新型凝膠純化凝血酶原復(fù)合物的工藝探討

周敏，曾仁勇，劉園園，李長(zhǎng)清，曹海軍Δ?，何澤超Δ?

(1.四川大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所，四川 成都 610052)

新型凝膠純化凝血酶原復(fù)合物的工藝探討

周敏1，曾仁勇2，劉園園2，李長(zhǎng)清2，曹海軍2Δ?，何澤超1Δ?

(1.四川大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所，四川 成都 610052)

目的 探索新型凝膠Capto DEAE離子交換柱層析純化凝血酶原復(fù)合物的工藝條件。 方法 健康人混血漿經(jīng)離心去除冷沉淀后，采用DEAE-Sephadex A-50凝膠進(jìn)行吸附，經(jīng)洗滌、洗脫得到洗脫液；將得到的洗脫液超濾脫鹽后，再通過(guò)Capto DEAE凝膠柱純化，制備凝血酶原復(fù)合物(prothrombin complex concentrates，PCC)。測(cè)定PCC中凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ及抗凝蛋白C的活性并計(jì)算收率；采用Bradford法測(cè)定PCC蛋白濃度，再根據(jù)測(cè)定的4種凝血因子和蛋白C的活性，計(jì)算有效成分的比活；以此分析所選工藝條件下Capto凝膠對(duì)PCC的純化效果。結(jié)果 不同實(shí)驗(yàn)方案下，所得制品中FⅡ、FⅨ、FⅩ收率和純度均較高，且該3種凝血因子均衡度較好；但FⅦ 收率和純度均較低；其中A方案下PCC收率和純度較好，即Capto DEAE 凝膠體系平衡液、洗滌液、洗脫液中檸檬酸鈉、NaCl、pH分別為0.020～0.028 mol/L、0.10～0.15 mol/L、6.9～7.2；0.012～0.020 mol/L、0.10～0.15 mol/L、6.9～7.2；0.005～0.012 mol/L、2.4 mol/L、7.2～7.5時(shí)，F(xiàn)Ⅸ收率為(74.40±10.89)%，比活為(3.31±0.31)IU/mg，抗凝蛋白C的收率和比活均較高。結(jié)論 采用DEAE-Sephadex A-50批式吸附及Capto DEAE柱層析相結(jié)合的新方法制備PCC ，在所選擇條件下，PCC制品的純度為2.17～3.31 IU/mg，遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)工藝制得的產(chǎn)品，此為高品質(zhì)PCC的制備提供了新的方法。

凝血酶原復(fù)合物；Capto DEAE凝膠；離子交換柱層析

人凝血酶原復(fù)合物(prothrombin complex concentrates，PCC)是從健康人混合血漿分離制備的血液制品，主要含依賴維生素K合成的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ[1-2]。PCC制品在20世紀(jì)70年代用于臨床，廣泛用于治療乙型血友病[3]、有抗凝血因子Ⅷ的甲型血友病[4]、維生素K缺乏引起的凝血因子水平低下導(dǎo)致的出血癥[5]、以及替代新鮮冰凍血漿逆轉(zhuǎn)維生素拮抗劑或香豆素類抗凝劑過(guò)量導(dǎo)致的各種出血性疾病[6-9]。目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)PCC主要采用DEAE-Sephadex A-50吸附進(jìn)行大規(guī)模制備[10-12]。我國(guó)現(xiàn)生產(chǎn)PCC的傳統(tǒng)工藝均采用DEAE-Sephadex A-50凝膠進(jìn)行兩步批式吸附，該方法使用的吸附介質(zhì)DEAE-Sephadex A-50凝膠經(jīng)平衡后，機(jī)械強(qiáng)度差、易破碎[13]，不適用于柱層析技術(shù)[2]；另外DEAE-Sephadex A-50凝膠在重復(fù)應(yīng)用中存在補(bǔ)加量難估計(jì)、不易控制等一系列問(wèn)題[13]，從而導(dǎo)致制品質(zhì)量不易控制。本實(shí)驗(yàn)研究中，對(duì)PCC的傳統(tǒng)工藝進(jìn)行了改進(jìn)，采用DEAE-Sephadex A-50凝膠吸附和Capto DEAE凝膠柱層析相結(jié)合的方法制備PCC，旨在探索使用Capto DEAE新型凝膠制備PCC的工藝條件，為工業(yè)生產(chǎn)PCC提供新的制備方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：健康人混合血漿(四川省三臺(tái)10人混血漿)；DEAE-SephadeⅩ A-50凝膠(GE公司，批號(hào)：10091423)；Capto DEAE離子交換介質(zhì)(GE公司)；凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ活性檢測(cè)試劑盒(SIEMENS公司，批號(hào)：503630C、500749B、504107D、504009A)；Super-Bradford蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)：00111510)；正常質(zhì)控血漿(SIEMENS公司，批號(hào)：507704A)；PC缺乏乏漿(HYPHEM BioMed 公司，批號(hào)：31302-1 PK：2)；PC檢測(cè)試劑盒(HYPHEM BioMed 公司，批號(hào)：32901-PK：2)；蛋白weight Marker(Fermentas公司，批號(hào)：1671920)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器：精密天平(xS205，METTLER TOLEDO公司)；大容量高速低溫冷凍離心機(jī)(RC3BP+，Thermo公司)；pH儀(FE20，METTLER TOLEDO公司)；電導(dǎo)儀(FE30，METTLER TOLEDO公司)；AKTA explorer 100層析系統(tǒng)(GE Healthcare)；全自動(dòng)凝血儀(CA-1500，Sysmex公司)；蛋白垂直電泳儀(Mini-Protean，Bio-Rad公司)；酶標(biāo)儀(SpectraMax M2e，Molecular Devices公司)；凝膠成像儀(ImageQuant 350，GE公司)；純水儀(Milli-Q Advantage，Millipore公司)；恒溫水浴箱(HH-W600，金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 PCC的初步純化：按照傳統(tǒng)的批式吸附方法，使用DEAE-Sephadex A-50凝膠吸附新鮮冰凍人血漿制備出PCC粗液。參照文獻(xiàn)[1]，設(shè)定DEAE-Sephadex A-50凝膠平衡體系中檸檬酸鈉、氯化鈉、pH 3個(gè)可變因素分別為0.02～0.028 mol/L；0.10～0.15 mol/L；6.9～7.2；參照文獻(xiàn)[14]，設(shè)定洗滌體系中檸檬酸鈉、氯化鈉、pH 3個(gè)可變因素分別為0.012～0.02 mol/L、0.02～0.028 mol/L；0.10～0.15 mol/L； 6.6～6.9、7.2～7.5；參照文獻(xiàn)[15]，設(shè)定洗脫體系中檸檬酸鈉、氯化鈉、pH 3個(gè)可變因素分別為0.012～0.02 mol/L、0.005～0.012 mol/L；2.4 mol/L；6.6～6.9、7.2～7.5。見表1。

表1 4種實(shí)驗(yàn)方案條件設(shè)計(jì)表Tab.1 Four kinds of experimental conditions

將制備出的PCC進(jìn)行超濾處理，降低電導(dǎo)至10～12 ms/cm。再用于Capto DEAE離子交換柱層析進(jìn)一步純化。

1.2.2 新型凝膠Capto DEAE純化PCC 采用AKTA explorer100層析系統(tǒng)，根據(jù)曹海軍等[2]對(duì)DEAE-Sephadex A-50的實(shí)驗(yàn)研究，設(shè)置Capto DEAE凝膠的平衡體系中檸檬酸鈉、氯化鈉、pH 3個(gè)因素分別為0.02～0.028 mol/L；0.06～0.10 mol/L；6.6～6.9、6.9～7.2；洗滌體系中檸檬酸鈉、氯化鈉、pH 3個(gè)可變因素分別為0.012～0.02 mol/L；0.10～0.15 mol/L；6.9～7.2；設(shè)定洗脫體系中檸檬酸鈉、氯化鈉、pH 3個(gè)可變因素分別為0.005～0.012 mol/L、0.012～0.02 mol/L；2.4 mol/L；6.6～6.9、7.2～7.5；具體實(shí)驗(yàn)條件見表1。

AKTA explorer100層析過(guò)程中，平衡、吸附、洗滌、洗脫過(guò)程流速分別為：3.5 cm/min、1.5 cm/min、2.5 cm/min、1.5 cm/min；具體操作參照AKTA explorer 100說(shuō)明書。

1.2.3 凝血因子活性測(cè)定 凝固法(一期法)測(cè)定FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ活性，正常參比血漿做1/5～1/80梯度稀釋；硫酸魚精蛋白中和去冷沉淀原料混漿所含肝素，比例為10 μg硫酸魚精蛋白中和1IU肝素；洗脫液1/12稀釋；將處理好的待測(cè)樣品和試劑分別置于全自動(dòng)凝血儀中，檢測(cè)凝血因子活性。具體操作見說(shuō)明書。

1.2.4 蛋白C活性測(cè)定 發(fā)色底物法[16]測(cè)定PC活性，正常參比血漿1/5～1/80梯度稀釋；去冷沉淀原料血漿1/3稀釋；洗脫液1/10稀釋；將處理好的樣品先后與體外激活劑、發(fā)色底物試劑混合，用50%冰醋酸終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀在405 nm處讀數(shù)。具體操作見說(shuō)明書。

1.2.5 總蛋白含量測(cè)定 考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)PCC收集液的總蛋白含量，牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，洗脫液1/3稀釋，原料血漿1/60稀釋。將處理好的A-G BSA標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品分別加入標(biāo)記好的96孔板微孔中，然后加入檢測(cè)試劑，充分混勻后用酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm處吸光值。具體操作見說(shuō)明書。

1.2.6 SDS-PAGE 非還原性SDS-PAGE分析制備出的PCC的純度，并與國(guó)內(nèi)某公司已上市的PCC制品進(jìn)行對(duì)比。PCC洗脫液1/3稀釋，國(guó)內(nèi)PCC制品(300 IU)1/360稀釋，至所檢測(cè)PCC樣品中FⅨ活性均約為0.9 IU/mL。參照文獻(xiàn)[17]方法，濃縮膠4%、分離膠10%進(jìn)行非還原性SDS-PAGE；電泳過(guò)程中，濃縮膠電壓設(shè)置80 V，分離膠電壓設(shè)置為120 V。電泳后，凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色30 min、甲醇/乙酸混合物脫色1 h。

1.2.7 不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)凝血因子收率及比活影響分析 依據(jù)1.4和1.6測(cè)定結(jié)果，計(jì)算上述4種凝血因子的收率及比活。統(tǒng)計(jì)3次試驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)平均值(n=3)，直接分析不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)4種凝血因子收率及比活的影響趨勢(shì)。

2 結(jié)果

2.1 Capto DEAE柱層析 4種實(shí)驗(yàn)方案下，層析圖譜均相似，3個(gè)峰依次為背景雜質(zhì)峰、洗滌峰及洗脫峰(目標(biāo)蛋白峰)。圖1顯示，洗滌過(guò)程中洗去部分雜蛋白；洗脫峰均為單一峰。

圖1 4種實(shí)驗(yàn)方案下Capto DEAE凝膠柱層析紫外檢測(cè)圖譜Fig.1 Capto DEAE-gel ion-exchange chromatograms of 4 kinds of experimental conditions

2.2 不同實(shí)驗(yàn)方案下4種凝血因子的收率及比活 不同實(shí)驗(yàn)條件下，4種凝血因子收率變化有明顯規(guī)律，從實(shí)驗(yàn)方案A至D，4種凝血因子的收率均呈遞減的趨勢(shì)，其中FⅨ收率分別為：(74.40±10.89)%、(71.59±5.45)%、(61.57±2.46)%、(49.20±3.73)%；FⅦ、FⅨ、FⅩ比活在A、B、C實(shí)驗(yàn)方案下遞減，其中FⅨ分別為：(3.31±0.31)、(2.68±0.55)、(2.17±0.15)IU/mg，而在D實(shí)驗(yàn)條件下，均稍有升高，其中FⅨ(2.96±0.41)IU/mg。同一實(shí)驗(yàn)條件下，F(xiàn)Ⅸ收率最高，F(xiàn)Ⅶ收率最低。方差分析顯示4種實(shí)驗(yàn)方案下，F(xiàn)Ⅸ的收率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.188，P=0.018)，而比活比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.172，P=0.085)。見圖2。

圖2 4種實(shí)驗(yàn)方案下凝血因子的收率及比活±s)Fig.2 The yield and specific activity of coagulation factors ±s)

2.3 不同實(shí)驗(yàn)方案對(duì)蛋白C活性的影響 圖3顯示，不同實(shí)驗(yàn)條件下，蛋白C收率變化規(guī)律不明顯，其中A、C實(shí)驗(yàn)方案下，蛋白C的收率較高，分別為(46.31±10.43)%、(44.95±8.49)%，D實(shí)驗(yàn)方案下收率最低為(32.57±8.86)%；蛋白C的比活在A、B、C實(shí)驗(yàn)方案下遞減，分別為(0.86±0.22)、 (0.67±0.21)、(0.57±0.08)IU/mg，而在D實(shí)驗(yàn)方案條件下，蛋白C比活稍有升高，為(0.62±0.19)IU/mg；4種實(shí)驗(yàn)方案下蛋白C的收率(F=1.088，P=0.408)和比活(F=0.978，P=0.450)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 4種實(shí)驗(yàn)方案下蛋白C收率及比活±s)Fig.3 The yield and specific activity of protein ±s)

2.4 SDS-PAGE 4種實(shí)驗(yàn)方案下，制品PCC所含蛋白種類基本一致(圖4條帶2、3、4、5)，蛋白條帶集中于分子量為49～198 kDa區(qū)間內(nèi)，表明本實(shí)驗(yàn)制備的PCC不僅包含有效的凝血因子和抗凝蛋白(分子量為50～72 kDa)，還包含高分子量的雜蛋白，這與國(guó)內(nèi)某公司PCC制品電泳條帶相似(條帶6)；在分子量49 kDa以下，本實(shí)驗(yàn)制備的PCC制品無(wú)明顯蛋白條帶出現(xiàn)，而國(guó)內(nèi)某公司PCC制品則顯示出較多的低分子量蛋白條帶，表明本實(shí)驗(yàn)所探討實(shí)驗(yàn)方案下制取的PCC制品所含的雜蛋白較少、純度更高。

圖4 不同實(shí)驗(yàn)方案所制備PCC的SDS-PAGE 條帶1：蛋白marker ；條帶2：方案A制備PCC；條帶3：方案B制備PCC；條帶4：方案C制備PCC；條帶5：方案D制備PCC；條帶6：國(guó)內(nèi)某公司PCC制品Fig.4 SDS-PAGE analysis for four kinds of eluentLanes 1:protein weight marker; Lanes 2: eluet from A experimental condition;Lanes 3:eluet from B experimental condition ; Lanes 4: eluet from C experimental condition ; Lanes 5: eluet from D experimental condition; Lanes 6: PCC from a domestic company

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外PCC多使用DEAE-Sephadex A-50批式吸附制備，但國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的成型PCC制品中，與凝血因子Ⅸ相比，凝血因子Ⅱ、Ⅹ含量相對(duì)較高，PCC中凝血因子活性含量的不均衡增加了其產(chǎn)品的致栓性[18]。隨著血漿蛋白分離技術(shù)的發(fā)展，近幾年也有利用擴(kuò)張床吸附(expanded bed adosorption, EBA)技術(shù)制備PCC[13]的報(bào)道，但仍處于實(shí)驗(yàn)室探索階段，而使用Capto DEAE新型凝膠制備PCC還未見相關(guān)研究報(bào)道。由于目前沒有關(guān)于Capto DEAE生產(chǎn)PCC的研究報(bào)道，而Capto DEAE凝膠與DEAE-Sephadex A-50凝膠在結(jié)構(gòu)上有相似之處，Capto DEAE凝膠是在Capto基質(zhì)(一種高流動(dòng)性的瓊脂糖基質(zhì))上引入二乙基氨基乙基的新型弱陰離子交換劑，DEAE-Sephadex A-50凝膠則是在交聯(lián)葡聚糖上引入二乙基氨基乙基的弱堿性陰離子交換劑[19]。所以根據(jù)曹海軍等[14-15]對(duì)DEAE-Sephadex A-50凝膠制備PCC的大量工藝研究，我們選取了其中較優(yōu)的制備條件，設(shè)計(jì)了A、B、C、D四種實(shí)驗(yàn)方案來(lái)探索Capto DEAE凝膠制備PCC的工藝條件。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的探索，本研究發(fā)現(xiàn)，A到D 4種實(shí)驗(yàn)方案下，4種凝血因子的收率依次遞減，且4種方案中FⅨ的收率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)Ⅶ、FⅨ、FⅩ比活在A、B、C實(shí)驗(yàn)方案下遞減，而在D實(shí)驗(yàn)條件下，均稍有升高，但其中FⅨ比活比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A、C實(shí)驗(yàn)方案下蛋白C的收率和比活均較高，在D方案下最低，4種實(shí)驗(yàn)方案下蛋白C的收率和比活比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。總體而言，方案A最佳。

采用此實(shí)驗(yàn)方法制備PCC，在4種實(shí)驗(yàn)方案下，檢測(cè)出制備的PCC純度均比國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的PCC高。在較好的實(shí)驗(yàn)方案A下，F(xiàn)Ⅸ的收率達(dá)到(74.40±10.89)% 、比活為(3.31±0.31)IU/mg，其比活明顯高于國(guó)內(nèi)廠家制備的PCC制品比活(0.51～1.04 IU/mg)[20]。本研究認(rèn)為這表明此實(shí)驗(yàn)方法制備PCC對(duì)其純度有所提高，且Capto DEAE對(duì)FⅨ的吸附能力較好，可以顯著提高FⅨ收率。

同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)，在所有實(shí)驗(yàn)方案下，F(xiàn)Ⅶ的含量(0.25～0.30 IU/1 IU FⅨ)均低于國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)出的PCC(0.93～2.19 IU/1 IU FⅨ)[21]，本研究認(rèn)為一方面可能是Capto DEAE凝膠的處理及分離條件有待進(jìn)一步優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)選擇的Capto DEAE凝膠處理?xiàng)l件，參照曹海軍等[14-15]對(duì)DEAE-Sephadex A-50凝膠制備PCC的工藝條件。雖然Capto DEAE凝膠和DEAE-Sephadex A-50凝膠都屬于弱陰離子交換劑、配體都是二乙基氨基乙基，在結(jié)構(gòu)上有相似之處，但2種凝膠的基質(zhì)不同，DEAE-Sephadex A-50凝膠基質(zhì)為交聯(lián)葡聚糖，而Capto DEAE凝膠基質(zhì)是一種高流動(dòng)性的瓊脂糖?；|(zhì)不同、凝膠的分離特性有區(qū)別，故處理DEAE-Sephadex A-50凝膠的最優(yōu)條件并不一定適合用來(lái)處理Capto DEAE；另一方面可能是因?yàn)镃apto DEAE凝膠本身對(duì)FⅦ的吸附能力不強(qiáng)，從而使制得的PCC制品中FⅦ水平較低；其確切原因有待進(jìn)一步探討。

另一方面，本研究所制備的PCC盡管FⅦ含量較低，但其Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ 3種凝血因子均衡度明顯優(yōu)于目前國(guó)內(nèi)制品(FⅡ：1.44～3.62IU/1IU FⅨ；FⅩ：1.27～4.11IU/1IU FⅨ)[21]。國(guó)際上有已上市的3-factor PCC(低七因子凝血酶原復(fù)合物)制品[20]，本研究所探討的實(shí)驗(yàn)條件是否為此制品的制備提供新的方法，有待進(jìn)一步深入研究。

此外，我們發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)制備出的PCC中蛋白C的含量相對(duì)較高，表明Capto DEAE凝膠對(duì)抗凝蛋白的吸附較強(qiáng)，從而使得蛋白C收率較高。

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(編校：王儼儼)

撤稿聲明

經(jīng)核實(shí)，原刊載于本刊2015年2月第2期名為“開口箭對(duì)S-180細(xì)胞和實(shí)體瘤的抑制作用研究”一文，第一作者為青海省第五人民醫(yī)院戚利坤，盜用南京醫(yī)科大學(xué)洪鳴教授國(guó)家自然科學(xué)基金號(hào)，且文章內(nèi)容存在嚴(yán)重學(xué)術(shù)不端行為。因此，本編輯部本著對(duì)作者、讀者負(fù)責(zé)的態(tài)度，對(duì)此文進(jìn)行撤稿處理，并在本刊官網(wǎng)、知網(wǎng)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)等撤除該稿件。

特此聲明！

Preparation technology of new gel-purified prothrombin complexes concentrates

ZHOU Min1, ZENG Ren-yong2, LIU Yuan-yuan2, LI Chang-qing2,CAO Hai-jun2Δ?, HE Ze-chao1Δ?

(1.College of Chemical Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, China; 2.Institute of Blood Transfusion,Chinese Academy of Medical Science, Chengdu 610052, China)

ObjectiveTo study the process conditions for new gel Capto DEAE ion exchange chromatography to purify prothrombin complexes concentrates.MethodsAfter removal of cryoprecipitate by centrifugation, healthy human plasma was mixed with DEAE-Sephadex A-50 gel. After that, the gel were washed and eluted to obtain eluate; then, the eluate, after being ultrafiltered, was loaded on a column packed with Capto DEAE-gel for chromatography to prepare PCC which was later determined for activities of coagulation factors Ⅱ,Ⅶ,Ⅸ,Ⅹ and anticoagulation protein C, with their yield calculated. Besides, the protein concentration of PCC was determined using the Bradford method, based on which the specific activity of the four coagulation factors and protein C were calculated. According to the results, purification effect of Capto DEAE-gel on the PCC was analyzed.ResultsUnder different experimental conditions, the yield and purity of the coagulation factors FⅡ,FⅨ and FⅩ were high, and the equilibrum degree of the three factors was good; however, the yield and purity of coagulation factor FⅦ were very low. When the three variables (sodium citrate, NaCl and pH) in balanced solution, washing solution and elution were 0.020-0.028 mol/L, 0.10-0.15 mol/L and 6.9-7.2；0.012-0.020 mol/L, 0.10-0.15 mol/L and 6.9-7.2；0.005-0.012 mol/L, 2.4 mol/L and 7.2-7.5 , respectively,the yield and purity of PCC prepared from Capto DEAE-gel were good. Under this condition, yield of factor Ⅸ was (74.40±10.89)% and purity of factor Ⅸ was (3.31±0.31) IU/mL. Under different experimental conditions, yield and specific activity of anticoagulant protein C were higher.ConclusionThe purity of four coagulation factors and anticoagulation protein C of PCC prepared by the new method that combined the batch adsorption with DEAE-sephadex A-50 was combined with column chromatography packed with Capto DEAE-gel are higher than those prepared by the routine procedure. Furthermore, the PCC are better than these products obtained by traditional process, whose purity are 2.17-3.31IU/mg. Therefore, these studies will lay the groundwork for exploring novel preparation process of producing PCC.

prothrombin complex concentrate; Capto DEAE-gel; ion-exchange column chromatography

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.11.058

四川省科技支撐計(jì)劃(2014SZ0123)

周敏，女，碩士，研究方向：生物工程，E-mail：ZM_wendy@126.com；曹海軍，通信作者，男，碩士，副主任技師，研究方向：血液生化與分子生物學(xué)研究，E-mail：chjr007@163.com；何澤超，共同通信作者，男，博士，副教授，研究方向：生化產(chǎn)品分離、污染物的生物凈化，E-mail：hezechao@scu.edu.cn。

Q819；TQ464.8；R457.1+4

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