核治療2個月后痰菌一般會陰轉(zhuǎn)，同時因為在初治患者中耐藥結(jié)核發(fā)生率相對較低，所以入組樣本量較少，而能調(diào)整治療方案的患者相對更少。

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The application of MTBDRplusin treatment new tuberculosis for smear positive at the end of two months*

HuangFuli1,ZhouZumo2,LiuWei3,SunFeng4,HuangHeqing2,WuGang1,JinJialin4△

(1.AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China; 2.ZhujiPeople′sHospital,Zhuji,Zhejiang311800,China;3.DiseaseControlandPreventionCenter,Hangzhou,Zhejiang310021,China;4,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai,200040,China)

Objective Individualize treatment new tuberculosis patients whose smear positive at the end of two months after treatment by MTBDRplusand describe the treatment outcomes among patients in Zhejiang province.Methods We prospectively enrolled sputum smear positive at the end of two months after treatments.For two groups,one group

World Health Organization recommended initial treatment regimen[without DST(Drug sensitivity test) results],the other treatment according to the results of molecular line-probe assay(GenoType MTBDRplus).Treatment responses were monitored using sputum smear,culture and chest radiography.Results The success rate of totally sensitive patients were 74.4%,87.5% single resistant to isoniazid,rifampin resistant single 100% and MDR-TB 75% in MTBDRplusmolecular susceptibility guidance treatment group;in the conventional treatment group,the success rate of treatment were 25% single resistant to isoniazid,rifampin resistant 0% single and MDR-TB 0%.Chi square analysis showed that,molecular susceptibility guide therapy group and traditional therapy group and its prognosis is statistically significant (P=0.044).Conclusion Molecular line-probe assay(MTBDRplus)improved the initial treatment of smear positive at the end of two months after treatment tuberculosis patients prognosis.

tuberculosis,pulmonary;molecular probe techniques;prognosis; MTBDRplus;new treatment,smear positive at the end of two months

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.34.013

四川省瀘州市科技局資助項目[2014-s-45(7/12)]；西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院博士基金(14047)。 作者簡介：黃富禮(1976-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事耐藥結(jié)核及不明原因發(fā)熱的診治。△

，E-mail:jinjialin@fudan.edu.cn。

R453.9

A

1671-8348(2016)34-4791-04

2016-04-18

2016-06-06)