混合感染豬繁殖與呼吸綜合征和圓環(huán)病毒2型豬群的豬瘟抗體變化研究

楊 苗，李建臻，林 華，陳世界，徐 剛（.四川出入境檢驗(yàn)檢疫局，四川成都 6004；.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川成都 630）

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混合感染豬繁殖與呼吸綜合征和圓環(huán)病毒2型豬群的豬瘟抗體變化研究

楊 苗1，李建臻2，林 華1，陳世界1，徐 剛2
（1.四川出入境檢驗(yàn)檢疫局，四川成都 610041；2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川成都 611130）

摘 要：本試驗(yàn)研究旨在探究豬場(chǎng)發(fā)生豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）與圓環(huán)病毒2型（PCV2）混合感染后，豬群的豬瘟抗體變化，運(yùn)用RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR與PCR方法，對(duì)四川某規(guī)?；l(fā)病豬場(chǎng)進(jìn)行高致病性PRRS、豬瘟與圓環(huán)2型的病原檢測(cè)。結(jié)果顯示高致病性PRRS、圓環(huán)2型和豬瘟陽(yáng)性率分別為54%（19/35）、50%（17/34）、0（0/5）。結(jié)合臨床癥狀、病豬剖檢變化，確診為PRRSV與PCV-2混合感染。采集PRRS與PCV-2混合感染病豬血清12份為試驗(yàn)組，本場(chǎng)健康豬只（無(wú)臨床癥狀、抗原檢測(cè)陰性）12份為對(duì)照組，運(yùn)用ELISA試驗(yàn)檢測(cè)豬群豬瘟抗體，結(jié)果顯示試驗(yàn)組的豬瘟抗體合格率為33%（4/12），顯著低于健康對(duì)照組的合格率83.3%（10/12）（P＜0.05），結(jié)果表明PRRS和PCV2混合感染會(huì)對(duì)豬瘟抗體產(chǎn)生負(fù)面影響。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征；圓環(huán)病毒2型；混合感染；豬瘟抗體

豬瘟作為世界公認(rèn)的，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害最為嚴(yán)重的疾病，一直受到世界各國(guó)重視。據(jù)報(bào)道，每年因豬瘟導(dǎo)致的死亡數(shù)占養(yǎng)豬總數(shù)的5%以上，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)億元。我國(guó)豬瘟防治主要采用免疫接種的方法，免疫效果直接影響豬瘟防控效果。在諸多影響豬瘟免疫效果的因素中，以免疫抑制性因子導(dǎo)致的免疫失敗最受關(guān)注。

2006年我國(guó)暴發(fā)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）之后，PRRS與圓環(huán)病毒2型（PCV-2）混合感染成為目前養(yǎng)豬生產(chǎn)中最為常見(jiàn)的疾病［1］，給我國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV與PCV-2具有特殊的致病機(jī)制，均會(huì)破壞動(dòng)物機(jī)體的免疫系統(tǒng)。有資料顯示，兩者混合感染后，會(huì)因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)破壞影響其他疫苗的免疫應(yīng)答，從而增加其他疾病的感染風(fēng)險(xiǎn)［2-3］。本研究運(yùn)用RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR與ELISA方法，對(duì)四川省某規(guī)模化自然發(fā)病豬場(chǎng)進(jìn)行病原與抗體的檢測(cè)與分析，以期了解豬群中PRRS和PCV2混合感染后，豬群中豬瘟抗體的變化狀況，以便更好地闡述PRRSV與PCV-2的免疫抑制機(jī)制，從而提高豬瘟免疫效果，為規(guī)?；i場(chǎng)疫病防控措施及合理免疫程序的制定提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)豬場(chǎng)概況。四川省某規(guī)模化豬場(chǎng)總共存欄432頭母豬。2014年1月3日，保育豬出現(xiàn)食欲廢絕，隨后妊娠母豬精神沉郁，共計(jì)56頭母豬相繼發(fā)病，體溫在39.5～40.9℃。1月10日，妊娠母豬開(kāi)始流產(chǎn)，采取治療措施3～4天后母豬開(kāi)始恢復(fù)采食，停止流產(chǎn)，共計(jì)流產(chǎn)6窩，主要集中在妊娠后期。對(duì)該豬場(chǎng)跟蹤觀察后發(fā)現(xiàn)，該豬場(chǎng)在發(fā)病后6個(gè)月內(nèi)一直處于生產(chǎn)不穩(wěn)定狀態(tài)，主要問(wèn)題是保育舍內(nèi)仔豬體況較差，表現(xiàn)在仔豬斷奶后被毛粗亂、體型偏瘦；部分仔豬耳尖發(fā)紺，明顯腹式呼吸，少量后肢癱瘓。該豬場(chǎng)豬瘟免疫程序?yàn)椋鹤胸i28日齡首免（脾淋苗2頭份/只），60日齡二免（脾淋苗2頭份/只）；母豬產(chǎn)后10天免疫（脾淋苗4頭份/只）。

1.1.2 病豬剖檢病理變化。對(duì)5只?。l）死豬進(jìn)行病理解剖，剖檢情況見(jiàn)表1。

表1 病豬解剖病理變化

1.1.3 儀器與試劑。豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢科前；TaKaRa RNA PCR Kit （AMV） Ver.3.0購(gòu)自大連寶生物公司；Varioskan Flash 3001全波長(zhǎng)多功能讀數(shù)儀（Thermo）；ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）；GELDOC 2000電泳分析系統(tǒng)（Bio-Rad）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（MEMMERT）；C1000普通梯度PCR儀器（Bio-Rad）；微量移液器（德國(guó)Eppendorf）；MILLI-Q超純水純化系統(tǒng)（Milliproe）；CFX96熒光定量PCR儀（Bio-Rad）等。

1.1.4 引物

1.1.4.1 高致病性PRRS RT-PCR引物。參考西南大學(xué)榮昌校區(qū)生物技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室［5］設(shè)計(jì)（擴(kuò)增片段高致病性藍(lán)耳病180 bp），由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。

1.1.4.2 PCV-2 PCR引物。參考呂艷麗等［6］設(shè)計(jì)（擴(kuò)增片段472 bp），由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PRRSV、PCV-2抗原檢測(cè)反應(yīng)體系及條件參照西南大學(xué)榮昌校區(qū)生物技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室［5］介紹的方法。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后取5 uL PCR 產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.2.2 豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件與方法參考四川出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室介紹的方法。

1.2.3 試驗(yàn)分組與豬瘟抗體檢測(cè)方法。選取PRRSV與PCV-2混合感染病豬血清12份作試驗(yàn)組，本場(chǎng)健康豬只（無(wú)臨床癥狀、抗原檢測(cè)陰性）血清12份作對(duì)照組，共計(jì)24份，日齡階段均為31～50日齡。豬瘟抗體檢測(cè)參照武漢科前公司ELISA抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 病原檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 高致病性PRRS病原檢測(cè)結(jié)果。高致病性PRRS病原檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，樣品PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳圖見(jiàn)圖1。 由表2和圖1可知，該養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)疾病中有高致病性PRRS病原感染，整體陽(yáng)性率達(dá)到54%。

表2 RT-PCR檢測(cè)HP-PRRSV結(jié)果

圖1 部分HP-PRRSV RT-PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果

2.1.2 PCV-2病原檢測(cè)結(jié)果。PCV-2病原檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，樣品PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。由表3和圖2可知，該養(yǎng)殖場(chǎng)1月份暴發(fā)疾病中有PCV-2病原感染，整體陽(yáng)性率達(dá)到50%，其中保育豬31～50日齡階段感染率最高。

表3 PCR檢測(cè)PCV-2結(jié)果

圖2 部分PCV-2 PCR陽(yáng)性產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果

2.1.3 豬 瘟 病 原 檢 測(cè) 結(jié)果。豬瘟病原檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4與圖3。由表4與圖3表明可知，該養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)疾病中沒(méi)有豬瘟病原感染。

表4 熒光定量RT-PCR檢測(cè)豬瘟結(jié)果統(tǒng)計(jì)

圖3 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)豬場(chǎng)發(fā)病豬感染CSFV的擴(kuò)增曲線

2.2 綜合診斷結(jié)果

結(jié)合臨床診斷、病理解剖和RT-PCR檢測(cè)確診該規(guī)?；i場(chǎng)發(fā)生HP-PRRS與PCV-2的混合感染。

2.3 豬瘟抗體檢測(cè)結(jié)果

豬瘟抗體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，豬只PRRS與PCV-2型混合感染后，豬瘟免疫陽(yáng)性率顯著低于未感染豬只豬瘟免疫陽(yáng)性率，PRRSV與PCV-2型混合感染后豬群的豬瘟抗體效價(jià)水平顯著降低。

表5 豬瘟病毒血清抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

3 分析與討論

3.1 PCV-2和PRRSV的混合感染及免疫抑制

本次試驗(yàn)中，臨床發(fā)病豬只，特別是斷奶后保育豬的臨床病癥突出表現(xiàn)為仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）［7］。在PMWS感染豬中，PCV-2和PRRSV共同感染的比例很高，這在國(guó)外許多國(guó)家均有報(bào)道。Pallares F等［8］報(bào)道PCV-2和PRRSV共感染陽(yáng)性率占PMWS的29.1%。王慧［9］論述當(dāng)今豬場(chǎng)PRRSV與PCV-2混合感染最為嚴(yán)重，姚奕蕾等［10］也有類(lèi)似報(bào)道。賈赟、盧銀華等［11］應(yīng)用復(fù)合PCR方法對(duì)華東地區(qū)127份病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果PRRSV與PCV-2混合感染率達(dá)54.6%。

本場(chǎng)的PCV-2和PRRSV混合感染結(jié)果與以上研究大多相符。據(jù)報(bào)道，近幾年發(fā)現(xiàn)在豬重要的傳染性病原中，PCV-2與PRRSV混合感染在免疫抑制性疾病發(fā)生過(guò)程中所起的作用日益增強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果也證明此趨勢(shì)。同時(shí)說(shuō)明本場(chǎng)兩種免疫抑制病的感染破壞了豬體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，增大了其他疾病感染危險(xiǎn)，使豬群生產(chǎn)性能下降。因此，當(dāng)前的臨床獸醫(yī)工作者在預(yù)防和診療此病的過(guò)程中要對(duì)此高度重視，以便及時(shí)確診病情，盡早采取防治措施，減少損失。

3.2 PCV-2和PRRSV感染豬群對(duì)豬瘟抗體變化的影響

鑒于豬瘟病毒對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的巨大危害，世界各國(guó)一直將其作為養(yǎng)豬業(yè)首要防治疫病，我國(guó)將其歸為一類(lèi)動(dòng)物疫病。從已消滅豬瘟國(guó)家的經(jīng)驗(yàn)得出，豬瘟的防制主要采用免疫接種。如何讓豬群獲得較高抗體效價(jià)是豬瘟防控成功的關(guān)鍵。據(jù)資料顯示，我國(guó)規(guī)模化豬場(chǎng)免疫豬瘟后，如果群體陽(yáng)性率達(dá)到80%以上，就可以防止豬瘟野毒侵染，而抗體效價(jià)較低則存在野毒侵染的風(fēng)險(xiǎn)。各個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)也以豬瘟免疫合格作為疫病防控的首要任務(wù)，但我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)豬瘟免疫抗體水平普遍不高，特別是保育豬階段，成為最為危險(xiǎn)的疾病暴發(fā)點(diǎn)。排除管理因素，以免疫抑制性因子導(dǎo)致的豬瘟免疫失敗最受當(dāng)今養(yǎng)豬從業(yè)者關(guān)注。

近幾年豬場(chǎng)PRRSV與PCV-2型混合感染與豬瘟病毒免疫兩者之間的關(guān)系日益引起重視。相關(guān)資料表明，PRRSV感染對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞功能、細(xì)胞免疫和體液免疫均具有明顯影響，具有明顯的免疫抑制作用［12］。司興奎等［13］報(bào)道PCV-2感染可在一定程度上抑制豬瘟疫苗的特異性抗體反應(yīng)，降低豬瘟弱毒疫苗的免疫效果。司興奎等［13］通過(guò)比較HP-PRRS疫苗單獨(dú)免疫和PCV-2感染21天后再免疫HP-PRRS疫苗這兩者豬血清中的PRRSV抗體水平和外周血淋巴細(xì)胞亞群含量的變化，顯示PCV-2感染可以降低機(jī)體對(duì)HP-PRRS疫苗的體液免疫應(yīng)答，降低機(jī)體淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞含量，使機(jī)體的免疫功能受到抑制。Li and Yang［14］報(bào)道PRRSV感染可明顯抑制豬瘟疫苗的免疫應(yīng)答，如果在豬瘟疫苗免疫前一周給豬接種PRRSV，會(huì)顯著抑制豬瘟抗體的生成。陳欠林等［15］也報(bào)道了PRRSV與PCV-2混合感染后，豬群豬瘟疫苗抗體陽(yáng)性率呈下降趨勢(shì)。

以上報(bào)道均為實(shí)驗(yàn)室條件下的結(jié)果，在生產(chǎn)條件下的類(lèi)似研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)中豬只PRRSV 與PCV-2混合感染后，豬瘟免疫抗體陽(yáng)性率顯著低于未感染豬只（P＜0.05），豬瘟免疫抗體陽(yáng)性率為33.3%，遠(yuǎn)低于免疫合格水平，與以上資料報(bào)道相似。分析其原因，可能是上述兩種病毒，均可以抑制豬體的免疫能力，從而影響豬瘟疫苗的免疫應(yīng)答。本試驗(yàn)應(yīng)用的試驗(yàn)樣本為自然狀態(tài)下發(fā)病豬群，可能更貼近生產(chǎn)，但這兩種病原影響動(dòng)物免疫的具體機(jī)制尚不明確。有報(bào)道稱(chēng)可能與這兩種病毒引起的細(xì)胞凋亡有關(guān)，需進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)結(jié)果提示，豬場(chǎng)中PRRSV和PCV-2的存在是生產(chǎn)中豬瘟免疫水平不理想的重要因素，從而無(wú)法對(duì)抗豬瘟野毒感染，加大了豬瘟暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而影響豬群整體生產(chǎn)性能。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

項(xiàng)目來(lái)源：四川出入境檢驗(yàn)檢疫局自立科技項(xiàng)目計(jì)劃（SK201403）

Study on the Changes of Antibody to Classical Swine Fever in the Swine Herds Co-infected with PRRSV and PCV-2

Yang Miao1，Li Jianzhen2，Lin Hua1，Chen Shijie1，Xu Gang2
（1.Sichuan Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau，Chengdu，Sichuan 610041；2.Chengdu Vocational College of Agricultural Science and Technology，Chengdu，Sichuan 611130）

Abstract：To analyze and detect the antibody to CSFV in the swine herds co-infected with PRRSV and PCV-2.RTPCR，real-time fl uorescence RT-PCR and PCR methods were used to detect the highly pathogenic PRRSV，CSFV and PCV-2 in the deseased swine farm of Sichuan.The results showed that the positive rates of highly pathogenic PRRSV，PCV-2 and CSFV were 54%（19/35），50%（17/34）and 0（0/5） respectively.Combined with clinical symptoms and autopsy change，the diagnosis results were co-infection with PRRSV and PCV-2.CSFV antibody was detected by ELISA in the 12 serum samples of experimental group of pigs co-infected with PRRSV and PCV-2 and in the 12 serum samples of control group of healthy pigs（no clinical symptoms，negative antigen detection）.The results showed that CSFV antibody qualifi ed rate was 33%（4/12）in the infected pigs group，signifi cantly lower than that of the healthy control group with the qualifi ed rate of 83.3%（10/12）（（P ＜ 0.05）.It was indicated that there was negative effect on CSFV antibody production with mixed infection of PRRSV and PCV-2.

Key words：PRRSV；PCV-2；co-infection；CSFV antibody

中圖分類(lèi)號(hào)：S851.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1005-944X（2016）03-0005-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.03.002

通訊作者：林華