膀胱癌患者尿液中miR-126、miR-152的表達水平及臨床意義

王友寶　張梁　韓韜　徐向前　祝昌明　王磊　夏青建　郭小剛

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·實驗研究·

膀胱癌患者尿液中miR-126、miR-152的表達水平及臨床意義

王友寶張梁韓韜徐向前祝昌明王磊夏青建郭小剛

266000 青島市海慈醫(yī)療集團泌尿外科

【摘要】目的研究miR-126與miR-152在膀胱癌患者尿液中的表達，評估二者作為膀胱癌早期診斷標志物的價值。方法采用RT-PCR技術(shù)檢測52例膀胱癌患者和40例健康對照者尿液中miR-126、miR-152的表達，并通過受試者工作曲線(ROC)分析其診斷效能。結(jié)果miR-126在早期膀胱癌患者尿液中表達顯著升高(t=6.350，P<0.01)，且與膀胱癌的惡性程度有關(guān)；膀胱癌患者尿液中miR-152表達降低(t=3.996，P<0.05)，但與膀胱癌的臨床病理特征均無關(guān)(P>0.05)；miR-126聯(lián)合miR-152能夠很好地鑒別膀胱癌，敏感性和特異性分別為76.5%、83.6%。結(jié)論尿液中的miR-126能夠反映膀胱癌的惡性程度，miR-126聯(lián)合miR-152對膀胱癌的早期診斷具有潛在的價值。

【關(guān)鍵詞】膀胱腫瘤；尿液；MicroRNAs；腫瘤標志物

膀胱癌是我國最常見的泌尿系惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率較高，早期診斷對膀胱癌的篩查、治療至關(guān)重要[1]。膀胱鏡檢查和尿脫落細胞學(xué)檢查是目前最常用的檢查手段，前者為有創(chuàng)檢測，患者不易接受[2]。后者雖為一種無創(chuàng)傷性手段，但是敏感性僅有35%[3]。 MicroRNAs(miRNAs)是一種包含19～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA[4]，近年研究發(fā)現(xiàn)，部分miRNAs能在膀胱癌患者尿液中穩(wěn)定表達，對尿液中某些差異表達的miRNAs加以研究或為臨床提供一種新型的無創(chuàng)診斷標志物[5]。本研究通過RT-PCR技術(shù)檢測膀胱癌患者尿液中 miR-126、miR-152的表達變化，并通過受試者工作曲線(ROC)分析二者診斷的敏感性和特異性，探討二者作為一種新型腫瘤標志物的診斷價值。

材料與方法

一、實驗對象

2013年11月至2015年8月在我院泌尿外科收治入院的52例初發(fā)膀胱腫瘤患者，其中男36例，女16例，年齡37～84歲，平均64歲。參照WHO 1973病理分級系統(tǒng)和UICC臨床分期系統(tǒng)，其中高級別20例，低級別32例；非肌層浸潤性38例，肌層浸潤性14例。納入標準：①尿液收集前2周無泌尿系侵入性檢查史；②既往無手術(shù)、放療或化療史；③未合并泌尿系感染、結(jié)石及其他部位腫瘤；④患者或家屬簽署知情同意書，并遵照醫(yī)囑正確留取尿液。所入選疑似膀胱腫瘤患者均經(jīng)病理證實為膀胱尿路上皮癌。同期體檢的40例健康志愿者作為對照組，其中男26例，女14例，年齡35～75歲，平均62歲。對照組各項檢查結(jié)果正常，組間性別、年齡均無統(tǒng)計學(xué)差異。

二、主要試劑和儀器

Trizol試劑購于Invitrogen公司，Real-Time PCR Kit(LK-0101A)、總RNA提取試劑盒均購自上海Novland公司。所用儀器主要包括Stratagene公司生產(chǎn)的MX3000P型實時熒光定量PCR儀、日立產(chǎn)U2000紫外可見分光光度計、 Eppendorf 公司生產(chǎn)的EP5417R型臺式低溫高速離心機。

三、方法

1.尿液的收集及總RNA的提?。菏占軝z者中后段晨尿100 ml，并在2 h內(nèi)于4 ℃下、3 000 g離心15 min去除尿液沉渣，然后將上清再次以12 000 g 離心10 min，用去RNA酶處理過的 EP管收集上清1.5 ml，做好標記立即放在液氮中速凍并置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩栏駞⒄誌nvitrogen公司Trizol說明書提取凍存尿液上清中的總RNA，并使用紫外線分光光度計測定230、260和280 nm的吸收值，計算RNA的純度和濃度，以篩選達標樣本做后續(xù)實驗。

2.引物的設(shè)計與合成：引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，由Novland公司合成，具體序列參照表1。

表1　用于實時定量PCR的引物

3.RT-PCR：以2 μl的總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用miR-126、miR-152的特異性引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，于PCR擴增儀26 ℃孵育30 min、42 ℃ 孵育30 min、85 ℃孵育10 min，結(jié)束后立即將cDNA產(chǎn)物置于冰塊上防止降解。實時熒光定量PCR的反應(yīng)過程如下：變性95 ℃，3 min；退火95 ℃，12 s; 延伸60 ℃，40 s，擴增40個循環(huán)后對結(jié)果進行分析，以U6RNA作為內(nèi)參基因，測定循環(huán)閾值(CT)，采用2-△△CT的方法計算miR-126、miR-152的相對表達強度(RQ)，其中 ΔΔCT=膀胱癌組(CT目的miRNA-CTU6) -健康對照組(CT目的miRNA-CTU6)。每個樣本每個基因3個重復(fù)，精密度滿足進一步分析要求。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果

一、尿液中miR-126、miR-152的表達水平

健康對照組中miR-126、miR-152的表達水平分別為2-△△CT=2.16±1.33、2-△△CT=1.03±0.22。與健康對照組相比，膀胱癌患者尿液中的miR-126表達顯著升高(2-△△CT=9.49±5.51，t=6.350，P<0.01)，且尿液中miR-126的表達與膀胱癌的惡性程度有關(guān)(P<0.05)，惡性程度越低miR-126的表達升高越顯著；而尿液中miR-152表達相對降低(2-△△CT=0.89±1.29，t=3.996，P<0.05)，但與膀胱癌的臨床病理特征均無關(guān)(P>0.05)，詳見表2。本實驗中膀胱癌患者尿液中miR-126/miR-152比值遠高于正常對照組(t=7.602，P<0.01)，但其比值在不同腫瘤分期、分級間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2　膀胱癌患者尿液中miR-126、miR-152的表達水平與臨床病理特征的相關(guān)性±s)

二、尿液中miR-126、miR-152的臨床診斷價值及效能

鑒于miR-152普遍低表達，所以結(jié)合高表達的miR-126應(yīng)該有更好的診斷價值，圖1為ROC分析miR-126及其與miR-152比值對膀胱腫瘤的診斷價值曲線，當(dāng)最佳切點定在15.11時，miR-126/miR-152比值診斷膀胱癌的特異性和敏感性分別為83.6%、76.5%，診斷效能均比單獨采用miR-126要好，詳細數(shù)據(jù)見表3。

表3　尿液中miR-126、miR-152對膀胱腫瘤診斷價值的ROC曲線分析

圖1　尿液中兩種miRNA對膀胱腫瘤診斷的ROC曲線

討論

膀胱癌作為一種高度異質(zhì)性的疾病，一旦發(fā)生侵襲或轉(zhuǎn)移預(yù)后極差[6]，因此亟需一種新型的腫瘤標志物提高早期診斷率。膀胱鏡檢查是目前術(shù)前診斷和術(shù)后隨訪的“金標準”，雖然在檢查過程中能夠很好的直觀病灶以及取樣活檢，但是患者往往很抵觸這種昂貴且痛苦的侵入性檢查，另外一些平坦型病變或原位癌也是膀胱鏡檢查的盲區(qū)[2]；尿脫落細胞學(xué)檢查是一種無創(chuàng)傷性手段，但敏感性太低，且泌尿系的結(jié)石、感染、取尿和檢測技術(shù)差異也常會影響尿細胞學(xué)檢查結(jié)果[3]。近年來膀胱癌患者尿液腫瘤標志物的研究受到很大的關(guān)注， FDP、BTAstat、 ImmunoCyt、BTAtrak、NMP22和尿熒光原位雜交技術(shù)(FISH)已經(jīng)被美國FDA批準并用于膀胱癌的檢測，另外一些潛在的標志物如存活素、端粒酶、CYFRA21-1等也在膀胱癌的臨床研究中顯示出了較高的特異性和敏感性，但由于炎癥、結(jié)石、放療史等干擾因素使得這些腫瘤標志物的特異性仍然普遍低于尿細胞學(xué)檢查[7-9]。因此，至今仍然沒有一種理想的非侵入性檢查手段應(yīng)用于膀胱癌的術(shù)前診斷與術(shù)后隨訪。

理想的生物學(xué)標志物應(yīng)該具有高靈敏度和特異性、取材與檢查方便快捷、成本低廉，miRNAs在多種泌尿系腫瘤中的表達改變和生物學(xué)功能受到極大關(guān)注。一些miRNAs的表達水平確實在腫瘤組織和正常組織中存在差異[10]，而尿液中存在的miRNAs和尿路上皮腫瘤也有著千絲萬縷的聯(lián)系，由于尿液與腫瘤組織的直接接觸，腫瘤細胞及其釋放的相關(guān)miRNAs會在尿液中有著不同程度的表達[11]，因此選取尿液中某些異常表達的miRNA加以研究有可能成為早期診斷和治療膀胱腫瘤的突破點[12]。

尿液是泌尿系疾病診斷中最理想的檢測載體，取樣無創(chuàng)性，患者容易接受。尿液中的miRNAs能夠很好的耐受pH值和高活性的RNase，在室溫下放置24 h內(nèi)不易降解，這使得尿液中穩(wěn)定存在的miRNAs更利于臨床檢測[13]。由于尿液中的miRNAs主要來自脫落的上皮細胞以及由尿路上皮細胞主動釋放的以微囊泡、外泌體等形式包裹的miRNAs，使得尿液中miRNAs具有極高的特異性[14]。 miR-126和miR-152 是腫瘤研究的熱點因子，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-152 在膀胱腫瘤組織中的表達水平相比健康組織明顯下調(diào)[15]，同樣膀胱癌患者尿液中的miR-152 水平也要普遍低于健康對照組[16]；此外， miR-126在膀胱癌患者尿液中的表達水平也明顯高于健康對照組[17]，本實驗我們也證實了miR-126在膀胱癌患者尿液中高表達，并發(fā)現(xiàn)miR-126與腫瘤的臨床分期和病理級別密切相關(guān)，能很好的評估膀胱癌的惡性程度。經(jīng)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)miR-126/miR-152的比值診斷膀胱癌的特異性和敏感性分別為83.6%、76.5%，這種診斷效能也已經(jīng)相當(dāng)高，提示二者結(jié)合具有很好的診斷潛力，對患者治療方案的選擇和預(yù)后評估都會有一定的意義。

然而本實驗仍然存在一些不足之處，本次納入樣本量偏少，目前內(nèi)參基因的選擇也存在爭議，另外市場上也缺乏專門針對尿液中miRNAs的檢測試劑等。盡管這些研究數(shù)據(jù)需要經(jīng)受長期的臨床試驗，但不失為當(dāng)今臨床診斷開辟一條新的思路，隨著新技術(shù)的出現(xiàn)，一種精確可行的非侵入型腫瘤標志物會有更好的應(yīng)用前景。

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(本文編輯：熊鈺芬)

基金項目：山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2014WS0226)

通信作者：王友寶，E-mail:734182987@qq.com

doi:10.3870/j.issn.1674-4624.2016.02.010

Corresponding author:WANG You-bao,E-mail:734182987@qq.com

(收稿日期：2016-01-04)

The expression of urine miR-126, miR-152 in bladder cancer and its clinical value

WANGYou-bao,ZHANGLiang,HANTao,XUXiang-Qian,ZHUChang-ming,WANGLei,XIAQing-jian,GUOXiao-gang.

DepartmentofUrology,QingdaoHiserHospital,Qingdao266000,China

【Abstract】ObjectiveTo explore urine miR-126, miR-152 expression in bladder cancer and evaluate its clinical value as early diagnosis markers.MethodsUrine miR-126, miR-152 of 40 cases of healthy controls and 52 patients with bladder cancer were assayed by RT-PCR, and its diagnostic value was evaluated by the ROC curve.ResultsThe expression of urine miR-126 in bladder cancer patients was significantly raised (t=6.350, P<0.01), it significantly correlated with malignant degree. But the expression of urine miR-152 was downregulated (t=3.996, P<0.05), while not related to clinicopathological features (P>0.05), miR-126 combine with miR-152 identifying bladder cancer was commendable, the sensitivity and specificity was 76.5%, 83.6% respectively.ConclusionsUrine miR-126 can response to the malignant degree of bladder cancer, miR-126 combined with miR-152 has potential value to the early diagnosis of bladder cancer.

【Key words】Urinary bladder neoplasms;Urine;MicroRNAs;Tumor markers