谷跗線螨精氨酸激酶基因的克隆及序列分析

趙學(xué)影，楊小迪，鄔玉蘭，劉志剛，孫　新

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谷跗線螨精氨酸激酶基因的克隆及序列分析

趙學(xué)影1，楊小迪1，鄔玉蘭2，劉志剛2，孫新1

1．蚌埠醫(yī)學(xué)院，蚌埠233030；;2．深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院，深圳518060

摘要：目的揭示谷跗線螨Tarsonemus granarius體內(nèi)存在泛變應(yīng)原精氨酸激酶(arginine kinase，AK)。方法從空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中采集谷跗線螨(約6 000只)并提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，PCR克隆谷跗線螨AK片段，采用生物信息學(xué)軟件分析克隆基因的編碼蛋白特性。結(jié)果測(cè)序和序列分析結(jié)果表明，谷跗線螨AK基因的開(kāi)放閱讀框由724個(gè)堿基組成，其編碼的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為26 019，等電點(diǎn)為10.10。結(jié)論成功克隆了谷跗線螨AK基因，為進(jìn)一步谷跗線螨AK蛋白的重組表達(dá)以及過(guò)敏原性分析奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：谷跗線螨；精氨酸激酶；基因克?。恍蛄蟹治?/p>

塵螨過(guò)敏性哮喘等變態(tài)反應(yīng)性疾病是臨床上的常見(jiàn)病、多發(fā)病[1]。實(shí)驗(yàn)表明，利用粉塵螨過(guò)敏病人的血清IgE為探針做免疫組化染色，可誘發(fā)人體IgE抗體的變應(yīng)原，主要分布于螨消化道、腺體及體壁等部位[2]。

精氨酸激酶(AK)廣泛存在于無(wú)脊椎動(dòng)物如昆蟲(chóng)、甲殼動(dòng)物和軟體動(dòng)物體內(nèi)，是無(wú)脊椎動(dòng)物能量代謝最重要的酶類(lèi)之一，為其生命活動(dòng)提供能量，并維持體內(nèi)ATP的平衡[3-4]。另外，AK在昆蟲(chóng)免疫反應(yīng)方面也發(fā)揮著重要作用[5-9]，而對(duì)于谷附線螨過(guò)敏原蛋白與基因克隆方面的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，特以谷跗線螨為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行研究，

1材料與方法

1.1試螨與試劑

1.1.1供試螨類(lèi)活螨系從深圳大學(xué)學(xué)生宿舍分體掛壁式空調(diào)出風(fēng)口濾網(wǎng)灰內(nèi)采樣，將空調(diào)濾網(wǎng)取下，用刷子將濾網(wǎng)中的灰塵輕輕地刷至托盤(pán)中，在連續(xù)變倍體視顯微鏡下從灰塵中挑取并分離后經(jīng)形態(tài)鑒定為谷跗線螨，用無(wú)菌水充分洗滌蟲(chóng)體，濾紙吸干水分，液氮中凍存，備用。

1.1.2實(shí)驗(yàn)菌種與載體大腸桿菌E.coliTop10由深圳大學(xué)過(guò)敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所保存；pMD18-T 載體為T(mén)akara公司產(chǎn)品。

1.1.3主要的試劑和試劑盒RNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；AMV First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Fermentas公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒[plasmid mini kitⅠ(100)]、瓊脂糖凝膠回收試劑盒[gel extractionkit(50)]和DNA膠純化試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；Ex-Taq酶、T4連接酶以及DNA Marker(DL2000)均購(gòu)自Takara公司。

1.2簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)從SWISS-PROT 和TrEMBL(www.expasy.org)以及NCBI( www.ncbi.nlm.nih.gov)的GenBank 等數(shù)據(jù)庫(kù)下載接近物種的AK基因的mRNA序列，利用分析軟件進(jìn)行對(duì)比，選取同源性高的保守區(qū)域，根據(jù)這些區(qū)域設(shè)計(jì)并合成簡(jiǎn)并引物。上游引物：AK-F: 5′ATGGTBGAYSCHGC 3′，下游引物：AK-R: 5′TTACAKBGABTTYTCMATCTT 3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3總RNA的提取和精氨酸激酶基因的RT-PCR擴(kuò)增將采集的谷跗線螨約6000只，放在液氮中用研磨棒充分研磨后，轉(zhuǎn)入RNase Free離心管中，依照Qiagen公司RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，按步驟提取谷跗線螨總RNA。按照Fermentas公司的AMV First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA第一鏈產(chǎn)物中取2 μL為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，克隆精氨酸激酶基因。反應(yīng)體系為50 μL：10×buffer 5 μL，10 ×dNTP 4 μL，ddH2O 39.75 μL，引物AK-F為0.5 μL，引物AK-R為2 μL，0.25 μL Ex-Tag 酶。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min 后用Touchdown方式進(jìn)行擴(kuò)增，第一個(gè)循環(huán)為94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，此后每個(gè)循環(huán)的退火溫度下降1 ℃，當(dāng)退火溫度下降到50 ℃ 時(shí)，則以94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s運(yùn)行30個(gè)循環(huán)，再于72 ℃延伸10 min結(jié)束。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離檢測(cè)，并切膠回收。

1.4RT-PCR產(chǎn)物克隆和測(cè)序回收純化的RT-PCR 產(chǎn)物與pMD18-T simple Vector進(jìn)行連接，用氯化鈣法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliTop10克隆菌中。用含氨芐青霉素(Amp)的LB平板進(jìn)行抗氨芐篩選，挑取陽(yáng)性菌落(含重組質(zhì)粒)進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行過(guò)夜搖菌并提取其質(zhì)粒，將陽(yáng)性菌落進(jìn)行序列測(cè)定(由上海生工完成)。

1.5序列分析將測(cè)序所得序列通過(guò)GenBank進(jìn)行序列比對(duì)，并對(duì)該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量利用在線程序Compute pI/Mw too(http:/ /www.expasy.org/ tools/pi_tool.html)進(jìn)行評(píng)估。利用在線程序CLUSTAL W(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)將所得克隆進(jìn)行序列分析。

2結(jié)果

2.1AK基因的PCR擴(kuò)增以提取的谷跗線螨總RNA為模板，采用AMV First Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以谷跗線螨的cDNA為模板，用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(圖1)，在723 bp左右有一亮帶。

Lane M: DNA standard markers;

2.2AK基因陽(yáng)性克隆的鑒定回收RT-PCR產(chǎn)物，并與pMD18-T Vector連接后轉(zhuǎn)化E.coliTop 10。從平板中挑取白色菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定(圖2)，選取陽(yáng)性菌落進(jìn)行序列測(cè)定。

圖2谷跗線螨AK cDNA陽(yáng)性克隆的菌落PCR鑒定

Fig.2Colony PCR identification of the positive clones containedT.granariuscDNA

2.3序列分析克隆得到的谷跗線螨AK基因(圖3)的開(kāi)放閱讀框由724個(gè)堿基組成，其編碼的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為26 019，等電點(diǎn)為10.10。

圖3　谷跗線螨AK的核酸序列

3討論

近幾十年來(lái)，全球變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病率逐年升高，成為危害人類(lèi)健康的主要問(wèn)題之一。全球過(guò)敏性疾病發(fā)病率約15%～30%，主要有過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性鼻炎和過(guò)敏性胃腸炎等。過(guò)敏反應(yīng)性疾病是由于人體吸入、食用或接觸變應(yīng)原引起的。其中，塵螨是最常見(jiàn)的吸入性變應(yīng)原之一。有關(guān)螨過(guò)敏反應(yīng)方面的報(bào)道，大多集中在屋塵螨和粉塵螨過(guò)敏原的研究上，對(duì)這兩種螨過(guò)敏原及分子方面的研究已有很多[10-12]。而對(duì)谷跗線螨的研究報(bào)道較少，對(duì)其過(guò)敏原蛋白和基因克隆方面的研究國(guó)內(nèi)外也未見(jiàn)報(bào)道。

精氨酸激酶廣泛存在于無(wú)脊椎動(dòng)物如昆蟲(chóng)、軟體動(dòng)物和甲殼動(dòng)物體內(nèi)，是一種對(duì)能量代謝、貯藏和利用起重要調(diào)節(jié)作用的磷酸原激酶，這已在煙夜蛾等多種昆蟲(chóng)中得到廣泛證實(shí)[13-14]。本研究采用RT-PCR方法，克隆得到了谷跗線螨的精氨酸激酶基因，證實(shí)谷跗線螨體內(nèi)存在精氨酸激酶基因。研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸激酶基因可以在昆蟲(chóng)的多種組織中表達(dá)，但在不同組織內(nèi)表達(dá)量差異較大。比如，意大利蜜蜂的ArgK基因在腦、觸角、復(fù)眼和胸部?jī)?nèi)均有表達(dá)，但在復(fù)眼的表達(dá)量最高[15]。家蠶的BmAK基因在腹足、脂肪體、表皮、中腸、絲腺中都有表達(dá)，其中在腹足中表達(dá)量最高，其次是脂肪體[13]。煙夜蛾的HassAK基因在幼蟲(chóng)頭部、中腸、脂肪體、體壁和腹足中均可表達(dá)，其中以腹足和中腸的表達(dá)水平較高[14]。而精氨酸激酶基因在谷跗線螨體內(nèi)的表達(dá)情況如何，有待進(jìn)一步探明。

精氨酸激酶在昆蟲(chóng)免疫反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用，直接或間接參與相關(guān)的免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸激酶在誘導(dǎo)貝類(lèi)源性過(guò)敏性疾病中發(fā)揮著重要作用[8]。德國(guó)小蠊、美洲大蠊等的精氨酸激酶為蜚蠊主要致敏原之一，可以誘發(fā)人類(lèi)的一些過(guò)敏性反應(yīng)[16]。精氨酸激酶也是家蠶的主要致敏原之一[17]。并發(fā)現(xiàn)在無(wú)脊椎動(dòng)物如塵螨、蟑螂、龍蝦、貝等物種中存在IgE交叉反應(yīng)的同源性[9]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[2]，利用粉塵螨過(guò)敏病人的血清IgE為探針做免疫組化染色，可見(jiàn)谷跗線螨體內(nèi)存在可誘發(fā)人體IgE抗體的變應(yīng)原，主要分布于螨消化道、腺體及體壁等部位，提示谷跗線螨可誘發(fā)敏感患者產(chǎn)生IgE抗體。對(duì)分布于谷跗線螨這些部位的變應(yīng)原是否是精氨酸激酶，有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

此外，精氨酸激酶有可能成為新的害蟲(chóng)防治的潛在靶點(diǎn)，因?yàn)榫彼峒っ甘菬o(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)不可缺少的、調(diào)節(jié)能量代謝的關(guān)鍵酶，且僅存在于無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)，其參與的代謝途徑與哺乳動(dòng)物體內(nèi)肌酸激酶參與的途徑不同；而傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥的使用又給環(huán)境和人類(lèi)健康帶來(lái)不容忽視的影響，因此尋求新的害蟲(chóng)防治手段具有重要意義。據(jù)研究報(bào)道，利用RNAi技術(shù)敲低家蠅幼蟲(chóng)精氨酸激酶的表達(dá)后，可影響家蠅的生長(zhǎng)發(fā)育，并能有效殺死家蠅，不會(huì)影響其他生物的正常和發(fā)育，具有較高的安全性[4]。隨著空調(diào)使用的普及，螨性哮喘發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)，谷跗線螨作為我國(guó)南方地區(qū)空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中的優(yōu)勢(shì)螨種之一，借助空調(diào)送風(fēng)已成為螨抗原一種新的、重要的傳播方式，尋找新的螨蟲(chóng)防治手段勢(shì)在必行。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.009

通訊作者：劉志剛，Email：lzg195910@126.com；

Corresponding authors: Liu Zhi-gang, Email: lzg195910@126.com; Sun Xin, Email: sunxin@bbmc.edu.cn

中圖分類(lèi)號(hào)：R384

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2694(2016)02-0148-04

收稿日期：2015-06-03；修回日期:2015-08-29

Cloning and sequence analysis of the arginine kinase genes in Tarsonemus granarius (Acari: Tarsonemidae)

ZHAO Xue-ying1,YANG Xiao-di1,WU Yu-lan2,LIU Zhi-gang2,SUN Xin1

(1.Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China;2.MedicalCollegeofShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China)

Abstract:In order to clarify that the pan-allergen arginine kinase (AK) gene was existed in the body of Tarsonemus granaries, the live mites (about 6 000) were collected from the air conditioning filter, identified as T. granarius. The total RNA was extracted. The cDNA of AK was cloned, using degenerate primers, from the total RNA of T. granarius. The encoded protein characteristics was analyzed by bioinformatics software. The results of sequencing and sequence analysis showed that the full-length open reading frame of cloned cDNA contained 724 bp and the estimated molecular mass was 26 019(pⅠ10.10). It is concluded that AK was successfully obtained, which will be used for the further recombinant expression and allergenic analysis of T. granarius.

Keywords:Tarsonemus granarius; arginine kinase; gene cloning; sequence analysis

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81071388)資助

孫新，Email：sunxin@bbmc.edu.cn

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81071388)