流式細(xì)胞儀檢測(cè)P-selectin和t-PA的方法學(xué)評(píng)價(jià)及臨床應(yīng)用*

陳 潔，黃 山，左 麗

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬省人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心，貴陽 550002；2.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550001)

·技術(shù)與方法·

流式細(xì)胞儀檢測(cè)P-selectin和t-PA的方法學(xué)評(píng)價(jià)及臨床應(yīng)用*

陳 潔1，黃 山1，左 麗2△

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬省人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心，貴陽 550002；2.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550001)

目的 對(duì)FACSArray流式細(xì)胞儀檢測(cè)P選擇素(P-selectin)、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)進(jìn)行方法學(xué)性能評(píng)價(jià)，并觀察其與冠心病各亞組的相關(guān)性。方法 用FACSArray流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定P-selectin、t-PA的精密度、準(zhǔn)確度，對(duì)靈敏度、干擾試驗(yàn)等分析性能進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)價(jià)。同時(shí)，對(duì)患有冠心病的患者血清P-selectin、t-PA濃度進(jìn)行檢測(cè)，觀察其血清含量與冠心病的相關(guān)性。結(jié)果 P-selectin、t-PA的批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為4.23%～9.00%、4.63%～11.00%和2.20%～2.90%、6.30%～12.20%；P-selectin、t-PA的相對(duì)偏倚分別為2.71%～5.28 %和1.23%～4.16%，檢測(cè)靈敏度為16.20 ng/L和1.21 ng/mL。高濃度的三酰甘油、血紅蛋白和膽紅素對(duì)P-selectin測(cè)定時(shí)的干擾率分別為14.65%、13.89%和10.94%，對(duì)t-PA測(cè)定時(shí)的干擾率分別為15.65%、13.23%和12.94%；各冠心病亞組P-selectin的濃度范圍為(54 020.1±3 390.1)～(83 189.8±7 226.3)ng/L，t-PA的濃度范圍為(9.59±2.13)～(28.72±2.15)ng/mL，與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 FACSArray流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)血清P-selectin、t-PA的分析性能符合規(guī)定的性能指標(biāo)，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的需要。

流式細(xì)胞儀；方法學(xué)評(píng)價(jià)；冠心??； P選擇素；組織型纖溶酶原激活物

近年來，許多新的心臟標(biāo)志物伴隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展而在臨床應(yīng)用中不斷發(fā)揮著重要的作用，已經(jīng)為心臟疾病的診斷、療效觀察、危險(xiǎn)性評(píng)估和預(yù)后估計(jì)等方面做出了重要的貢獻(xiàn)[1]。許多研究表明,在纖溶和血栓形成標(biāo)志物，如P-選擇素(P-selectin)、組織型血漿纖溶酶原激活物(t-PA)參與了動(dòng)脈粥樣硬化的形成[2]。臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)這兩種標(biāo)志物的檢測(cè)方法有很多，但是在方法學(xué)上存在線性較窄、可比性差、干擾因素多等缺點(diǎn)。為了保證患者檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，滿足實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可對(duì)方法學(xué)性能驗(yàn)證的要求[3]，本文利用美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSL)的有關(guān)要求，對(duì)FACSArray流式細(xì)胞儀檢測(cè)P-selectin、t-PA行了方法學(xué)評(píng)價(jià),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 自2014年9月至2015年3月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科住院患者和健康體檢者，冠心病患者經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影術(shù)檢查確診，分為對(duì)照組和冠心病組。冠心病組中分為穩(wěn)定性心絞痛(SAP)75例，不穩(wěn)定型心絞痛(UAP)75例，急性心肌梗死(AMI)75例。對(duì)照組為各體檢指標(biāo)合格的健康人群，共75例。冠心病組排除入院前行經(jīng)靜脈溶栓或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)的患者[4]。UAP組和SAP組病例符合美國心臟病學(xué)會(huì)/美國心臟協(xié)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn)。AMI組所有病例均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)的診斷標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有入選對(duì)象凡有下列情況者予以排除[5-10]：血小板計(jì)數(shù)過低(<50×109/L)及服用血小板功能抑制劑者、嚴(yán)重的肝腎功能不全、糖尿病、急性感染期、高熱、惡性腫瘤放/化療、風(fēng)濕活動(dòng)期等。

表1 P-selectin和t-PA 批內(nèi)精密度驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

表2 P-selectin和t-PA批間精密度驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本制備 在當(dāng)天清晨冠狀動(dòng)脈造影檢查術(shù)前，進(jìn)行空腹無菌采集肘靜脈血，分離血清凍存在-80 ℃醫(yī)用冰箱內(nèi)；以備同時(shí)檢測(cè)P-selectin和t-PA。

1.2.2 系統(tǒng)性評(píng)價(jià) 將FACSArray流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)后，應(yīng)用CLSI的有關(guān)規(guī)則對(duì)流式細(xì)胞儀檢測(cè)P-selectin和t-PA的精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、干擾試驗(yàn)等分析性能進(jìn)行系統(tǒng)性評(píng)價(jià)[11]；并檢測(cè)冠心病各亞組血清中P-selectin和t-PA的濃度，并分析其濃度與冠心病各亞組的相關(guān)性。

1.2.2.1 精密度試驗(yàn) 分別選擇高低兩個(gè)濃度的P-selectin和t-PA的校準(zhǔn)品進(jìn)行精密度試驗(yàn)，批內(nèi)精密度為對(duì)同一樣品同時(shí)重復(fù)檢測(cè)20次計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。批間精密度為對(duì)每個(gè)樣品每天檢測(cè)一次，連續(xù)20 d，計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

1.2.2.2 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 選擇一高一低兩個(gè)濃度的P-selectin和t-PA校準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，以校準(zhǔn)品的濃度為預(yù)期靶值，實(shí)際檢測(cè)值為驗(yàn)證值，將驗(yàn)證值與預(yù)期靶值進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算驗(yàn)證值與靶值的相對(duì)偏倚(%)。

1.2.2.3 分析靈敏度(LLD)試驗(yàn) 分別選擇P-selectin 和t-PA的低值校準(zhǔn)品進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)，以稀釋液為空白樣品，分別對(duì)空白樣品和低值校準(zhǔn)品進(jìn)行10次檢測(cè)，記錄每次檢測(cè)的熒光強(qiáng)度值，按照《實(shí)用臨床實(shí)驗(yàn)室管理學(xué)》(叢玉隆主編，2011年版)推薦方法經(jīng)過計(jì)算即得LLD。

1.3 儀器 FACSArray流式細(xì)胞儀(美國BD公司)

1.4 試劑和標(biāo)準(zhǔn)品 生物素標(biāo)記的羊抗人P-selectin單克隆抗體(批號(hào)51-9006168，美國BD公司)，P-selectin校準(zhǔn)品(批號(hào)560426，美國BD公司)；生物素標(biāo)記的羊抗人t-PA單克隆抗體(BAM217,美國R&D公司)；人t-PA校準(zhǔn)品(10157-H01H1，北京義翹神州生物技術(shù)有限公司)。

2 結(jié) 果

2.1 精密度驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)高低兩個(gè)稀釋濃度的P-selectin、t-PA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行精密度試驗(yàn)，其批內(nèi)精密度結(jié)果見表1；批間精密度試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 P-selectin和t-PA相對(duì)偏差要求均小于20%,見表3。P-selectin 的空白和低濃度樣本的MFI的均值分別為47.90和88.90，標(biāo)準(zhǔn)差分別為2.76和4.04。按照99.70%的可信度，空白樣本3倍標(biāo)準(zhǔn)差為2.76×3=8.28，低濃度樣品MFI 88.90扣除空白值47.9后為41.00，因此，MFI為8.28時(shí)相當(dāng)于P-selectin 檢測(cè)靈敏度為：8.28/41.00×78.12=15.78(ng/L)。t-PA濃度的空白樣本和低濃度樣本的MFI均值分別為0.3和8.5，標(biāo)準(zhǔn)差分別為2.414和2.651，按照99.70%的可信度，低濃度樣品MFI8.5扣除空白值0.3后為8.2，空白樣本3倍標(biāo)準(zhǔn)差為2.414×3=7.242，MFI為7.242時(shí)，t-PA檢測(cè)靈敏度為：7.242/8.2×1.37=1.21(ng/mL)。見表4。

表3 P-selectin和t-PA準(zhǔn)確度驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.3 干擾試驗(yàn) 取患者血漿，加入聚苯乙烯微球、高低兩個(gè)濃度水平的血紅蛋白、三酰甘油和膽紅素作干擾試驗(yàn)；聚苯乙烯微球、高濃度的三酰甘油(17 mmol/L)、血紅蛋白(12 g/L)和膽紅素(170 μmol/L)對(duì)P-selectin測(cè)定時(shí)的干擾率分別為4.10%、14.65%、13.89%和10.94%；對(duì)t-PA測(cè)定時(shí)的干擾率分別為2.90%、15.65%、13.23%和12.94%，對(duì)檢測(cè)有一定的干擾。聚苯乙烯微球、低濃度的三酰甘油(0.76 mmol/L)、血紅蛋白(0.5 g/L)和膽紅素(1.7 μmol/L)對(duì)P-selectin測(cè)定時(shí)的干擾率分別為2.10%、4.12%、3.98%和2.43%；對(duì)t-PA測(cè)定時(shí)的干擾率分別為1.95%、3.65%、3.76%和2.94%，對(duì)檢測(cè)干擾相對(duì)高濃度干擾物影響較小。

表4 P-selectin和t-PA靈敏度驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

-：表示沒有意義，所以未計(jì)算。

2.4 對(duì)照組及冠心病組血清P-selectin和t-PA水平比較 對(duì)照組P-selectin和t-PA顯著低于冠心病組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 對(duì)照組與冠心病組血清P-selectin和t-PA水平比較

a：P<0.05,與對(duì)照組比較；b:P<0.05，與SAP組比較。

3 討 論

根據(jù)ISO15189醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)和美國《臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)法修正案》(CLIA88)的規(guī)定，實(shí)驗(yàn)儀器在用于臨床之前必須對(duì)其不精密度、不準(zhǔn)確度、分析靈敏度和干擾試驗(yàn)等主要分析性能進(jìn)行驗(yàn)證。檢驗(yàn)儀器的檢測(cè)性能是否能夠滿足是否能夠滿足相關(guān)要求是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可和“檢驗(yàn)結(jié)果互認(rèn)”的根本保證。本研究對(duì)FACSArray檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定P-selectin和t-PA的分析性能進(jìn)行驗(yàn)證，旨在驗(yàn)證流式細(xì)胞儀的方法學(xué)和儀器性能是否能滿足實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的需要，并且通過檢測(cè)對(duì)照組和冠心病組血清P-selectin、t-PA的濃度差異，為冠心病的診斷提供一定的臨床參考依據(jù)。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)血漿P-selectin、t-PA的方法學(xué)評(píng)價(jià)包括檢測(cè)系統(tǒng)的精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度的評(píng)價(jià)以及干擾試驗(yàn)，檢測(cè)系統(tǒng)精密度評(píng)價(jià)中，根據(jù)CLIS EP5-A2文件計(jì)算的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均在試劑說明書范圍內(nèi)[12]，也未超過CLSI要求一般免疫試驗(yàn)20%的水平[13]，達(dá)到了公認(rèn)的質(zhì)量要求。在準(zhǔn)確度試驗(yàn)中，P-selectin和t-PA兩個(gè)濃度的相對(duì)偏倚采用CLSI EP9-A2文件進(jìn)行準(zhǔn)確度驗(yàn)證和偏倚評(píng)估，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于CLSI要求20%的允許誤差范圍內(nèi)，達(dá)到公認(rèn)的質(zhì)量要求。流式細(xì)胞儀靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)中P-selectin和t-PA檢測(cè)下限雖然與ELISA法相當(dāng)，均能滿足CLSI的相關(guān)要求，但兩者的靈敏度均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于臨床診斷所需要的檢測(cè)靈敏度，能較好滿足臨床診斷的需要。另外通過干擾試驗(yàn)證實(shí)高濃度的膽紅素、血紅蛋白和三酰甘油對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大，應(yīng)在標(biāo)本準(zhǔn)備時(shí)引起重視，聚苯乙烯微球以及低濃度的膽紅素、血紅蛋白和三酰甘油對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾則相對(duì)較小。運(yùn)用FACSArray流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定了共計(jì)225例冠心病和75例對(duì)照組的P-selectin或t-PA的濃度值，兩者的濃度在各冠心病亞組(SAP、UAP和AMI組)中隨著病情加重情況逐漸增加，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。證明檢測(cè)血清P-selectin和t-PA的濃度變化對(duì)冠心病的診斷和分層具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

目前，常用的免疫學(xué)檢測(cè)方法主要有：(1)免疫金標(biāo)法，能快速定性或半定量，該法標(biāo)本用量少,但靈敏度低，易受主觀因素影響。(2)電化學(xué)發(fā)光法，靈敏度和精密度均較高，但費(fèi)用昂貴。(3)免疫比濁法，方便、快速、成本低，但誤差較大，影響因素多，不利于方法比對(duì)。(4)ELISA法，價(jià)格適中，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度尚可，在臨床上運(yùn)用廣泛，但是仍有一些缺點(diǎn)，如用ELISA法檢測(cè)患者P-selectin，通常會(huì)造成 “HOOK”效應(yīng)(“HD-HOOK”),血清中P-selectin的濃度如果不在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，會(huì)造成大量的假陰性結(jié)果。(5)微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù) (cytometric bead array，CBA)是基于包被抗體的微球并利用流式細(xì)胞儀同時(shí)對(duì)多種蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析的創(chuàng)新性技術(shù)。每種微球具有特定的熒光強(qiáng)度，可以在一個(gè)試管中混合同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。這些臨床常見的檢測(cè)方法均存在標(biāo)準(zhǔn)化的問題，探索一種精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度好、快速、價(jià)廉的方法是臨床急需解決的問題。

本研究采用流式細(xì)胞儀運(yùn)用CBA技術(shù)對(duì)患者樣本進(jìn)行檢測(cè)，相對(duì)于傳統(tǒng)的ELISA方法來說，該方法需要的樣本量小，檢測(cè)速度更快，試驗(yàn)時(shí)間比單次ELISA大大縮短，一次檢測(cè)就能提供需要做多次ELISA才能得到結(jié)果。研究者可自由組合檢測(cè)指標(biāo)；精密度、準(zhǔn)確度均優(yōu)于一般免疫學(xué)方法，靈敏度足夠滿足臨床需要，但是仍需注意高濃度的三酰甘油、血紅蛋白和膽紅素對(duì)檢測(cè)的影響，在樣本的預(yù)處理中需要引起重視。

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血清P-selectin、t-PA的濃度值，在對(duì)照組和冠心病各亞組(SAP、UAP和AMI組)中濃度值呈遞增趨勢(shì)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)冠心病的診斷和分層具有一定臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，F(xiàn)ACSArray流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)血清P-selectin、t-PA的分析性能符合規(guī)定的性能指標(biāo)，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的需要。比傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法具有更大優(yōu)勢(shì)，對(duì)冠心病患者血清P-selectin、t-PA的檢測(cè)對(duì)冠心病及其亞組的診斷分層、治療，危險(xiǎn)度評(píng)估都有著重要的作用。

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Methodology evaluation and clinical application of P-selectin and t-PA by flow cytometry*

ChenJie1,HuangShan1,ZuoLi2△

(1.DepartmentofInspectionCenter,TheAffiliatedPeople′sHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guizhou,Guiyang550002,China;2.BasicMedicalCollegeofGuizhouMedicalUniversity,Guizhou,Guiyang550001,China)

Objective P-selectin and t-PA were detected by FACSArray flow cytometry,and the correlation between different subgroups of coronary heart disease and coronary heart disease was observed.Methods The precision,accuracy,analytical sensitivity and interference test of P-selectin and t-PA were tested and evaluated by FACSArray flow cytometry.Detection of serum P-selectin and t-PA levels in patients with coronary heart disease and the correlation between serum levels of coronary heart disease and coronary heart disease.Results The intra and inter batch variation coefficients of P-selectin and t-PA were 4.23%-9%,4.63%-2.20% and 11%-2.90%,12.20%-6.30%,respectively;The relative bias of t-PA and P-selectin was 4.16%-5.28% and 1.23%-2.71%,respectively.Detection sensitivity is 16.20 ng/L and 1.21ng/mL.The interference rate of high concentration of triglycerides,hemoglobin and bilirubin on P-selectin was 14.65%,13.89% and 10.94%,respectively,The interference rate of high concentration of triglycerides,hemoglobin and bilirubin on t-PA was 15.65%,13.23% and 12.94%,respectively;The concentration range of P-selectin in each group of coronary heart disease was (54 020.1±3 390.1)ng/L-(83 189.8±7 226.3)ng/L,the concentration range of t-PA was (9.59±2.13)ng/mL-(28.72±2.15)ng/mL,compared with the control group (P<0.05).Conclusion The performance index of FACSArray flow cytometry can meet the needs of laboratory accreditation.

flow cytometry;method evaluation;coronary heart disease;P-selectin;tissue plasminogen activator

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.34.023

貴州省省長資金臨床應(yīng)用課題專項(xiàng)研究項(xiàng)目[黔省專合字(2012)117號(hào)];貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(gzwkj2012-1-129)；貴州省衛(wèi)生廳立項(xiàng)資助項(xiàng)目(gzwkj2012-1-062)。 作者簡介：陳潔(1980-)，主管檢驗(yàn)師，碩士,主要從事免疫學(xué)的研究?！?/p>

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1671-8348(2016)34-4826-04

2016-06-20

2016-08-08)