兩種O型口蹄疫ELISA檢測試劑盒的對比

呂曉麗，姚曉韻，何奇松，馮淑萍，馬 軍，覃雨陽，李雪梅，熊 毅，顏健華（.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 53000）

?

兩種O型口蹄疫ELISA檢測試劑盒的對比

呂曉麗1，姚曉韻1，何奇松2，馮淑萍2，馬 軍1，覃雨陽1，李雪梅1，熊 毅2，顏健華2
（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530001）

摘 要：為比較哪種ELISA試劑盒能夠更準(zhǔn)確、簡便、快捷地檢測出口蹄疫病毒抗體，本研究使用液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（LB-ELISA）試劑盒和固相競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（SPC-ELISA）試劑盒，對2014年廣西各市縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心送檢的已免疫過口蹄疫疫苗的豬、牛、羊血清共計(jì)1121份進(jìn)行了檢測，對比兩種試劑盒的特異性、敏感性、陽性檢出率及符合率。檢測結(jié)果表明，兩種口蹄疫ELISA試劑盒的陽性檢出率不同，LB-ELISA的陽性檢出率比SPC-ELISA高2.4%；LB-ELISA試劑盒對血清抗體滴度水平的要求相比SPC-ELISA試劑盒要低，因此LB-ELISA試劑盒更適合于口蹄疫病毒感染的檢測。

關(guān)鍵詞：O型口蹄疫；抗體；液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；固相競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；比較

口蹄疫（FMD）由口蹄疫病毒（FMDV）引起，主要感染牛、豬、綿羊、山羊等偶蹄動(dòng)物［1］?？谔阋卟《揪哂懈咄蛔兟屎椭亟M性，因此它的血清型眾多且易變異，而多種血清型之間不存在交叉免疫；各血清型中還有不同亞型，其抗原性也存在一定程度上的差別［2］。另一方面，口蹄疫傳播迅速，這給口蹄疫的診斷、控制和根除帶來了困難。目前在我國，疫苗免疫是最主要手段。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)因在口蹄疫檢測中具有敏感、特異、穩(wěn)定、安全、快速、簡單易于操作等特點(diǎn)而備受青睞。本研究利用兩種O型口蹄疫ELISA檢測試劑盒對血清進(jìn)行檢測，以期選擇更簡便、更準(zhǔn)確的方法用于大規(guī)模檢測，以便做好口蹄疫防治工作，也有利于試劑盒的不斷改進(jìn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清。廣西南寧、玉林、欽州、防城港、崇左、北海、百色等地各級動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心送檢的豬、牛、羊血清共1 121份，由廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室保存。詳情見表1。

表1 血清樣品來源

1.1.2 試劑盒。液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附（LB-ELISA）試劑盒，購自蘭州獸醫(yī)研究所；固相競爭酶聯(lián)免疫吸附（SPC-ELISA）試劑盒，購自北京金諾百特科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備。96孔V形血凝板、移液器、酶標(biāo)儀、振蕩器、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（LB-ELISA）。實(shí)驗(yàn)方法主要參考說明書，并做部分修改，具體步驟如下：在96孔V形血凝板上，如表2所示，依次用1×PBST稀釋樣本血清（豬血清遞次稀釋至第5孔，牛、羊血清稀釋至第6孔），按50 μL/孔加病毒抗原，4孔病毒抗原對照孔僅加入100 μL病毒抗原，振蕩30 s，封板，4 ℃過夜；將稀釋液按表3所示的次序50 μL/孔轉(zhuǎn)移至包被口蹄疫O型兔抗的ELISA板上后按說明書步驟繼續(xù)操作。

表2 96孔V形血凝板稀釋樣品布局

表3 96孔酶標(biāo)板檢測樣品布局

1.2.2 固相競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（SPC-ELISA）。按說明書進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 LB-ELISA試驗(yàn)結(jié)果

表4 液相檢測結(jié)果

2.2 與LB-ELISA相比較的SPC-ELISA試驗(yàn)結(jié)果

表5 固相檢測結(jié)果

2.3 兩種不同ELISA對所有送檢血清的陽性率檢測結(jié)果

表6 兩種ELISA對所有血清檢測結(jié)果

3 分析討論

通過液相阻斷ELISA和固相競爭ELISA兩種不同口蹄疫抗體檢測方法對所有血清檢測得到的結(jié)果可知，兩種方法的抗體陽性檢出率差別不大。但總體上說，液相競爭ELISA的陽性檢出率稍高，多數(shù)差別在5%左右。但也有例外，如編號為7的防城港送檢的100份豬血清，SPC-ELISA的陽性檢出率比LPB-ELISA陽性檢出率高出20%左右。出現(xiàn)這種特殊情況的原因有很多，其中血清質(zhì)量不好是主要因素，具體影響因素有待進(jìn)一步研究。

在本研究運(yùn)用的兩種方法中，液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)所得陽性率比固相競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)高，因此將液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算固相競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)敏感性、特異性及符合率。本實(shí)驗(yàn)所用固相競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測豬血清的敏感性較高，為90.18%，牛羊血清稍低，為86%左右；特異性普遍較低，在羊血清中表現(xiàn)稍高，為81.58%。因此若將液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)作為標(biāo)準(zhǔn)，那么固相競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒正確判斷陽性率比正確判斷陰性率高。兩種方法檢測結(jié)果都為陽性的樣品中，豬血清陽性率為58.06%，與液相檢測結(jié)果相差較小，為1.54%；牛羊血清相差較大，為10%左右。

實(shí)驗(yàn)中存在用兩種不同ELISA檢測方法測得數(shù)據(jù)存在較大差距的血清。如編號為“防2014352”南寧隆安送檢的羊血清（30份）用不同方法檢測，數(shù)據(jù)相差18%；編號為“防2014165”來自防城港送檢的豬血清（100份）用兩種不同檢測方法檢測的數(shù)據(jù)相差20%；編號為“防2014285”某養(yǎng)殖場送檢的豬血清（25份）用兩種不同檢測方法得到的數(shù)據(jù)相差28%。造成兩種試劑盒檢測結(jié)果差異大的原因可能為：從外觀上看，兩種不同檢測方法檢測結(jié)果差別較大的血清部分出現(xiàn)溶血或者渾濁的現(xiàn)象，而其余沒有溶血或者渾濁現(xiàn)象的血清檢測結(jié)果差別較小，僅5%左右。ELISA血清學(xué)試驗(yàn)對血清質(zhì)量的要求相對嚴(yán)格，溶血或混濁嚴(yán)重、被細(xì)菌污染都可以產(chǎn)生非特異性顯色，導(dǎo)致檢測結(jié)果受其干擾。待檢血清保存不當(dāng)也可能導(dǎo)致檢測結(jié)果異常。在冰箱中保存過久，血清就會(huì)聚合成多肽體，酶標(biāo)板清洗不徹底，這些因素都會(huì)導(dǎo)致在檢測時(shí)出現(xiàn)假陽性。由于兩種試劑盒的檢測實(shí)驗(yàn)不是同時(shí)進(jìn)行，所以待檢血清多次被凍融也會(huì)造成檢測結(jié)果差異大。

本實(shí)驗(yàn)所用血清是廣西各地方動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心送檢的免疫過口蹄疫疫苗的的動(dòng)物血清。因各地所用疫苗不盡相同，所以不同疫苗對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著一定影響。有實(shí)驗(yàn)研究證明合成肽疫苗的免疫效果普遍比較好，第一次免疫后很快就可以檢測到免疫抗體，并且免疫合格率能達(dá)到90%以上，第二次免疫后能全部達(dá)到100%［3］。但使用常規(guī)的O型口蹄疫滅活疫苗后，用本實(shí)驗(yàn)所用的兩種EILSA試劑盒檢測，第二次免疫后所產(chǎn)生的免疫抗體仍比較低，最高的也只有60%。

通過對多組血清的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)有多份血清的SPC-ELISA檢測結(jié)果呈陰性，即抗體水平在臨界值的邊緣，但LPB-ELISA結(jié)果卻呈陽性。這說明LPB-ELISA對血清抗體水平的要求比SPC-ELISA要低，因此更加適用于口蹄疫的快速檢測。

參考文獻(xiàn)：

［1］郎洪武，楊漢春.口蹄疫研究進(jìn)展［J］.中國獸藥雜志，2005，39（10）：16-21.

［2］Domingo E，Escarmis C，Baranowski E，et al.Evolution of foot-and-mouth disease virus［J］.Virus Res，2003，91（1）：47-63.

［3］秦榮香，曹玉美，陸江，等.不同口蹄疫疫苗免疫效果及檢測方法評估［J］.養(yǎng)豬，2010（2）：62-63.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Comparison of Two ELISA Kits for Detection of Type O FMDV Antibody

Lü Xiaoli1，Yao Xiaoyun1，He Qisong2，F(xiàn)eng Shuping2，Ma Jun1，Qin Yuyang1，Li Xuemei1，Xiong Yi2，Yan Jianhua2
（1.College of Animal Sciences and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530005；2.Guangxi Animal Disease Prevention and Control Center，Nanning，Guangxi 530001）

Abstract：Aimed to compare which of the ELISA kits could detect antibodies against foot-and-mouth disease virus more easily，accurately and quickly，1 121 serums of swine，bovine and sheep immunized foot-and-mouth disease vaccine provided by animal disease prevention and control center of various cities in Guangxi province were tested by LB-ELISA kits and SPC-ELISA kits.The sensitivity，specifi city，antibody positive ratio and coincidence rate between the LB-ELISA kits and SPC-ELISA kits were compared.The results showed that the positive rates of two kinds of ELISA kits were different.The positive rate of LB-ELISA was 2.4% higher than that of SPC-ELISA.The requirment of antibody level of LB-ELISA kit was lower than that of SPC-ELISA kit.So the LB-ELISA kits were more suitable for detecting the footand-mouth disease virus infection.

Key words：serotype O FMDV；antibody；LB-ELISA；SPC-ELISA；comparison

中圖分類號：S852.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1005-944X（2016）03-0071-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.03.024

基金項(xiàng)目：廣西科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目（桂科攻0779001）

通訊作者：顏健華