布魯氏菌病疫苗研究進(jìn)展

景志剛，嚴(yán)家瑞，范偉興

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布魯氏菌病疫苗研究進(jìn)展

景志剛，嚴(yán)家瑞，范偉興

中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島266032

摘要：使用疫苗免疫是防控布氏菌病(簡(jiǎn)稱布病)的重要措施之一，但對(duì)人群使用疫苗免疫一直存有爭(zhēng)議，世界上主要是俄羅斯(前蘇聯(lián))和中國(guó)使用19-BA疫苗和104M疫苗對(duì)布病高危人群進(jìn)行免疫。對(duì)于動(dòng)物布病，早期曾使用滅活疫苗進(jìn)行免疫，目前主要使用S19、Rev.1、RB51、S2和M5等弱毒活疫苗，其中Rev.1和S19是預(yù)防小反芻動(dòng)物和奶牛布病最有效的疫苗，其它疫苗的使用也比較廣泛。初步研究表明基因工程疫苗等新型布病疫苗具有良好的應(yīng)用前景，但尚未被官方認(rèn)可用于人和動(dòng)物的布病免疫。特對(duì)人布病疫苗和動(dòng)物布病疫苗進(jìn)行介紹，并對(duì)基因工程疫苗以及其它新型布病疫苗的最新研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

關(guān)鍵詞：布魯氏菌?。粶缁钜呙?；弱毒活疫苗；基因工程疫苗；新型疫苗

布魯氏菌病(簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌引起的一種以感染家畜為主的人獸共患傳染病。布魯氏菌為革蘭氏陰性兼性胞內(nèi)寄生菌，根據(jù)宿主偏嗜性等差異可以分為多個(gè)不同的種，臨床上以羊種布魯氏菌(B.melitensis)、牛種布魯氏菌(B.abortus)和豬種布魯氏菌(B.suis)意義最大[1]。動(dòng)物感染布病一般出現(xiàn)流產(chǎn)、不孕、睪丸炎及關(guān)節(jié)炎等癥狀，人感染布病的臨床特點(diǎn)多為持續(xù)性感染、波浪熱、多汗、關(guān)節(jié)痛等，而且可能復(fù)發(fā)或留下嚴(yán)重后遺癥[2]。布病嚴(yán)重制約畜牧業(yè)的發(fā)展并威脅公共衛(wèi)生安全。

鑒于布病造成的嚴(yán)重?fù)p失，世界上許多國(guó)家和地區(qū)制定了相應(yīng)的防控和根除計(jì)劃，使用疫苗免疫在此過(guò)程中具有重要意義，尤其是在布病流行形勢(shì)嚴(yán)峻的地區(qū)。早期曾使用滅活疫苗用于人和動(dòng)物的布病防控，隨后被免疫效力更好的弱毒活疫苗替代。目前用于人布病免疫的疫苗主要有19-BA疫苗和104M疫苗，用于動(dòng)物布病防控的的弱毒活疫苗有S19、Rev.1、RB51、S2和M5等。上述疫苗在廣泛用于布病防控的同時(shí)也存在一些缺陷。隨著對(duì)布魯氏菌致病機(jī)制研究的深入以及相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，基因工程疫苗等新型布病疫苗有望取代現(xiàn)有疫苗更好地用于布病的防控。前期關(guān)于布病疫苗的綜述文獻(xiàn)對(duì)一些現(xiàn)有疫苗或某些新型疫苗的菌株生物學(xué)特性、應(yīng)用情況等內(nèi)容進(jìn)行了介紹，但對(duì)疫苗的介紹不夠全面，對(duì)動(dòng)物疫苗致弱機(jī)制的研究情況、分子生物學(xué)鑒別診斷方法、免疫效力對(duì)比等內(nèi)容未進(jìn)行闡述或詳細(xì)說(shuō)明，而且對(duì)最新研究的外膜囊泡疫苗、菌殼疫苗及納米顆粒疫苗等新型疫苗也未進(jìn)行介紹。本文在已有綜述文獻(xiàn)基礎(chǔ)上結(jié)合最新的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，首先介紹了用于人的布病疫苗，其次從菌株來(lái)源、生物學(xué)特性、免疫效果、優(yōu)缺點(diǎn)、分子生物學(xué)鑒別診斷方法等方面全面介紹了現(xiàn)有動(dòng)物布病疫苗，并對(duì)當(dāng)前各類布病新型疫苗的最新研究進(jìn)展進(jìn)行了概述。

1人布病疫苗

至今尚未有國(guó)際認(rèn)可的用于人的布病疫苗，許多國(guó)家對(duì)人群實(shí)施布病免疫也有異議。最初曾用滅活布魯氏菌給人免疫，但是效果不理想。廣泛用于動(dòng)物布病免疫的疫苗如S19、Rev.1、RB51等均對(duì)人有一定毒力，引起人致敏等不良反應(yīng)，因此不適用在人群中免疫[3]。目前俄羅斯和我國(guó)分別使用19-BA疫苗和104M疫苗，均為弱毒活疫苗，這兩種疫苗的主要缺點(diǎn)是：一定比例的接種對(duì)象出現(xiàn)不同程度的副反應(yīng)或者出現(xiàn)急性布病癥狀，干擾常規(guī)血清學(xué)方法等。盡管如此，19-BA疫苗和104M疫苗對(duì)保護(hù)高危職業(yè)人群、布病疫情流行嚴(yán)重地區(qū)的人群仍然具有重要意義。

1.119-BA疫苗19-BA疫苗菌株是在1945年由蘇聯(lián)學(xué)者Vershilova對(duì)牛種布魯氏菌S19弱化得到的，1946年首次用于人的免疫。1952-1958年蘇聯(lián)使用19-BA疫苗使人群布病病例數(shù)降低了約60%，目前主要在俄羅斯使用[4]。以10億CFU每人皮下接種該疫苗，保護(hù)率為60%～80%，免疫期約6～9個(gè)月。我國(guó)從蘇聯(lián)引進(jìn)該疫苗后，于1957年小規(guī)模地用于人的免疫，但由于皮下接種引起嚴(yán)重反應(yīng)，后改為大劑量皮上劃痕免疫[5]。19-BA疫苗穩(wěn)定性差，提供的免疫保護(hù)力低，我國(guó)于1965年開(kāi)始使用104M疫苗取代19-BA疫苗[6-7]。

1.2104M疫苗104M疫苗菌株是蘇聯(lián)研究者Kotnrpoba從母牛流產(chǎn)胎兒中分離到的牛種I型布魯氏菌，1950年將其研制為布病弱毒活疫苗[8]。我國(guó)經(jīng)過(guò)多年的觀察研究，證實(shí)104M疫苗對(duì)人免疫效果較好，優(yōu)于19-BA疫苗，因此于1965 年正式生產(chǎn)該疫苗，至今仍在使用[9]。104M疫苗毒力低、穩(wěn)定、免疫力強(qiáng)，但仍對(duì)人有一定毒性反應(yīng)，如果接種途徑不當(dāng)或者劑量過(guò)大可能引起局部或者全身反應(yīng)，因此接種前需進(jìn)行皮膚變態(tài)試驗(yàn)[10]。104M疫苗可以使用氣霧、皮上、滴鼻、口服等多種免疫途徑，其中以氣霧法為佳，其次是滴鼻，皮上和口服糖丸法雖然安全性最高但免疫效果最差[11-12]。綜合考慮免疫效果和操作簡(jiǎn)便性，目前一般采用皮上劃痕法以50億CFU每人接種104M疫苗，保護(hù)率約90%，免疫期為12個(gè)月，很多地方也采用滴鼻法[5]。104M疫苗對(duì)重點(diǎn)職業(yè)人群進(jìn)行免疫可以顯著降低發(fā)病率，而且在疫情爆發(fā)流行時(shí)可以作為應(yīng)急措施控制疫情[13]。

1.3其它疫苗酚非溶性(phenol-insoluble，PI)成分苗是用酚法提取的含有布魯氏菌抗原的混合物，成分復(fù)雜，含有蛋白、糖、類脂、核酸等，具有一定的免疫原性和保護(hù)力，上世紀(jì)60年代至90年代研究較多。PI成分苗用于人免疫時(shí)大約1/4比例的人出現(xiàn)不同程度的副反應(yīng)，因此不適用于人的布病免疫[14-15]。此外，還有一些學(xué)者研究了新的成分疫苗，待后介紹。

2動(dòng)物布病疫苗

一些國(guó)家和地區(qū)曾使用滅活疫苗對(duì)動(dòng)物布病進(jìn)行防控，但整體效果較差，目前常用的動(dòng)物布病疫苗有S19、RB51、Rev.1、S2和M5等，均為弱毒活疫苗，通過(guò)合理使用疫苗可以將布病流行控制在很低水平。盡管現(xiàn)有動(dòng)物布病疫苗均有一些不足之處，但對(duì)布病防控均發(fā)揮了重大的作用?，F(xiàn)就動(dòng)物布病疫苗做一概述。

2.1滅活疫苗滅活疫苗具有安全性高、便于儲(chǔ)存運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，但是無(wú)法提供持久的保護(hù)力[16]。無(wú)論使用滅活疫苗還是弱毒活疫苗，鑒別疫苗免疫產(chǎn)生的抗體與野毒感染產(chǎn)生的抗體對(duì)于布病的防控都很重要。由于動(dòng)物感染布魯氏菌產(chǎn)生抗體主要針對(duì)脂多糖的O-側(cè)鏈，而粗糙型布魯氏菌不含有O-側(cè)鏈，所以基于檢測(cè)LPS抗體的血清學(xué)方法可以區(qū)分粗糙型布病疫苗免疫與常見(jiàn)光滑型布魯氏菌造成的野毒感染[17]。布病滅活疫苗主要有以下2種。

2.1.1牛種布魯氏菌45/20 疫苗牛種布魯氏菌45/20疫苗菌株是對(duì)從牛體內(nèi)分離得到的牛種布魯氏菌45經(jīng)豚鼠傳代20次后獲得的粗糙型弱毒株，于1938年研制為疫苗用于布病免疫[18]。該菌株滅活后加以佐劑免疫成年奶牛，一方面可以防止疫苗株在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)毒株，另一方面產(chǎn)生的抗體不會(huì)干擾血清學(xué)診斷。該疫苗的缺點(diǎn)是菌株不穩(wěn)定容易變異，不同實(shí)驗(yàn)室保存的該菌株均存在變異現(xiàn)象。原始保存菌株雖然較穩(wěn)定但是也產(chǎn)生少量的O-PS，推測(cè)可能是由于O-側(cè)鏈糖基數(shù)目減少且聚合異常造成的[19]。一些歐洲國(guó)家曾用該疫苗免疫奶牛，并且有一定效果，但由于該疫苗本身安全性和穩(wěn)定性存在問(wèn)題，目前市場(chǎng)上沒(méi)有該疫苗[20]。

2.1.2羊種布魯氏菌H38 疫苗羊種布魯氏菌H38疫苗菌株(原稱53H38菌株)是法國(guó)學(xué)者Renoux等于1962年研制的布病疫苗，該疫苗是將羊種布魯氏菌H38強(qiáng)毒株的培養(yǎng)液經(jīng)福爾馬林滅活后與Mayoline(一種石蠟油)和RlaceA(一種甘露醇單油酸脂)混合制成的乳化劑疫苗[21-22]。疫苗注射后有局部副作用，雖然刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體持續(xù)期較長(zhǎng)但產(chǎn)生的保護(hù)力較差，而且可能干擾血清學(xué)診斷。該疫苗曾在法國(guó)用于山羊和綿羊布魯氏菌病的預(yù)防和控制，針對(duì)該疫苗開(kāi)展的研究較少[23]。

2.2常規(guī)弱毒活疫苗與滅活疫苗相比，活疫苗可以更有效的激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的保護(hù)力也更持久，而且通常弱毒活疫苗的接種途徑多樣，成本更低。由于布魯氏菌在機(jī)體內(nèi)多為胞內(nèi)寄生，所以細(xì)胞免疫對(duì)清除體內(nèi)布魯氏菌的作用更為重要。細(xì)胞免疫最好由活疫苗或者是多種可能的保護(hù)性抗原與佐劑聯(lián)合應(yīng)用來(lái)激活[24]。已有的研究也證實(shí)，與布病滅活疫苗相比，弱毒活疫苗可以提供更持久的保護(hù)力[16]。

常規(guī)的布病弱毒活疫苗主要是通過(guò)篩選毒力較弱的布魯氏菌分離株或是對(duì)布魯氏菌分離株和強(qiáng)毒菌株傳代致弱得到的，如S19、S2、M5、RB51、Rev.1 等。利用全基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、蛋白質(zhì)組學(xué)等研究方法針對(duì)疫苗的致弱機(jī)制進(jìn)行了大量研究并取得了一定的成果，但尚未完全闡明疫苗的致弱機(jī)制。以上疫苗均在不同國(guó)家或地區(qū)被廣泛使用，對(duì)布病防控作出了巨大貢獻(xiàn)。

2.2.1牛種布魯氏菌S19疫苗S19疫苗自19世紀(jì)30年代起便在全球范圍內(nèi)作為有效的布病疫苗廣泛用于奶牛布病的預(yù)防，是印度、阿根廷、巴西等許多國(guó)家的布病參考疫苗。奶牛免疫S19疫苗后可以有效抵抗布魯氏菌野毒感染，美國(guó)國(guó)家動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室關(guān)于S19疫苗的總結(jié)報(bào)告指出65%-75%免疫動(dòng)物不被感染，25%-35%免疫動(dòng)物雖然感染，但無(wú)流產(chǎn)等明顯臨床癥狀。S19疫苗是目前世界公認(rèn)的用于防控奶牛布病最有效的疫苗[25-26]。

最初使用的S19疫苗菌株是1923年John Buck將從奶樣中分離到的布魯氏菌經(jīng)室溫放置培養(yǎng)1年得到的光滑型突變株。目前國(guó)際上主要使用的S19疫苗是由美國(guó)科學(xué)家篩選到的一株對(duì)赤蘚糖醇敏感的S19菌株，于1956年開(kāi)始使用，安全性更高[27]。S19疫苗的免疫效力取決于接種動(dòng)物的年齡、接種劑量及途徑、感染菌株的種類、劑量和感染途徑以及群體感染情況等多種因素，目前主要用于奶牛的布病防控，與RB51疫苗免疫保護(hù)力對(duì)比數(shù)據(jù)見(jiàn)表1[28]。S19對(duì)人有一定的致病力，因此S19疫苗不能作為人用布病疫苗，近年來(lái)也有疫苗生產(chǎn)或者接種過(guò)程中造成人員感染的報(bào)道[29]。S19疫苗的缺點(diǎn)是：1)不適用于懷孕動(dòng)物和公畜：標(biāo)準(zhǔn)劑量或降低劑量免疫懷孕奶牛均有一定的流產(chǎn)率而且可能引起公畜持續(xù)睪丸炎；2)干擾常規(guī)血清學(xué)診斷：以3×1010CFU標(biāo)準(zhǔn)劑量免疫成年奶牛后產(chǎn)生的抗體可持續(xù)10-11個(gè)月，干擾常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)方法[18]；

我國(guó)目前使用的A19疫苗是19世紀(jì)50年代從蘇聯(lián)引進(jìn)的S19菌株。國(guó)際上現(xiàn)用的S19菌株赤蘚醇操縱子中有一段702 bp的序列缺失，導(dǎo)致赤蘚醇代謝基因eryC和eryD被破壞，從而使S19對(duì)赤蘚醇敏感[30]。A19并沒(méi)有該段序列的缺失，而且可在缺少赤蘚醇的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，所以推測(cè)A19為早期使用的S19[31]。A19毒力介于S2和M5之間，對(duì)牛的免疫效果要明顯優(yōu)于S2，一般不用于羊和懷孕奶牛[32]。布魯氏菌強(qiáng)毒株缺失這段序列并不像S19一樣毒力致弱，所以研究人員認(rèn)為赤蘚醇代謝受影響并不是導(dǎo)致S19毒力致弱的主要原因[33]。Crasta等對(duì)牛種布魯氏菌強(qiáng)毒株和S19進(jìn)行了全基因組測(cè)序和比較基因組學(xué)分析，鑒定了新的可能導(dǎo)致S19毒力致弱的基因，對(duì)這些基因的進(jìn)一步功能驗(yàn)證有助于闡明S19的毒力致弱機(jī)制[34]。利用缺失的702bp片段或者SNP位點(diǎn)可以用來(lái)區(qū)分S19和其它野毒株[31,35-36]。

表1　S19和RB51疫苗用于奶牛的免疫效果比較

注：1:s.c.表示皮下接種；(×2)表示接種2次；2:2308指B.abortus2308，i.c.指結(jié)膜接種；3:保護(hù)力指對(duì)流產(chǎn)的保護(hù).

Note: 1--The abbreviation s.c. represents subcutaneous vaccination and ( 2) means animals were vaccined twice; 2--2308 representsBrucella.abortus2308, i.c. means conjunctival vaccination; 3--Protection is depicted as “protection against abortion”.

2.2.2牛種布魯氏菌RB51疫苗RB51疫苗是當(dāng)前北美應(yīng)用最為廣泛的疫苗，被美國(guó)、墨西哥、智利、葡萄牙等多個(gè)國(guó)家用于奶牛布病的防控，也可以用于野牛、麋鹿等野生動(dòng)物布病的預(yù)防[37]。1996年，美國(guó)最先開(kāi)始使用RB51疫苗取代S19疫苗用于奶牛布病的免疫，主要是為解決S19干擾血清學(xué)診斷的問(wèn)題，一般以(1×1010)～(3.4×1010)CFU皮下注射免疫4-12月齡的后備奶牛。RB51疫苗用于小反芻動(dòng)物布病的預(yù)防效果較差(表2)，目前對(duì)RB51用于奶牛布病防控也存在一些爭(zhēng)議[38-41]。

RB51疫苗菌株是美國(guó)Gerhardt G. S.等研究者于19世紀(jì)80年代末研制，通過(guò)將牛種布魯氏菌2308在含利福平和青霉素抗性的TSA培養(yǎng)基上多次傳代，然后使用結(jié)晶紫和吖啶等試驗(yàn)篩選到的粗糙型突變株。RB51菌株比較穩(wěn)定，不會(huì)像牛種布魯氏菌45/20一樣發(fā)生表型突變或毒力返強(qiáng)[42]。雖然RB51菌株毒力弱于S19，但是仍能造成人的感染。RB51為粗糙型疫苗株，產(chǎn)生針對(duì)O-側(cè)鏈的抗體很少，因此不會(huì)干擾虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等血清學(xué)診斷，但有研究表明RB51嚴(yán)重影響iELISA或者cELISA檢測(cè)結(jié)果[19]。RB51菌株具有利福平抗性，容易通過(guò)選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離鑒定，但也不利于布病的常規(guī)治療。此外，由于RB51具有專利保護(hù)，價(jià)格較高，很多國(guó)家未引進(jìn)。有研究者認(rèn)為在布病流行控制很好而且大規(guī)模免疫進(jìn)行很長(zhǎng)時(shí)間的地區(qū)，可以使用RB51疫苗配合檢疫—屠宰計(jì)劃根除布病[43]。

表2　RB51和Rev.1疫苗對(duì)懷孕母羊的免疫效果評(píng)價(jià)

注：參考文獻(xiàn)[44]；每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物13～14只，12～14月齡時(shí)免疫，免疫4周后同期發(fā)情，確認(rèn)懷孕后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，con.表示結(jié)膜免疫，s.c.表示皮下免疫。

Note: Refer to bibliography[44]for details. Pregnant animals were challenged as described. con. and s.c. represents conjunctival and subcutaneous vaccination respectively.

研究證實(shí)，RB51菌株中編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的wboA基因被IS711插入序列破壞，導(dǎo)致O-側(cè)鏈合成受阻，從而表現(xiàn)為粗糙型[45]。RB51菌株轉(zhuǎn)入功能性的wboA基因后，O-側(cè)鏈合成水平上升并且在小鼠模型上可以提供比RB51更好的保護(hù)力，但是菌株仍然為粗糙型，這表明除wboA基因外還有其它基因功能異常導(dǎo)致RB51為粗糙型[46]。目前從分子水平鑒定RB51的PCR方法主要就是基于插入的IS711序列[45,47]。

2.2.3羊種布魯氏菌Rev.1疫苗Rev.1疫苗于19世紀(jì)60年代開(kāi)始用于動(dòng)物布病的預(yù)防，免疫后動(dòng)物可以長(zhǎng)時(shí)間抵抗布魯氏菌野毒感染，是目前世界公認(rèn)的用于小反芻動(dòng)物布病防控最有效的疫苗。Rev.1疫苗在希臘、約旦、塔吉克斯坦、蒙古和西班牙等許多國(guó)家用于布病防控，效果非常顯著[48-49]。

Rev.1疫苗菌株是1953年由美國(guó)加利福尼亞大學(xué)Elberg和Faunce將羊種布魯氏菌6 056野毒株在鏈霉素抗性培養(yǎng)基上不斷傳代得到的帶有鏈霉素抗性的光滑型突變株，1957年首次通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)以活疫苗形式免疫山羊可以提供很好的免疫保護(hù)力[50-51]。在綿羊和山羊上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Rev.1疫苗刺激機(jī)體所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平與S19疫苗相近，但抗體持續(xù)期更長(zhǎng)，提供的保護(hù)力也更高[52]。在牛群中的一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Rev.1的免疫原性優(yōu)于S19，而且對(duì)牛的保護(hù)率高于S19，但目前Rev.1在牛群中的使用有限[53]。由于Rev.1毒力較強(qiáng)，標(biāo)準(zhǔn)劑量皮下免疫懷孕動(dòng)物容易導(dǎo)致流產(chǎn)，降低Rev.1接種劑量接種懷孕動(dòng)物可以降低流產(chǎn)率，但是提供的保護(hù)力弱[54-55]。Blasco, JM等建議采取對(duì)整群動(dòng)物同時(shí)接種標(biāo)準(zhǔn)劑量(1～2)×109CFU Rev.1疫苗的免疫方案，包括青年動(dòng)物和成年動(dòng)物，但對(duì)母羊應(yīng)在妊娠期最后幾個(gè)月、產(chǎn)羔期、或交配前免疫以降低流產(chǎn)率[48]。研究結(jié)果表明采取粘膜免疫Rev.1更合理，一方面通過(guò)粘膜接種疫苗可以提供與皮下接種相似的保護(hù)力，另一方面由于疫苗主要在顱淋巴結(jié)內(nèi)復(fù)制，對(duì)常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)方法干擾很小，這便于實(shí)行小反芻動(dòng)物布病檢疫—屠宰的根除計(jì)劃[56-58]。免疫效力對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Rev.1對(duì)小反芻動(dòng)物的免疫效果明顯高于S2和RB51(表3、4)。塔吉克斯坦和蒙古等國(guó)家采用Rev.1免疫3-8月或小于1歲的青年動(dòng)物，間隔3年免疫成年動(dòng)物的布病防控策略，效果理想[59,60]。Rev.1疫苗也有一些缺點(diǎn)，如：Rev.1在動(dòng)物體內(nèi)存活期較長(zhǎng)，而且容易通過(guò)分泌物、乳汁等造成水平傳播，甚至感染人[48]；由于Rev.1帶有鏈霉素抗性，臨床使用鏈霉素和四環(huán)素治療布病時(shí)效果較差[27]。

目前對(duì)Rev.1的基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成，GenBank登錄號(hào)為AE008917和AE008918(文章未發(fā)表)，為從基因水平闡明Rev.1 的致弱機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明Rev.1產(chǎn)生鏈霉素抗性的原因是編碼核糖體蛋白S12的基因rpsL發(fā)生了突變，隨后利用Rev.1和16M的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究鑒定出一系列差異性表達(dá)的蛋白，如免疫原性外膜蛋白、金屬離子攝取和脂類代謝等相關(guān)蛋白，有利于進(jìn)一步研究Rev.1的致弱機(jī)制[61-62]?；趓psL基因突變建立的多重PCR、PCR-RFLP方法以及omp2基因PstI酶切位點(diǎn)多態(tài)性分析等方法均可以從分子水平鑒別區(qū)分Rev.1[47,62-63]。

表3　Rev.1和S2疫苗對(duì)懷孕母羊的免疫效果評(píng)價(jià)

注：參考文獻(xiàn)[64]，4月齡時(shí)結(jié)膜免疫，懷孕后進(jìn)行攻毒。

Note: Refer to bibliography[64]for details. Animals were immunized at 4 months of age and challenged after pregnant.

表4　Rev.1與S2和RB51疫苗對(duì)公羊的免疫效果評(píng)價(jià)

注：Rev.1與S2的免疫效力對(duì)比實(shí)驗(yàn)見(jiàn)參考文獻(xiàn)[65]，每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物13-16只，4月齡時(shí)結(jié)膜免疫，8個(gè)月后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，2個(gè)月后宰殺進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)比，con.代表結(jié)膜免疫；Rev.1與RB51的免疫效力對(duì)比實(shí)驗(yàn)見(jiàn)參考文獻(xiàn)[66]，每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物15-16只，6月齡時(shí)免疫，6月后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，8周后宰殺進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)比，s.c.代表皮下免疫。

Note: Refer to bibliography[65]for experiment details of efficacy comparison of Rev.1 and S2. Refer to bibliography[66]for experiment details of efficacy comparison of Rev.1 and RB51.

2.2.4豬種布魯氏菌S2疫苗S2疫苗目前廣泛用于我國(guó)動(dòng)物布病的預(yù)防。S2 疫苗菌株是中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所于上世紀(jì)50年代從豬的流產(chǎn)胎兒中分離到的豬種布魯氏菌經(jīng)連續(xù)傳代得到的弱毒株，光滑型表型[27]。70年代起我國(guó)逐漸開(kāi)始對(duì)山羊、綿羊、奶牛和豬等動(dòng)物進(jìn)行S2口服免疫，至今仍在使用[27]。S2毒力弱，在體內(nèi)存活期明顯短于S19和Rev.1，相應(yīng)地S2刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體持續(xù)期短，申捷等報(bào)道S2免疫山羊和綿羊20 d后血清抗體陽(yáng)性率達(dá)到峰值，之后便開(kāi)始逐漸下降[67-69]。因此S2的安全性高，口服免疫不會(huì)導(dǎo)致懷孕母畜流產(chǎn)，并可經(jīng)飲水、氣霧或皮下注射等多種方式進(jìn)行免疫[64]。一些研究結(jié)果表明S2的免疫保護(hù)力較Rev.1低(表3)。

與布魯氏菌強(qiáng)毒株相比，S2差異表達(dá)的基因主要是與DNA修復(fù)和重組蛋白﹑氨基酸代謝﹑分泌和膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，而且GenBank上不同來(lái)源的S2菌株序列也有一定差異[70]。使用分子生物學(xué)方法可以鑒定S2菌株，例如：使用MLVA方法通過(guò)鑒定豬種布魯氏菌1 330菌株和S2菌株在Bru9和Bru16兩個(gè)位點(diǎn)存在的差異可以鑒別診斷[71]；S2菌株基因組有一段25 bp的序列缺失，結(jié)合AMOS-PCR體系建立的雙重PCR方法也可以區(qū)分S2菌株和其它種布魯氏菌(表5)[72]。

2.2.5羊種布魯氏菌M5疫苗M5疫苗菌株是哈爾濱獸醫(yī)研究所于1962 年通過(guò)弱化強(qiáng)毒株M28(從羊分離到的羊種布魯氏菌，1型生物型)得到的弱毒株，免疫途徑一般為5×109CFU氣霧免疫[73]。1970年，我國(guó)首次大規(guī)模對(duì)山羊和綿羊免疫M(jìn)5疫苗，結(jié)果顯示M5疫苗可以為接種動(dòng)物提供很好的保護(hù)力，為我國(guó)動(dòng)物布病的防控發(fā)揮了積極的作用[74]。M5菌株缺點(diǎn)是毒力強(qiáng)，在小鼠體內(nèi)存活時(shí)間可以超過(guò)35周，而且經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)從S 型到R 型的變異[74]。

通過(guò)對(duì)M5和布魯氏菌16M的比較基因組學(xué)研究，以及比對(duì)M28強(qiáng)毒株的基因組序列，發(fā)現(xiàn)了一些可能導(dǎo)致M5毒力降低的原因，同時(shí)也提供了可以區(qū)分M5菌株的SNP位點(diǎn)]。譚鵬飛等基于SNP位點(diǎn)分析建立的RT-PCR方法可以區(qū)分M5與其它布魯氏菌(表6)[76]。

表5　用于PCR鑒別部分疫苗菌株的引物序列

*RB51，S19和Rev.1與羊種布魯氏菌16M進(jìn)行比對(duì)，所用的引物可以用于Bruce-ladder實(shí)驗(yàn)鑒定布魯氏菌[47]；S2與豬種布魯氏菌1330進(jìn)行比對(duì)[72]。補(bǔ)英文對(duì)照

表6　用于RT-PCR鑒別M5和A19的引物及探針

a:M5探針中陰影背景堿基表示SNP區(qū)分位點(diǎn)；A19/S19探針中斜體并帶下劃線堿基表示RNA； b:+號(hào)表示該信號(hào)通道有熒光信號(hào)，-號(hào)表示該通道無(wú)熒光信號(hào)。

Note: a--SNP locus for identification of M5 was marked by a shaded background, SNP locus for identification of A19 was RNA base and marked by italic and underlined; 2--symbol “+” means fluorescence signal was detected while symbol “-” means fluorescence signal was not detected.

3布病基因工程疫苗

目前使用的布病疫苗在用于防控布病的同時(shí)，存在一些不足之處，因此有必要開(kāi)發(fā)更完善的布病疫苗。分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展使研究者對(duì)布魯氏菌的致病機(jī)制有了更深入的了解，同時(shí)也為研究者提供了相應(yīng)的技術(shù)手段，基于此可以更合理的研制新型疫苗或?qū)ΜF(xiàn)有疫苗進(jìn)行改善。此外，生物信息學(xué)技術(shù)也有助于推進(jìn)布病疫苗的研發(fā)。目前針對(duì)布病研發(fā)的基因工程疫苗如基因工程弱毒活疫苗、基因工程活載體疫苗、核酸疫苗以及亞單位疫苗等均取得了一定進(jìn)展，有望取代常規(guī)布病弱毒疫苗用于布病的防控。

3.1基因工程弱毒活疫苗布病基因工程弱毒活疫苗是利用分子生物學(xué)技術(shù)敲除布魯氏菌一個(gè)或多個(gè)毒力基因或者使布魯氏菌過(guò)表達(dá)某些保護(hù)性抗原得到的重組布魯氏菌。這類疫苗的優(yōu)點(diǎn)是安全性更高，而且由于遺傳背景清楚，可以建立相應(yīng)的血清學(xué)方法和/或病原學(xué)方法區(qū)分野毒株造成的感染，是目前布病疫苗研究的熱點(diǎn)。已鑒定出的布魯氏菌毒力基因超過(guò)180個(gè)，一些小RNA也被證實(shí)與布魯氏菌的毒力相關(guān)，這些研究為布病基因缺失疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)[77-78]。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，疫苗株毒力越弱，提供的保護(hù)力也越弱，因此布病疫苗的研發(fā)要綜合考慮毒力和保護(hù)力[26]。

在確定布魯氏菌毒力基因后，可以通過(guò)優(yōu)化現(xiàn)有弱毒活疫苗或者在強(qiáng)毒株和分離株上進(jìn)行基因缺失開(kāi)發(fā)新的布病疫苗。例如，通過(guò)缺失LPS合成必需基因得到的粗糙型突變株是理想的候選疫苗，其優(yōu)點(diǎn)是不干擾常規(guī)血清學(xué)診斷而且毒力明顯降低。例如：per、wbkF、wa**、pgm、wboA、wbkC、manBA等基因缺失疫苗株在小鼠、山羊、綿羊等動(dòng)物上具有一定保護(hù)力[79]。缺失OMP25和OMP31等外膜蛋白、bp26和p39等免疫原性蛋白相應(yīng)編碼基因構(gòu)建的分子標(biāo)記疫苗可以鑒別診斷野毒感染，同時(shí)有較好的免疫效果[73]。vjbR、MucR等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、不同代謝通路的必需基因等毒力因子編碼基因突變后的致弱株也可以作為布病候選疫苗[26]。

3.2活載體疫苗布病活載體疫苗主要是通過(guò)將布魯氏菌保護(hù)性免疫抗原整合到另一種載體病毒或細(xì)菌基因組實(shí)現(xiàn)的，牛腺病毒3型、沙門(mén)氏菌等均可以作為活載體[80-81]?；钶d體疫苗免疫效力高、安全性可控，免疫動(dòng)物后會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生廣泛的免疫應(yīng)答，而且通過(guò)插入多個(gè)外源基因可以實(shí)現(xiàn)防控多種傳染病的目的[24]。Kaissar Tabynov等人將布魯氏菌保護(hù)性抗原OMP16和L7/L12整合至A型流感病毒構(gòu)建而成的新型疫苗在懷孕母牛上可以提供與S19和RB51相近的保護(hù)力，說(shuō)明活載體疫苗在布病防控上具有良好的應(yīng)用前景[82]。目前已開(kāi)展的布病活載體疫苗研究見(jiàn)表7。

3.3DNA疫苗布病DNA疫苗(基因疫苗，核酸疫苗)一般是含有布魯氏菌保護(hù)性抗原的重組質(zhì)粒，也可能同時(shí)含有一些細(xì)胞因子編碼基因以增強(qiáng)免疫反應(yīng)。DNA疫苗在安全性以及穩(wěn)定性上有明顯的優(yōu)勢(shì)，而且容易生產(chǎn)、保存和運(yùn)輸，使用方便。此外，多種質(zhì)粒混合或者結(jié)合多種不同抗原構(gòu)建的質(zhì)粒有可能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)多個(gè)抗原表位的免疫保護(hù)作用使DNA疫苗具有很大的靈活性[91-92]。對(duì)布魯氏菌DNA疫苗的研究主要是一些可以刺激機(jī)體產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答的分子上，目前研究較多的有：核糖體蛋白L7/L12、細(xì)胞周質(zhì)蛋白p39和鐵蛋白、Cu-Zn超氧化物歧化酶、外膜蛋白Omp31、二氧四氫蝶啶合成酶BLS、外膜蛋白Omp25和侵入蛋白IalB、熱休克蛋白GroEL、bp26和引發(fā)因子TF等，詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[16,18,26,73]。近年來(lái)又鑒定出一些新的保護(hù)性抗原用于布病DNA疫苗研究，如表面蛋白SP41[93]、核糖體蛋白L9[94]、以及位于基因島3的ORF(open reading frame)編碼產(chǎn)物[95-96]等。DNA疫苗用于人和動(dòng)物的免疫效果還有待驗(yàn)證。

3.4亞單位疫苗布病亞單位疫苗通常使用一些具有免疫保護(hù)力的布魯氏菌蛋白或者其它免疫原性分子免疫動(dòng)物，有時(shí)加以一定的佐劑以增強(qiáng)免疫效果。例如從布魯氏菌提取的多糖和少量蛋白的混合物、細(xì)菌培養(yǎng)上清、O-PS與BSA的偶聯(lián)物、LPS等免疫動(dòng)物也可以產(chǎn)生一定的保護(hù)力[97-100]。亞單位疫苗研發(fā)的難點(diǎn)是抗原的選擇以及遞呈平臺(tái)的選擇[101]。目前用于布病亞單位疫苗研究的蛋白有：分子伴侶DnaK、轉(zhuǎn)鐵蛋白Bfr、外膜蛋白、Cu-Zn超氧化物歧化酶、SodC、Tig 、SurA、BLS、p39、L7/L12、IalB、水解酶、CobB和AsnC、糖激酶等，以上蛋白的功能、細(xì)胞定位以及免疫保護(hù)力等詳細(xì)信息見(jiàn)參考文獻(xiàn)[166,18,26,102-103]。布病亞單位疫苗的研究還處于初步階段，用于動(dòng)物免疫的研究較少。

4其它新型布病疫苗

4.1外膜囊泡疫苗外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)是指革蘭氏陰性菌在正常生長(zhǎng)或者感染宿主等各個(gè)階段自發(fā)地、持續(xù)地分泌或者釋放的一類直徑為10-300 nm的球狀顆粒物質(zhì)[104]。OMVs通常含有某些蛋白質(zhì)、LPS、磷脂質(zhì)以及一些位于細(xì)胞周質(zhì)的菌體組分，因此可以作為多抗原復(fù)合物刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)[105]。通過(guò)對(duì)OMVs提取的標(biāo)準(zhǔn)化，OMVs疫苗已經(jīng)作為腦膜炎奈瑟氏菌病的官方許可疫苗，充分說(shuō)明OMVs疫苗具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[106]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明布魯氏菌OMVs在小鼠模型上可以提供與Rev.1相近的免疫保護(hù)力，通過(guò)使用佐劑可以進(jìn)一步提高其保護(hù)力[107-108]。利用基因工程技術(shù)使布魯氏菌過(guò)表達(dá)一些保護(hù)性抗原后提取OMVs也許可以優(yōu)化OMVs的免疫效果。目前針對(duì)布魯氏菌OMVs的研究較少， OMVs用于人和動(dòng)物免疫的可行性尚待論證。

表7　布病活載體疫苗保護(hù)力評(píng)價(jià)

1: SOD 指Cu/Zn superoxide dismutase；L7/L12指ribosomal proteins L7/L12；OMP指outer membrane protein ；IF3指 translation initiation factor 3； 2 : i.p.表示腹腔注射，i.n.表示鼻內(nèi)接種，oral表示口服，未標(biāo)明twice的均免疫一次；3: 保護(hù)力指與對(duì)照組相比，脾臟菌落數(shù)降低的Log10值，N表示與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，NA表示文中未給出具體數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明與對(duì)照組相比活載體疫苗可以提供顯著保護(hù)力。

Note: 1--SOD, L7/L12, OMP and IF3 represent Cu/Zn superoxide dismutase, ribosomal proteins L7/L12, outer membrane protein and translation initiation factor 3 respectively; 2--i.p. represents intraperitoneal injection, i.n. represents intranasal vaccination, twice indicates animals were immunized two times; 3--Protection was depicted as “l(fā)og 10 unit” reduction in splenic colonization in experiment animals, N means no significant difference, NA means data was not available from original article.

4.2菌殼疫苗革蘭氏陰性菌通過(guò)表達(dá)噬菌體裂解基因E造成細(xì)胞壁形成跨膜孔道，從而引起菌體內(nèi)容物外流而形成菌殼(Bacterial ghost)。菌殼無(wú)傳染風(fēng)險(xiǎn)，但是保留與活菌相似的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)以及抗原蛋白等，因此可以作為載體遞呈藥物、多肽或者疫苗等[109-110]。有研究表明粗糙型布魯氏菌菌殼疫苗在小鼠動(dòng)物模型上可以有效地激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，但菌殼疫苗對(duì)靶動(dòng)物產(chǎn)生的保護(hù)力仍需要大量研究來(lái)評(píng)價(jià)[111]。

4.3納米顆粒疫苗DNA、蛋白質(zhì)、多糖等生物分子均為納米級(jí)大小，1～1 000 nm不同直徑的納米顆?？梢赃\(yùn)輸不同的生物活性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的[112]。乙肝病毒重組疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗等納米顆粒疫苗已獲得官方許可，證明納米顆粒疫苗具有一定的實(shí)用價(jià)值[113]。布病納米顆粒疫苗相關(guān)的研究很少，初步研究表明用于布病免疫的納米顆粒疫苗[114-115]以及用于布病治療的納米顆?？股赜幸欢ǖ男Ч鸞116]。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.018

通訊作者：范偉興，Email: fwxsjl@126.com

Corresponding author:Fan Wei-xing, Email: fwxsjl@126.com

中圖分類號(hào)：R378

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2694(2016)02-0188-12

收稿日期：2015-03-17；修回日期:2015-08-26

Research progress of brucellosis vaccines

JING Zhi-gang,YAN Jia-rui,FAN Wei-xing

(China Animal Health & Epidemiology Center, Qingdao 266032, China)

Abstract:Vaccination against Brucella infections is one of the most effective measures to prevention and control the brucellosis. There exists controversy over human brucellosis vaccination, currently B. abortus 19BA vaccine and B. melitensis 104M vaccine are mainly used in Russian and China respectively to protect at-risk workers and general populations living in endemic areas. As for animal brucellosis, killed vaccines have gradually been replaced since 1930’s by live attenuated vaccines, i.e. S19, Rev.1, RB51, S2, M5 and so forth, among which Rev.1 and S19 are generally recommended for small ruminants and cattle respectively, while the others are also widely used. Novel vaccines such as genetically engineered vaccines show promising application prospect but not licensed yet. Both conventional vaccines against brucellosis in animal and human and genetically engineered vaccines or other novel vaccines were reviewed in this paper.

Keywords:brucellosis; killed vaccine; live attenuated vaccine; genetically engineered vaccine; novel vaccine