陽虛體質的血漿1H-NMR代謝組學研究*

劉 飛,張 鵬,吳淡娟，趙明海,紀婷婷

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院檢驗科， 廣州 510515)

陽虛體質的血漿1H-NMR代謝組學研究*

劉 飛,張 鵬△,吳淡娟，趙明海,紀婷婷

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院檢驗科， 廣州 510515)

目的 應用核磁共振(NMR)波譜學的代謝組學方法，檢測中醫(yī)體質分類中陽虛體質與平和體質的血漿代謝物，研究陽虛體質中特征代謝物的特點。方法 收集陽虛體質與平和體質各8例的血液樣品，采用橫向豫馳時間的分布曲線磁共振脈沖序列(CPMG)采集血液樣品數(shù)據(jù)，觀測血漿中的小分子代謝物。用多元統(tǒng)計分析方法比較陽虛體質組與平和體質組血漿內源性差異代謝產物。結果 血漿中的代謝產物，與平和體質組相比，在陽虛體質組中乳酸(shift 1.33;t=-3.018)、低密度膽固醇脂蛋白(shift 1.26;t=-2.849)、脂肪酸(shift 2.25;t=-3.325)、氧化三甲胺(shift 3.26;t=-5.217)、N-乙酰糖蛋白(shift 2.03;t=-4.684)水平都有不同程度下降；而磷脂酰膽堿(shift 3.22;t=3.901)、葡萄糖(shift 3.42;t=3.390)與谷氨酰胺(shift 2.12;t=5.177)水平都有不同程度升高。結論 陽虛、平和體質不僅存在體內生物合成與分解中能量代謝、糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝等的差異，也存在神經(jīng)遞質、臟腑功能的改變。

陽虛；能量代謝；體質學說；平和體質；代謝組學

在當代，“中醫(yī)體質學說”的概念被明確提出，中醫(yī)體質是個體生命過程中，在先天稟賦基礎上、隨年齡、性別、生活條件、地理環(huán)境及社會因素等的發(fā)展變化形成的具有差異性的，但又相對穩(wěn)定的固有特質[1]?！吨嗅t(yī)體質分類與判定標準》在2009年由中華中醫(yī)藥學會制定發(fā)布?！皹藴省贝_定了中醫(yī)體質9種基本類型，平和體質為正常體質，其他8種體質類型氣虛質、陽虛質、陰虛質、痰濕質、濕熱質、血瘀質、氣郁質、特稟質屬于偏頗體質[2]。陽虛體質是對個體在未病或已病狀態(tài)下所表現(xiàn)的陽氣虧虛狀態(tài)的表述?！瓣枤馑靥摗薄瓣柼撝|”“中焦陽氣素虛之人”等皆為古代中醫(yī)學對陽虛體質的描述?！吨嗅t(yī)體質分類與判定》標準指出陽虛體質陽氣不足，以手腳發(fā)涼、腹部背部怕冷等虛寒表現(xiàn)為主要特征；以體倦嗜臥精神不振，飲食畏涼舌淡胖嫩有齒痕，脈沉遲等為日常表現(xiàn)。近年來，許多學者都對陽虛體質的機制進行了研究，為陽虛體質的診斷提供了一定的客觀數(shù)據(jù)[3]，研究主要包括基因組拷貝數(shù)變異、生理生化指標、外周血基因表達等方面[4-8]。代謝組學能準確地反映生物體系狀態(tài)，揭示機體代謝的本質。代謝組學越來越廣泛應用于中醫(yī)藥學領域[9-11]。其通過分析生物體液中的代謝產物的變化來確定代謝過程與參與的生物標志物，是生物體綜合狀態(tài)的直接體現(xiàn)[12]，但關于陽虛體質的代謝組學方面研究較少。其中核磁共振(NMR)技術是代謝組學中比較常用的處理方法，其檢測手段快速，準確性高，而且不會破壞組織樣品。故本研究采用基于NMR技術的代謝組學方法來研究陽虛體質與濕熱體質的血漿代謝產物，進一步探究二者代謝產物的變化，為尋找陽虛體質的差異代謝產物提供方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 于2015年3～4月在廣州市某社區(qū)招募志愿者，同時進行中醫(yī)體質問卷調查。根據(jù)中醫(yī)體質得分對志愿者體質進行判定[2]。篩選出符合陽虛體質與平和體質的研究對象共16例，每組體質各8例。研究對象年齡18～48歲，平均(33.50±10.99)歲。身體健康，近1個月內未服用任何藥物，經(jīng)本人知情同意后納入研究。兩組人群性別(P=1.000)、年齡(P=0.869)、BMI(P=0.966)比較，差異均無統(tǒng)計學意義。

1.2 儀器與試劑 瑞士Bruker公司 Bruker-500 AVANCEⅢ核磁共振譜儀、ZH-2型自動漩渦混合器(天津藥典標準儀器廠)、微量高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)、含氘代三甲基硅基丙酸鈉(TSP)(Sigma公司)、重水(D2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、氯化鈉(NaCl)。

英最終被確診為子宮內膜癌，幸運的是癌細胞并未向鄰近器官及組織擴散?？紤]英的年齡太大，不宜手術，醫(yī)生建議她馬上接受放療治療。英當然不懂這些，她只記得外甥說自己的病有得治。英舒了一口長氣，她的臉上有了久違的笑容，內心按捺不住高興。

1.3 血液標本的采集、預處理 志愿者在采樣前24 h禁酒、避免勞累、暴飲暴食，飲食清淡，心情平和。早上8:00空腹，由醫(yī)院專職醫(yī)務人員用肝素抗凝管抽取靜脈血3 mL。將所得血液樣品，14 000×g離心4 min，取血漿300 μL，加入100 μL的重水與200 μL PBS緩沖液，充分振蕩混勻，再加入5 mm核磁共振管中待用。

2.3 歸一化積分值得統(tǒng)計分析 根據(jù)PLS-DA模型的VIP大于1的化學位移值，找出其相對應的歸一化積分值，做統(tǒng)計分析，以P<0.05的原則，共找出16個差異化學位移值(表1)，將差異性值通過人類代謝組數(shù)據(jù)庫(http：//www.hmdb.ca)查找其所代表的代謝物。最后鑒定出對分類影響較大的差異性代謝物8個(表2)。與平和體質組相比，陽虛體質組的血漿代謝產物中乳酸(P=0.015、0.009、0.034)、極低密度脂蛋白/低密度脂蛋白(P=0.013、0.011)、脂肪酸(P=0.005)、氧化三甲胺(P=0.000)、N-乙酰糖蛋白(P=0.001)水平下降；而葡萄糖(P=0.010)、磷脂酰膽堿(P=0.002)與谷氨酰胺(P=0.000)水平升高。

“田阿姨，我們給你和楊叔叔各留了一塊糖，你吃吧，特別甜?！毙⊙绢^不說還好，一說，田志芳又抽抽嗒嗒哭起來。

JDBC數(shù)據(jù)庫連接技術：JDBC(Java Data Base Connectivity，java數(shù)據(jù)庫連接)是一種用于執(zhí)行SQL語句的Java API，也是基于標準SQL數(shù)據(jù)庫的訪問接口，可為多種關系數(shù)據(jù)庫提供統(tǒng)一訪問，它由一組用Java語言編寫的類和接口組成[5]。JDBC提供了一種基準，據(jù)此可構建更高級的工具和接口，使數(shù)據(jù)庫開發(fā)人員能夠編寫數(shù)據(jù)庫應用程序?？蛻舳送ㄟ^Java程序連接數(shù)據(jù)庫的關系如圖4所示。

2 結 果

1.統(tǒng)計學符號：按GB 3358-1982《統(tǒng)計學名詞及符號》的有關規(guī)定，統(tǒng)計學符號一律采用斜體。

1：陽虛體質組；2：平和體質組。

圖1 陽虛體質組與平和體質組的主成分分析模型矩陣圖

2.2 陽虛體質與平和體質血漿的1H NMR譜正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA) 陽虛體質與平和體質的血漿代謝組OPLS-DA模型見圖2。建模后計算出2個主成分，模型參數(shù)R2X=0.497，R2Y=0.999，Q2=0.954，對應積分矩陣圖,R2Y越接近于1，代表該模型建立越好。該模型解釋了49.7%的原始數(shù)據(jù)，并擁有95.4%的預測能力。圖中每個點代表1個樣本，綠色點為陽虛體質組，藍色點為平和體質組。結果，所有樣品集中分布于散點圖的橢圓內，模型擬合效果好，兩組之間完全分離，提示陽虛體質與平和體質血漿代謝產物差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1：陽虛體質組；2：平和體質組。

圖2 陽虛體質組與平和體質組正交偏最小二乘法分析模型矩陣圖

1.4 數(shù)據(jù)的采集和處理 應用核磁共振波譜儀，采用橫向豫馳時間的分布曲線磁共振脈沖序列(carr purcell meiboom gill，CPMG)檢測血漿中的小分子代謝物。相關參數(shù)如下：頻率為600 MHz，采樣點數(shù)為64 k，累加掃描次數(shù)為128次，譜寬為20×10-6Hz，豫馳延遲(relaxation delay)2 s，掃描時間1.638 s，采樣范圍-5～15，溫度為25 ℃。應用Mestrenova6.1軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，將獲得的血液1H-NMR數(shù)據(jù)經(jīng)傅里葉變換得到圖像梯度分布頻譜圖，然后進行統(tǒng)一的定標、基線、相位調整以及積分處理。本實驗以乳酸雙重峰(1.33)為標準化學位移進行定標，刪除4.6～6.0 ppm的水峰，將積分區(qū)間δ0.5～9.0 ppm以每段為δ0.01進行分段積分，對所有積分數(shù)據(jù)進行歸一化處理。為消除殘留的水信號影響實驗結果，在積分值表中將4.6～6.0 ppm區(qū)間的積分值刪除，然后將所得數(shù)據(jù)輸出并轉換到Excel 2007文件保存。

表1 陽虛體質與平和體質血漿代謝物歸一化積分值比較

↑：表示上升；↓：表示下降。

表2 陽虛體質與平和體質比較的差異性代謝產物

↑：表示上升；↓：表示下降。

3 討 論

在上述差異代謝物中，葡萄糖和N-乙酰糖蛋白與糖代謝相關。葡萄糖是人體內新陳代謝中不可或缺的重要物質之一，為血糖在血液運輸中的主要成分，并為體內氧化提供能量。N-乙酰糖蛋白與N-乙酰氨基半乳糖，N-乙酰葡萄糖胺，N-乙酰神經(jīng)氨酸均屬于同一類可組成糖蛋白糖鏈的單糖，糖蛋白糖鏈最獨特的生物學作用是參與如淋巴因子、白細胞介素等免疫介質的生物相互識別、結合，完成免疫應答反應過程。相比于平和體質組，陽虛體質組血漿中葡萄糖含量升高，而N-乙酰糖蛋白合成減少，提示陽虛體質存在一定程度的糖代謝紊亂，以及免疫功能下降。但具體機制仍需要進一步研究。

在這些差異代謝物中，與能量代謝有關的化合物有乳酸。糖酵解是乳酸生成的主要途徑，其方式又是生物體在無氧下從碳水化合物(糖類)獲得能量的一種主要形式。在體內的生物合成與分解中，葡萄糖經(jīng)過磷酸化、氧化等反應生成丙酮酸，有氧條件下，丙酮酸可進一步氧化磷酸化生成乙酰CoA進入三羧酸循環(huán)，釋放ATP能量，最后生成CO2和H2O；無氧條件下，糖酵解產生的丙酮酸則加氫還原為乳酸，并釋放出ATP能量[13]。平和體質組乳酸濃度水平高于陽虛體質組，提示總體能量代謝水平方面陽虛體質組是下降的；同時由于人體主要依賴外周血中的紅細胞運送氧分子供給其他細胞和組織進行能量代謝，但紅細胞、淋巴細胞中并無線粒體，主要依賴糖酵解的無氧代謝供給自身能量，乳酸濃度的下降提示這些組織的功能也可能因此受到影響?！端貑枴谜{經(jīng)論》指出陽虛體質的成因，即“陽虛則外寒，陰虛則內熱，陽盛則外熱，陰盛則內寒?！毕忍旆A賦陽氣的不足，或病后陽虧，容易形成陽虛體質。中醫(yī)認為，陽虛是陰陽平衡失調的狀態(tài)，陽虛體質總以陽“虛”為主要特征，由“虛”導致機體功能減退，反映在能量代謝上就表現(xiàn)為水平下降。

本研究采用1H NMR譜對陽虛體質與平和體質的血漿代謝產物進行分析(平和體質作為正常對照)，結果表明陽虛體質與平和體質主要存在能量代謝、糖代謝、脂代謝、蛋白質合成等方面的異常。

與中醫(yī)的整體觀一致，代謝組學研究從整體角度對陽虛體質的生物特征進行了探索。本研究結果表明陽虛體質不僅存在著能量代謝、糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝的改變，也存在著神經(jīng)遞質、臟腑功能及與免疫功能相關介質的改變。這些代謝特征既與陽虛體質的先天稟賦有關，也受到環(huán)境、飲食、氣候、心理等后天因素的影響，在先天與后天因素的共同影響下，導致了人體免疫功能、生物功能調節(jié)發(fā)生紊亂，進而影響代謝產物的變化。

就全國范圍而言，較之人均轉移支付額，人均GDP對中國教育水平提高的貢獻率要更高，為2.7%；而人均轉移支付額對中國教育水平提高的貢獻率為0.96%，僅為人均GDP貢獻率的35.6%?？梢娸^之財政轉移支付資金的支持，地方經(jīng)濟實力的提升更能有效地推動中國地區(qū)間教育水平的趨同。

本研究結果還發(fā)現(xiàn)，陽虛體質組的谷氨酰胺水平高于平和質組，而氧化三甲胺水平低于平和質組。其中氧化三甲胺與慢性腎病相關[15]。而谷氨酰胺作為非必需氨基酸，是人體必不可少的營養(yǎng)物質之一。谷氨酰胺是構成蛋白質分子的基本單位，可以增加蛋白質的合成，與氨基酸代謝、神經(jīng)遞質密切相關[16]。在興奮性神經(jīng)元中，谷氨酰胺被轉變?yōu)楣劝彼?，并在突觸小泡中重新組裝；在抑制性神經(jīng)元中，谷氨酰胺轉變?yōu)楣劝彼岷筮M一步轉變?yōu)棣?氨基丁酸，并包裝于突觸小泡中。

本研究結果顯示，陽虛體質血漿中低密度膽固醇脂蛋白水平降低，與脂代謝密切相關。脂蛋白是膽固醇及其酯化物、三酰甘油在體內運輸?shù)妮d體。高密度脂蛋白富含膽固醇，介導的膽固醇逆向轉運，即從外周組織攜帶膽固醇到肝臟中，再分泌到膽汁中，進而調節(jié)脂代謝、改善血脂異常[14]。而低密度脂蛋白運載膽固醇進入外周組織細胞，極低密度脂蛋白作用則主要是運輸三酰甘油用于能量代謝或儲存。脂肪酸也與脂、能量代謝密切相關。磷脂酰膽堿作為磷脂的主要成分之一，也參與了脂代謝。人體脂肪酸主要以機體主要的能量儲存形式三酰甘油存在。陽虛體質血漿中脂肪酸水平低于平和體質組，說明其存在脂代謝紊亂的表現(xiàn)，產能不足，皮下脂肪組織儲備不足，因而產生怕冷、手足不溫等癥狀。

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《重慶醫(yī)學》雜志對運用統(tǒng)計學方法的有關要求

2.1 陽虛體質與平和體質血漿的1H NMR譜主成分分析(PCA) 采用PCA方法對陽虛體質和平和體質兩組的血漿樣品的1H NMR譜進行分析，建模后累計計算出8個主成分，模型參數(shù)R2X=0.963，Q2=0.505，對應積分矩陣見圖1。R2X、Q2均大于0.5，說明該模型穩(wěn)定可靠，該模型分析了96.3%的原始數(shù)據(jù)。圖中每個點代表1個樣本，綠色點為陽虛體質組，藍色點為平和體質組。從圖1可以看出，所有樣本集中分布于散點圖的橢圓內，證明模型擬合效果較好，陽虛體質、平和體質兩組可被明顯區(qū)分開來，可進一步應用多種方法如OPLS-DA來分析代謝指紋。

1.5 NMR數(shù)據(jù)分析 本實驗采用SIMCA-P軟件(V13.00，Umetrics，Sweden)對獲得的NMR數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析。首先將錄入的Excel格式數(shù)據(jù)保存為CSV格式的文件，然后導入到SIMCA-P軟件，選擇進行主成分(PCA)分析，以及根據(jù)正交偏最小二乘(PLS-DA)法返回的回歸因子做類別判斷進行建模。通過PLS-DA模型獲得的得分圖與變量權重值(variable importance for the projection，VIP)分辨出對分類影響較大的變量，確定陽虛、平和二體質組間的差異代謝產物，據(jù)此確定出陽虛體質的差異性代謝產物。

基于矩生成函數(shù)近似的雙媒質協(xié)作通信功率優(yōu)化分配//陳智雄,景一方,韓東升,邱麗君,田新成//(23):159

2.研究設計：應告知研究設計的名稱和主要方法。如調查設計(分為前瞻性、回顧性或是橫斷面調查研究)，實驗設計(應告知具體的設計類型，如自身配對設計、成組設計、交叉設計、析因設計、正交設計等)，臨床試驗設計(應告知屬于第幾期臨床試驗，采用了何種盲法措施等)；主要做法應圍繞4個基本原則(重復、隨機、對照、均衡)概要說明，尤其要告知如何控制重要非試驗因素的干擾和影響。

4.統(tǒng)計學分析方法的選擇：對于計量資料，應根據(jù)所采用的設`計類型、資料所具備的條件和分析目的，選用合適的統(tǒng)計學分析方法，不應盲目套用t檢驗和單因素方差分析；對于計數(shù)資料，應根據(jù)所采用的設計類型、定性變量的性質和頻數(shù)所具備的條件及分析目的，選用合適的統(tǒng)計學分析方法，不應盲目套用χ2檢驗。對于回歸分析，應結合專業(yè)知識和散點圖，選用合適的回歸類型，不應盲目套用簡單直線回歸分析；對于具有重復實驗數(shù)據(jù)檢驗回歸分析資料，不應簡單化處理；對于多因素、多指標資料，要在一元分析的基礎上，盡可能運用多元統(tǒng)計分析方法，以便對因素之間的交互作用和多指標之間的內在聯(lián)系做出全面、合理的解釋和評價。

將圖1的四邊形OABC中的矢量等式r= b+ a- c的兩邊作自身的點積(數(shù)量積)有：rr= bb+ aa+ cc+ 2(ba- bc- ac)，即r2= b2+ a2+ c2+ 2(bacφ- bccφ?ψ- accψ)，[(b2+ a2+ c2- r2)/ 2+ bacφ] /c= acψ+ bcψ?φ，

5.統(tǒng)計結果的解釋和表達：應寫明采用統(tǒng)計學方法的具體名稱(如：成組設計資料的t檢驗、兩因素析因設計資料的方差分析、多個均數(shù)之間兩兩比較的q檢驗等)，統(tǒng)計量的具體質(如：t=3.45，χ2=4.68，F(xiàn)=6.79等)；在用不等式表示P值的情況下，一般情況下選用P>0.05、P<0.05和P<0.01 3種表達方式，無須再細分為P<0.001或P<0.000 1。當涉及總體參數(shù)(如總體均數(shù)、總體率)時，再給出顯著性檢驗結果的同時，應再給出95%可信區(qū)間(CI)。

Plasma 1H-NMR metabonomics research of Yang-deficiency constitution*

LiuFei,ZhangPeng△,WuDanjuan,ZhaoMinghai,JiTingting

(DepartmentofLaboratoryMedicine,NanFangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China)

Objective Plasma etabonomics was used to study yang-deficiency constitution,for analyzing the characteristic metabolites.Methods Plasma samples from 8 participants with yang-deficiency constitution and 8 participants with balanced constitution were collected.Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG) pulse sequence was used to collect plasma data,and to observe small molecule metabolites in plasma.Differences in endogenous metabolites were detected by multivariate statistical analysis.Results Compared with balanced constitution,lactic acid(t=3.018),low density lipoprotein cholesterol(t=-2.849),fatty acids(t=-3.325),trimethylamine oxide(t=-5.217),N - acetyl glycoproteinare(t=-4.684) lower in plasma of yang-deficiency constitution,while glucose(t=3.390),phosphatidyl choline(t=3.901) and glutamine(t=5.177) are higher.Conclusion The biomarkers supply new ways for the individual differences from the point of view of metabonomics.Yang-deficiency constitution has some metabolism disorder of energy,sugar,lipid,and amino acid metabolism,the neurotransmitter,and viscera function.

yang deficiency;energy metabolism;physical constitution theory;balanced constitution;metabonomics

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.34.008

廣東省中醫(yī)藥局基金項目資助(20132184)。 作者簡介：劉飛(1974-)，主管技師，碩士，主要從事臨床試驗診斷學的研究?！?/p>

，E-mail:nfyyzp@126.com。

R446.1

A

1671-8348(2016)34-4775-04

2016-05-17

2016-08-05)