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    用于腫瘤標(biāo)志物現(xiàn)場快速檢測的便攜式儀表的研制

    2016-12-08 01:12:22樊艷王楊劉軍濤羅金平徐輝任徐聲
    分析化學(xué) 2016年7期
    關(guān)鍵詞:便攜式腫瘤標(biāo)志物

    樊艷+王楊+劉軍濤+羅金平+徐輝任+徐聲偉+蔡新霞

    摘 要 針對腫瘤標(biāo)志物高靈敏度現(xiàn)場快速檢測的需求,將電化學(xué)檢測技術(shù)與電子技術(shù)相結(jié)合,采用差分脈沖伏安法(Differential pulse voltammetry, DPV)研制了一種可用于腫瘤標(biāo)志物現(xiàn)場快速檢測的便攜式儀表,檢測電壓和電流的分辨率分別為0.8 mV和1 nA。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室自制微流控紙芯片,利用該便攜式儀表對腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原 (Carcinoembryonic antigen,CEA)進(jìn)行檢測,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在1~500 μg/L濃度范圍內(nèi),DPV峰值電流響應(yīng)與CEA抗原濃度對數(shù)呈線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)為0.998,檢出限為10 pg/mL。根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合和電化學(xué)檢測原理,檢測到電化學(xué)反應(yīng)的微弱電流后,儀表可以根據(jù)已經(jīng)標(biāo)定的電流與濃度之間的比例關(guān)系自動計(jì)算出腫瘤標(biāo)志物的濃度。此便攜式儀表具有檢測靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點(diǎn),可廣泛應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的即時(shí)檢測。

    關(guān)鍵詞 腫瘤標(biāo)志物; 電化學(xué)檢測; 差分脈沖伏安法; 便攜式; 即時(shí)檢測

    20160129收稿;20160301接受

    本文系國家自然基金項(xiàng)目(Nos.61527815, 61471342, 31500800, 61501426),國家重大科學(xué)研究計(jì)劃(No.2014CB744600),北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目(Nos.Z141100003414015,Z141100000214002),中科院重點(diǎn)部署項(xiàng)目(No.KJZDEWL112)資助

    Email: xxcai@ mail.ie.ac.cn

    1 引 言

    肺癌是常見的惡性腫瘤之一,其死亡率和發(fā)病率居惡性腫瘤第一位,嚴(yán)重危害人體健康。肺癌早期一般無任何臨床癥狀,一旦確診,即已屬于中晚期,且極易擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。大量臨床研究表明,肺癌的預(yù)后與臨床分期密切相關(guān),早期肺癌患者的5年生存率可達(dá)70%以上,而晚期肺癌患者的5年生存率極低[1,2],所以及早發(fā)現(xiàn)、診斷和治療肺癌有著很大的臨床意義。

    腫瘤標(biāo)志物的臨床檢測有酶聯(lián)免疫分析法[3]、放射性免疫分析法[4]、電化學(xué)發(fā)光免疫分析法[5]、化學(xué)發(fā)光免疫分析法[6]和熒光免疫分析法[7],這些方法檢測血清用量大、分析時(shí)間長、費(fèi)用高、操作繁瑣,不適于現(xiàn)場快速檢測。近年,隨著生物芯片技術(shù)的發(fā)展,電化學(xué)檢測方法與免疫技術(shù)相結(jié)合的電化學(xué)免疫分析法備受研究者關(guān)注[8~11],該方法檢測血清用量少、分析時(shí)間短、成本低、準(zhǔn)確性和精確度高、操作簡便、重復(fù)性好,非常適用于現(xiàn)場快速檢測。目前,實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行電化學(xué)免疫檢測主要采用大型的電化學(xué)工作站,此類型儀器檢測精度高, 但成本昂貴,儀器體積大,不便于攜帶,因此研制用于腫瘤標(biāo)志物現(xiàn)場快速檢測便攜式儀表具有很大的實(shí)用價(jià)值。

    基于上述研究背景,本實(shí)驗(yàn)研制了一款用于腫瘤標(biāo)志物快速檢測的便攜式儀表。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室自制微流控紙芯片,對腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原 (Carcinoembryonic antigen,CEA)進(jìn)行檢測。結(jié)果表明, 此便攜式儀表能快速定量檢測腫瘤標(biāo)志物,檢測靈敏度高。

    2 系統(tǒng)設(shè)計(jì)

    本便攜式儀表系統(tǒng)設(shè)計(jì)包括電化學(xué)檢測模塊、STM32中央控制模塊、存儲顯示模塊和UART通信模塊。系統(tǒng)設(shè)計(jì)框圖如圖1所示。

    2.1 電化學(xué)檢測模塊

    電化學(xué)檢測的對象是腫瘤標(biāo)志物濃度(μg/L),根據(jù)不同濃度抗原與抗體特異性結(jié)合會引起電活性物質(zhì)的電化學(xué)電流響應(yīng)變化的原理進(jìn)行檢測[9],該電流響應(yīng)非常微弱(nA~μA級),因此必須將微弱的電流信號轉(zhuǎn)化為易測量的電壓信號才能檢測出來。電化學(xué)檢測模塊包括差分脈沖伏安法(Differential pulse voltammetry, DPV)工作波形產(chǎn)生電路和電流電壓轉(zhuǎn)換電路。DPV工作波形產(chǎn)生電路根據(jù)恒電位儀原理設(shè)計(jì),是利用運(yùn)算放大器的“虛短”、“虛斷”特性設(shè)計(jì)成電壓跟隨器為電化學(xué)檢測參比電極提供一個僅受程序控制而不受電化學(xué)電流影響的工作電位[12,13];電流電壓轉(zhuǎn)換電路采用T型反饋網(wǎng)絡(luò)電路[14],將測得的電流信號轉(zhuǎn)換為易測得的電壓信號,送入ADC模塊進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)計(jì)算。

    2.2 STM32中央控制模塊

    中央控制模塊采用基于ARM CortexM3內(nèi)核的32位微處理器STM32F103RCT6芯片,該芯片內(nèi)部含有3個18通道的12位模數(shù)轉(zhuǎn)換器(Analogtodigital converter, ADC)和1個12位數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Digtialtoanalog converter, DAC), 電壓最小分辨率為0.8 mV,電流最小分辨率為1 nA,可滿足腫瘤標(biāo)志物濃度電化學(xué)檢測精度的需求。

    2.3 存儲顯示模塊

    存儲模塊采用串行CMOS EEPROM芯片AT24C02,存儲容量為2 kb,內(nèi)部含有256個8位字節(jié),用來存儲腫瘤標(biāo)志物濃度檢測結(jié)果;顯示模塊采用2.4英寸OLED顯示液晶屏,反應(yīng)速度約為10 μs,具有低耗電流,超廣視角,自發(fā)光等特點(diǎn),用來顯示檢測結(jié)果。

    2.4 UART通信模塊

    UART模塊可將腫瘤標(biāo)志物濃度檢測結(jié)果通過USB傳輸至PC端進(jìn)行保存,以便用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析與處理。

    2.5 儀表工作流程

    儀表工作流程為:STM32中央控制模塊產(chǎn)生DPV檢測電壓,通過STM32F103RCT6芯片內(nèi)部DAC將數(shù)字信號DPV檢測電壓轉(zhuǎn)換為模擬信號送入DPV工作波形產(chǎn)生電路;DPV工作波形產(chǎn)生電路將檢測電壓施加到微流控紙芯片各個電極端,在電壓作用下微流控紙芯片上產(chǎn)生微弱電化學(xué)電流信號;該微弱電流通過電流電壓轉(zhuǎn)換電路轉(zhuǎn)換為電壓信號;轉(zhuǎn)換得到的電壓信號送入STM32中央控制模塊,通過STM32F103RCT6芯片內(nèi)部ADC轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號;腫瘤標(biāo)志物濃度與檢測到的電化學(xué)電流信號成比例關(guān)系,儀表可以根據(jù)已經(jīng)標(biāo)定的電流與濃度之間的校正方程自動計(jì)算出腫瘤標(biāo)志物的濃度;檢測結(jié)果實(shí)時(shí)顯示在OLED液晶顯示屏上并自動存儲到AT24C02芯片中,檢測結(jié)果可由UART端口傳送到PC機(jī)端保存。

    本便攜式儀表整機(jī)尺寸為11 cm×7 cm×2.5 cm(長×寬×高),重量約122 g,儀表外觀如圖2所示。

    3 實(shí)驗(yàn)部分

    3.1 儀器與試劑

    電化學(xué)工作站(Autolab PGSTAT302N, 瑞士萬通公司),萬用表(Agilent 34461A,美國安捷倫科技公司),磷酸鹽緩沖液(PBS, 0.1 mol/L, pH 7.4,Sigma公司)。K3[Fe(CN)6](上海生工生物工程有限公司),CEA抗原和抗體(北京科躍中楷生物技術(shù)有限公司),實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

    3.2 微流控紙芯片

    微流控紙芯片(實(shí)驗(yàn)室自制),采用噴蠟打印工藝在紙基(Whatman No.1層析紙)上制作出相應(yīng)的親水溝道和疏水溝道,通過絲網(wǎng)印刷工藝在層析紙表面印刷得到三電極體系,工作電極和對電極采用導(dǎo)電碳漿,參比電極采用Ag/AgCl漿;工作電極的表面修飾氨基化石墨烯/硫堇/納米金混合物用以固定抗體,其中硫堇為電活性物質(zhì),電化學(xué)檢測測得電流響應(yīng)即為硫堇與電極表面相互作用產(chǎn)生的電流變化[10,15];通過電流與濃度之間的比例關(guān)系,可以對應(yīng)計(jì)算出腫瘤標(biāo)志物濃度。

    3.3 DPV檢測原理

    DPV檢測工作波形可看作是線性增加的電壓與恒定振幅的矩形脈沖的疊加,脈沖高度ΔE為固定值,典型值為50 mV;脈沖周期一般為500~2000 ms; 脈沖寬度一般取40~80 ms[16]。在一個周期內(nèi)測量兩次電流值: 在脈沖前20 ms和脈沖期后20 ms分別測量電流,將兩次測量電流相減得到差值電流Δi作為該時(shí)刻電流值,連續(xù)測得多個周期的電流Δi,作出Δi與電勢E之間的關(guān)系圖, 即差分脈沖曲線。其中Δi滿足:

    在脈沖施加前20 ms,只有雙層充電電流ic,在脈沖期后20 ms,所測電流為電解電流和電容電流之和,兩次電流相減得到Δi,減小了電容電流的干擾,并且雜質(zhì)的氧化還原電流導(dǎo)致的背景電流也被大大扣除[16],因而檢測靈敏度和準(zhǔn)確性比常規(guī)的計(jì)時(shí)電流法和循環(huán)伏安掃描法更高。本便攜式儀表采用DPV檢測方法, 大大提高了電化學(xué)檢測的靈敏度。

    3.4 儀表基本性能測試實(shí)驗(yàn)方法

    便攜式儀表硬件部分主要包括電化學(xué)檢測電路、STM32微控制器、OLED液晶顯示屏、AT24C02存儲器以及電源供電電路。儀表基本性能測試主要驗(yàn)證儀表的精確性、靈敏度和基本電化學(xué)性能。

    3.4.1 儀表檢測誤差分析方法 通過對三電極體系的分析,一個電化學(xué)傳感器可等效為圖3a所示電阻網(wǎng)絡(luò)模型。其中,R1和R2分別為參比電極、對電極和工作電極之間待測溶液的等效電阻,Rzy是電極間電荷轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的感應(yīng)電阻,C1是工作電極與周圍電解質(zhì)在接觸面上由于離子吸附形成的雙層電容[16,17]。在直流信號下,Rzy和R1很小,可忽略,C1不起作用,圖3a電路簡化為圖3b所示電路。

    3.5 腫瘤標(biāo)志物CEA電化學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)方法

    微流控紙芯片通過插槽的方式與便攜式儀表相連,實(shí)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物濃度的檢測。利用便攜式儀表驅(qū)動微流控紙芯片對不同濃度的腫瘤標(biāo)志物濃度CEA抗原標(biāo)準(zhǔn)血清樣品進(jìn)行檢測,以獲得儀表對CEA抗原標(biāo)準(zhǔn)血清樣品溶液的線性范圍和檢出限。

    實(shí)驗(yàn)方法:首先滴加10 μL任一濃度的CEA抗原到修飾上抗體和氨基化石墨烯/硫堇/納米金混合物微流控紙芯片工作區(qū)中,室溫靜置10 min(抗原抗體孵育時(shí)間);在工作區(qū)滴加20 μL PBS溶液,靜置3 min,等待溶液完全滲透整個工作區(qū),使三電極體系檢測在同一個溶液體系中進(jìn)行;通過運(yùn)算放大器在工作電極和參比電極之間施加從 0.5~0.3 V范圍電壓,利用便攜式儀表在電化學(xué)檢測模塊輸入端加入DPV檢測波形,測量CEA抗原濃度在1~500 μg/L范圍內(nèi)的DPV檢測響應(yīng)電流值,實(shí)驗(yàn)溫度為25℃。

    采用上述方法檢測臨床血清樣本并進(jìn)行誤差分析,驗(yàn)證儀表的臨床應(yīng)用能力。

    4 結(jié)果與討論

    4.1 儀表基本性能測試實(shí)驗(yàn)

    儀表基本性能測試實(shí)驗(yàn)主要針對儀表電壓電流誤差測量值與計(jì)算值之間誤差分析和對K3[Fe(CN)6]溶液電化學(xué)測試來驗(yàn)證儀表的精確性、靈敏度和基本電化學(xué)性能。

    4.1.1 儀表檢測誤差分析 由于儀表最終檢測物質(zhì)為腫瘤標(biāo)志物CEA,而用于腫瘤標(biāo)志物CEA濃度檢測的電活性物質(zhì)硫堇的DPV峰值電位根據(jù)聚合底液pH值不同在 0.5~0.5 V,在進(jìn)行儀表基本性能測試時(shí),電壓范圍也選取在此范圍內(nèi);等效電阻R2選取1,10,43,91 和150 kΩ進(jìn)行測量。在儀表設(shè)計(jì)時(shí),為了擴(kuò)大檢測范圍能夠使其在正負(fù)工作電壓范圍內(nèi)同時(shí)檢測,選用LM40411.225 V基準(zhǔn)電壓源加在運(yùn)放TLC2264正極,根據(jù)運(yùn)放“虛短”原理,將工作電極電位固定在1.225 V,前級運(yùn)放輸入DAC電壓值分為加入1.7136, 1.5146, 1.3156, 1.1167和0.9177 V, 用6位半萬用表Agilent 34461A并聯(lián)到R2兩端,測量其兩端電壓,得到誤差為1 mV,證明儀表的電壓精度誤差小,能準(zhǔn)確進(jìn)行測量。

    輸入電壓設(shè)定為0.5 V,將6位半萬用表Agilent 34461A調(diào)節(jié)至電流檔串聯(lián)接入電路中,調(diào)整電阻R2阻值,實(shí)際測量得到的3次電流平均值與計(jì)算得到的電流值之間的誤差關(guān)系如表1所示,電流誤差較小,此儀表具有較高的準(zhǔn)確度。

    4.1.2 便攜式儀表基本電化學(xué)性能測試 利用便攜式儀表和電化學(xué)工作站分別對50 mmol/LK3[Fe(CN)6]溶液進(jìn)行3次DPV檢測,電流響應(yīng)如圖4所示(實(shí)線為電化學(xué)工作站Autolab檢測結(jié)果,虛線為便攜式儀表檢測結(jié)果)。便攜式儀表與電化學(xué)工作站Autolab測試結(jié)果相比,峰電位相同為0.160 V,峰值電流響應(yīng)平均值分別為96.836和97.230 μΑ,差值為0.394 μA,相對偏差為0.4%;電化學(xué)工作站Autolab 3次檢測偏差為0.5%,便攜式儀表與電化學(xué)工作站Autolab之間檢測偏差在電化學(xué)工作站自身偏差范圍內(nèi),表明儀表檢測精度與現(xiàn)有商品化電化學(xué)工作站檢測精度相當(dāng),具有較高的檢測精度。

    利用便攜式儀表對不同濃度K3[Fe(CN)6]溶液進(jìn)行檢測,DPV電流響應(yīng)如圖5所示。在1~50 mmol/L濃度范圍內(nèi),檢測電流隨著K3[Fe(CN)6]濃度升高而升高,線性校正方程為Y=1.917X-2.344, 相關(guān)系數(shù)為0.996,表明儀表能夠?qū)崿F(xiàn)不同濃度K3[Fe(CN)6]溶液電流響應(yīng)的檢測,DPV電流響應(yīng)峰值電流與K3[Fe(CN)6]溶液濃度之間呈良好的線性關(guān)系。

    綜上可知,此儀表具有良好的電化學(xué)檢測能力,檢測靈敏度較高,與電化學(xué)工作站相比,檢測精度相當(dāng),可用于腫瘤標(biāo)志物CEA的檢測。

    4.2 腫瘤標(biāo)志物CEA電化學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)

    利用便攜式儀表對濃度為1 μg/L的CEA抗原標(biāo)準(zhǔn)血清樣品進(jìn)行4次測量,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation, RSD)為3.2%,表明便攜式儀表具有較好的檢測精度。利用便攜式儀表檢測不同濃度CEA抗原標(biāo)準(zhǔn)血清樣品的DPV電流響應(yīng)曲線如圖6所示。結(jié)果表明,隨著CEA抗原濃度增加,檢測到的DPV電流響應(yīng)信號逐漸降低,DPV電流響應(yīng)值與CEA抗原濃度對數(shù)呈線性關(guān)系,CEA抗原濃度在1~500 μg/L范圍內(nèi),線性校正方程為Y=2.903-0.630X, 相關(guān)系數(shù)為0.998,檢出限為10 pg/mL,表明本儀表檢測靈敏度較高。

    4.3 臨床血清樣本測試

    由于臨床血清樣本中的干擾物質(zhì)較多,影響抗原和抗體的特異性結(jié)合,因此與抗原標(biāo)準(zhǔn)血清樣品相比,檢測得到的線性校正方程會有區(qū)別,檢測靈敏度也會有所下降。利用便攜式儀表對7例臨床血清樣本(北京腫瘤醫(yī)院提供)進(jìn)行檢測,在1~85 μg/L范圍內(nèi)得到線性校正方程為Y=-0.009X+3.652, 相關(guān)系數(shù)為0.945。利用便攜式儀表對3例臨床血清樣本3次檢測平均值與醫(yī)院提供的羅氏Cobas E602全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測值進(jìn)行對比如表2所示。結(jié)果表明,此便攜式儀表檢測結(jié)果與電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測結(jié)果具有良好的相關(guān)性,表明儀表具有較好的臨床應(yīng)用能力。

    5 結(jié) 論

    實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一款用于腫瘤標(biāo)志物CEA現(xiàn)場快速檢測的便攜式儀表,通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)驗(yàn)證了儀表的性能,檢測電壓和電流的分辨率分別為0.8 mV和1 nA。利用此儀表對不同濃度腫瘤標(biāo)志物CEA進(jìn)行檢測,在1~500 μg/L濃度范圍內(nèi)電流響應(yīng)的線性相關(guān)度為0.998,檢出限為10 pg/mL。此便攜式儀表能快速定量檢測腫瘤標(biāo)志物,檢測靈敏度高,測量偏差小,檢出限低,可用于腫瘤標(biāo)志物的即時(shí)檢測。

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    Abstract By combining electrochemical detection technique and electronic technique, a portable device which adopted differential pulse voltammetry (DPV) measurement was developed to meet the needs of high sensitivity and onsite rapid detection for tumor marker. The voltage and current resolution of portable device were 0.8 mV and 1 nA, respectively. Combined with laboratory made paperbased analytical device, carcinoembryonic antigen(CEA) was tested by portable device. Experimental results revealed that the DPV peak currents showed good linear relation with the logarithm of CEA concentration in the range from 1 μg/L to 500 μg/L. Its corresponding correlation coefficient was 0.998 and the limit of detection was 10 pg/mL. According to the principle of specific binding of antibody and antigen and electrochemical detection, CEA concentration could be calculated automatically according to the linear equation. The portable device had high sensitivity and low detection limit features which could be widely used in the pointofcare testing of tumor marker.

    Keywords Carcinoembryonic antigen; Electrochemical detection; Differential pulse voltammetry; Portable; Pointofcare testing

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