結(jié)核分枝桿菌IgG抗體蛋白芯片對(duì)活動(dòng)性與非活動(dòng)性結(jié)核患者療效的評(píng)價(jià)

宋能，劉焰，段元山，馬杰Δ

(1.湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430015；2.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)系，湖北 武漢 430071)

結(jié)核分枝桿菌IgG抗體蛋白芯片對(duì)活動(dòng)性與非活動(dòng)性結(jié)核患者療效的評(píng)價(jià)

宋能1，劉焰2，段元山1，馬杰1Δ

(1.湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430015；2.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)系，湖北 武漢 430071)

目的 探討結(jié)核分枝桿菌IgG抗體蛋白芯片用于活動(dòng)性結(jié)核患者與非活動(dòng)性結(jié)核患者的診斷價(jià)值。方法 采用結(jié)核分枝桿菌IgG抗體蛋白芯片分別對(duì)湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科178例活動(dòng)性結(jié)核病患者和79例非活動(dòng)性結(jié)核病患者以及92例健康對(duì)照血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 結(jié)核分枝桿菌IgG抗體蛋白芯片對(duì)結(jié)核病總陽(yáng)性率為58.4%；3項(xiàng)蛋白的聯(lián)合診的輔助診斷價(jià)值高于單項(xiàng)蛋白的輔助診斷價(jià)值；16kD蛋白對(duì)非活動(dòng)性結(jié)核陽(yáng)性率為16.4%，優(yōu)于其對(duì)活動(dòng)性結(jié)核3.4%的陽(yáng)性率(P<0.05)。結(jié)論 結(jié)核分枝桿菌IgG抗體蛋白芯片對(duì)活動(dòng)性結(jié)核和非活動(dòng)性結(jié)核均具有一定的輔助診斷價(jià)值，在非活動(dòng)性結(jié)核患者中16kD蛋白陽(yáng)性率略高于38kD蛋白(P<0.05)。

結(jié)核分枝桿菌；蛋白芯片；非活動(dòng)性結(jié)核患者；結(jié)核診斷

結(jié)核病目前仍是發(fā)展中國(guó)家亟待解決的公共健康問(wèn)題。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查報(bào)告顯示2012年全球約有130萬(wàn)人死于結(jié)核病[1]。2014年我國(guó)結(jié)核病發(fā)病率的世界排名雖較2013年下降，但仍高居世界第三位，所以早期明確的診斷對(duì)結(jié)核病的治療及預(yù)后有著極其重要的意義[2]。目前臨床上應(yīng)用的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)主要有結(jié)核菌素(PPD)試驗(yàn)、痰細(xì)菌培養(yǎng)、抗酸染色、PCR、IFN-γ的T-Spot檢測(cè)及基因芯片等方法。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外相繼報(bào)道使用阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)脂多糖、純化蛋白抗原A95，結(jié)核菌重組蛋白抗原38kD[3]、16kD[4]和14kD等在結(jié)核病抗體檢測(cè)中的作用。我國(guó)研發(fā)出的基因工程表達(dá)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis)重組蛋白抗原16kD、38kD、LAM蛋白，利用蛋白芯片技術(shù)制成結(jié)核分枝桿菌相應(yīng)抗體檢測(cè)試劑盒[5]。本次研究采用國(guó)內(nèi)南京大淵公司的蛋白芯片試劑盒進(jìn)行臨床檢測(cè)試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)其用于本院活動(dòng)性結(jié)核患者與非活動(dòng)性結(jié)核患者的輔助診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年4月～2016年10月間在湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院臨床各科室送檢至檢驗(yàn)科的成年結(jié)核病患者257例，其中肺結(jié)核129例，淋巴結(jié)核64例，骨結(jié)核23例，結(jié)核性腹膜炎17例，結(jié)核性心包炎9例，結(jié)核性腦膜炎7例，結(jié)核性胸膜炎6例，腎結(jié)核2例。其中活動(dòng)性結(jié)核患者178例，其中男性108例，女性70例，年齡范圍19～93歲，平均年齡(42.4±12.5)歲，病程2～36個(gè)月，平均病程(6.5±4.9)個(gè)月。本文將既往結(jié)核患者經(jīng)聯(lián)合用藥后無(wú)癥狀復(fù)查者，定義為本研究的非活動(dòng)性結(jié)核病患者共79例，其中男性46例，女性33例，年齡范圍為20～82歲，平均年齡(44.56±11.8)歲，病程為5～60個(gè)月，平均病程(10±6.2)個(gè)月。選取2016年7月～2016年10月間在湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院體檢中心體檢的健康成年人92例，其中男性56例，女性36例，年齡范圍23～65歲，平均年齡(43.11±8.4)歲，作為本研究的健康對(duì)照。本研究經(jīng)患者知情同意，并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

結(jié)核患者參照Thuaites診斷標(biāo)準(zhǔn)及Thuaites診斷指數(shù)[6-7]為依據(jù)并將其納入：①肺結(jié)核的診斷：a.胸部X線肺葉陰影；b.增強(qiáng)CT掃描結(jié)果與X線基本吻合；c.抗酸染色陽(yáng)性；d.抗結(jié)核治療癥狀有顯著改善。②其它部位結(jié)核的診斷：a.患病組織病原學(xué)檢查陽(yáng)性；b.血清T-Spot檢測(cè)陽(yáng)性；c.抗結(jié)核治療癥狀有顯著改善。各組患者在年齡、性別等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器：結(jié)核分枝桿菌IgG抗體檢測(cè)試劑盒(南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)，國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2011第3400173號(hào))。大淵PBT-X4型生物芯片識(shí)別儀系統(tǒng)Potomac PBT-X4 Bio-chip Scanner System(南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司生產(chǎn))。

1.2.2 樣本的采集：使用黃頭促凝血負(fù)壓管抽取患者靜脈血4～5 mL(溶血樣本和高脂血樣本不宜)，取血后顛倒試管2～3次以便促凝劑與血液充分混勻，靜置3～5 min后使用離心機(jī)離心，離心條件為：轉(zhuǎn)數(shù)3 500 r/min離心血液6 min。離心后，取上層不少于150 μL血清用于檢測(cè)。

1.2.3 檢驗(yàn)方法：從冰箱中取出芯片與配套試劑，室溫放置10 min平衡至室溫，從鋁箔袋中取出芯片，在芯片上標(biāo)注待檢者姓名或編號(hào)。在平衡至室溫的前提下，在蛋白芯片窗口中用加樣槍加入200 μL試劑A(主要活性成分：2%吐溫、Tris緩沖液)；待窗口中的試劑A浸潤(rùn)完后，室溫靜置1 min后用加樣槍加入樣本血清100 μL；待樣本血清完全滲入后，及時(shí)用加樣槍加入300 μL試劑B(主要活性成分：2%吐溫、Tris緩沖液)；待試劑B完全滲入后，用加樣槍加入500 μL試劑C(主要活性成分：金標(biāo)抗人IgG)；待試劑C完全滲入后，最后用加樣槍加入300 μL試劑D(主要活性成分：2%吐溫、Tris緩沖液)；4種試劑以及樣本加入完成后，于30 min內(nèi)將芯片置于大淵PBT-X4型生物芯片識(shí)別儀系統(tǒng)相應(yīng)位置，安生物芯片識(shí)別儀檢測(cè)操作步驟進(jìn)行結(jié)果分析，系統(tǒng)將自動(dòng)判讀出檢測(cè)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，2組患者的陽(yáng)性率比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組結(jié)核分枝桿菌抗原陽(yáng)性率的比較 采用χ2檢驗(yàn)得出，對(duì)照組與活動(dòng)性結(jié)核組的陽(yáng)性率的差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對(duì)照組與非活動(dòng)性結(jié)核陽(yáng)性率也具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。活動(dòng)性結(jié)核的陽(yáng)性率為71.3%明顯高于非活動(dòng)性結(jié)核的陽(yáng)性率29.1%(P<0.05)，結(jié)核分枝桿菌IgG抗體蛋白芯片對(duì)結(jié)核病總陽(yáng)性率為58.4%。

表1 結(jié)核分枝桿菌抗原陽(yáng)性率的比較Tab.1 Comparison of M. tuberculosis antigen positive rate

2.2 兩類結(jié)核病與3種抗原蛋白檢測(cè)陽(yáng)性率的比較 結(jié)果如表2中所示：LAM蛋白在活動(dòng)性結(jié)核(陽(yáng)性率67.4%)與非活動(dòng)性結(jié)核(陽(yáng)性率24%)檢測(cè)結(jié)果中其陽(yáng)性率均為最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，活動(dòng)性結(jié)核患者16kD蛋白16.4%的陽(yáng)性率明顯高于非活動(dòng)性結(jié)核患者16 kD蛋白3.4%的陽(yáng)性率，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 不同結(jié)核抗體蛋白檢測(cè)陽(yáng)性率的比較[n(%)]Tab.2 Comparison positive rate of different M.tuberculosis antibody proteins[n(%)]

3 討論

結(jié)核病是由M.tuberculosis引起的一種慢性傳染病，該病嚴(yán)重威脅人類健康。早期結(jié)核患者往往僅有低熱、乏力、消瘦等一般性癥狀，特別是目前發(fā)病率越來(lái)越高的肺外結(jié)核，如癥狀并不明顯的肝結(jié)核、胰結(jié)核、腎結(jié)核、腹膜結(jié)核、骨結(jié)核等，使傳統(tǒng)的結(jié)核病診斷手段例如X-線檢查[8]、積液痰液微生物學(xué)檢查[9]等陽(yáng)性率并不盡如人意。雖然近年來(lái)有很多新技術(shù)例如ddPCR對(duì)結(jié)核病的診斷靈敏度有很大的提升[10]，但是迫于成本壓力使得其普及仍有待時(shí)日。單項(xiàng)輔助診斷的各種缺點(diǎn)，使大量結(jié)核病患者未能被及時(shí)診斷而延誤了治療時(shí)機(jī)，導(dǎo)致體內(nèi)大量結(jié)核結(jié)節(jié)形成，這些結(jié)核結(jié)節(jié)的存在一直被懷疑是導(dǎo)致非活動(dòng)性結(jié)核患者后期結(jié)核復(fù)發(fā)的根源[11]。

LAM是M.tuberculosis細(xì)胞壁脂多糖的主要成分，分子量為17.5kDa[12]。它的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包含三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域。在人體內(nèi)慢性生長(zhǎng)的結(jié)核分枝桿菌菌體表面的糖脂結(jié)構(gòu)中，部分LAM鏈的非還原性末端有相應(yīng)的帽結(jié)構(gòu)存在，這種結(jié)構(gòu)能改變?nèi)梭w免疫系統(tǒng)對(duì)M.tuberculosis的免疫調(diào)節(jié)方式。國(guó)內(nèi)有實(shí)驗(yàn)證明，M.tuberculosis菌體表面的LAM結(jié)構(gòu)能幫助它抑制巨噬細(xì)胞對(duì)其的殺傷，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)核分枝桿菌之后，使其在巨噬細(xì)胞內(nèi)潛伏并生存[13]。作為檢測(cè)M.tuberculosis的特異分子，由于LAM在其它類型的分枝桿菌表面含量很低，無(wú)法像M.tuberculosis一樣刺激人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生大量的特異性抗體，故其特異度要明顯優(yōu)于其它抗原分子。38 kD蛋白是M.tuberculosis蛋白抗原之一，以一種類脂蛋白，它對(duì)M.tuberculosis的生長(zhǎng)具有重要的生化和調(diào)節(jié)作用[14]。Haslov等比較了包括38 kD蛋白在內(nèi)(不包括LAM)的五種結(jié)核分枝桿菌抗原，他發(fā)現(xiàn)38 kD蛋白所產(chǎn)生的免疫效應(yīng)最強(qiáng)，而且缺乏38 kD蛋白抗體的血清很難與結(jié)核分枝桿菌的其他抗原產(chǎn)生反應(yīng)[15-16]。關(guān)于16 kD蛋白的報(bào)道，并不如以上兩種蛋白多，對(duì)于該蛋白多見(jiàn)于休眠期結(jié)核分枝桿菌中，而在其它非結(jié)核分枝桿菌中不存在該蛋白的表達(dá)，故其它分枝桿菌對(duì)機(jī)體的感染并不能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗16 kD蛋白抗體[5]。

結(jié)核蛋白芯片技術(shù)是以微孔濾膜為載體, 同時(shí)將結(jié)核菌的細(xì)胞壁脂多糖LAM抗原和結(jié)核菌16 kD和38 kD抗原固定在微孔濾膜上, 利用微孔濾膜的滲濾、濃縮、凝集作用，借助抗原抗體反應(yīng)與患者血清中的特異性抗體結(jié)合，再與人源性抗體混合，利用膠體金法，在微孔濾膜上形成紫紅色斑點(diǎn)。反應(yīng)完成后30 min內(nèi)，使用廠家提供的芯片識(shí)別儀掃描并使用芯片識(shí)別系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析，同時(shí)檢測(cè)出患者血清中所含的細(xì)胞壁脂多糖LAM的抗體、38 kD抗體和16 kD抗體。這3種抗體的同步檢測(cè)，對(duì)結(jié)核分枝菌感染具有輔助診斷價(jià)值[17]。除了對(duì)肺結(jié)核的診斷，國(guó)內(nèi)一些學(xué)者通過(guò)分析病例也證明了結(jié)核蛋白芯片對(duì)肺外結(jié)核患者診斷的優(yōu)越性[5]。

本研究結(jié)果顯示結(jié)核蛋白芯片檢測(cè)總的陽(yáng)性率為45.0%。在患病部位的結(jié)核病人中陽(yáng)性率差別較大,但無(wú)論是在活動(dòng)性還是非活動(dòng)性結(jié)核患者中LAM蛋白都比16 kD蛋白和38 kD蛋白的陽(yáng)性率要高(P<0.05)。LAM作為M.tuberculosis細(xì)胞壁的表面抗原，其特異性強(qiáng)，有較強(qiáng)的免疫源性，在感染的宿主內(nèi)，常會(huì)引起強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)，能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG型的抗LAM抗體。故無(wú)論是活動(dòng)性還是非活動(dòng)性結(jié)核患者，其陽(yáng)性率都為最高(P<0.05)?；顒?dòng)性結(jié)核患者的檢測(cè)結(jié)果顯示，3種抗體以LAM蛋白最為靈敏,38 kD蛋白次之,16 kD蛋白最差；對(duì)非活動(dòng)性結(jié)核患者的檢測(cè)顯示，3種抗體仍以LAM蛋白最為靈敏，但是16 kD蛋白次之，38 kD蛋白最差。16 kD蛋白對(duì)非活動(dòng)性結(jié)核患者的陽(yáng)性率明顯高于結(jié)核患者(P<0.05)，其原因有待進(jìn)一步探索。

M.tuberculosisIgG抗體蛋白芯片檢測(cè)速度快，采取血液樣本離心之后，只需要10 min左右就能判定出相應(yīng)抗體的陰陽(yáng)性，方便單人操作，提高了工作效率與檢驗(yàn)效率，公司提供配套的芯片灰度掃描儀，基本消除了肉眼判讀的誤差，質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)量化，相比其他的結(jié)核檢測(cè)具有一定的優(yōu)勢(shì)，其特異性也基本令人滿意。并且該芯片采用了3種抗體聯(lián)合檢測(cè)，相比單抗體檢測(cè)提高了檢測(cè)的陽(yáng)性率，而且該技術(shù)不受外國(guó)專利壟斷，價(jià)格親民，是一種值得推廣的結(jié)核檢測(cè)技術(shù)。

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(編校：師維康)

Evaluation ofmycobacteriumtuberculosisIgG antibody protein chip in patients with active and inactive tuberculosis

SONG Neng1, LIU Yan2, DUAN Yuan-shan, MA Jie1Δ

(1. Clinical Laboratory, Hubei Provincial Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine, Wuhan 430015, China; 2. Department of Immunology, Wuhan University School of Basic Medical Sciences, Wuhan 430015, China)

ObjectiveTo explore protein microarray chip diagnostic value for patients with active and inactivetuberculosis.Methods178 cases of active patients tuberculosis and 79 cases of inactive tuberculosis patients and 92 cases of healthy control using protein microarray chip detection.ResultsTuberculosisprotein chip had a diagnostic value fortuberculosisand the positive rate is 58.4%; combined the diagnostic value of three kinds of proteins is higher than the diagnostic value of a single protein；16 kD protein of inactivetuberculosispositive rate was 16.4%, better than the positive rate of 3.4% for active tuberculosis (P<0.05).ConclusionTuberculosis protein chip has a diagnostic value for activetuberculosisand inactive tuberculosis. 16 kD protein positive rate more than 38 kD protein in patients with inactivetuberculosis(P<0.05).

M.tuberculosis; protein microarray chip; inactivetuberculosis; diagnosis oftuberculosis

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.050

宋能，男，碩士，檢驗(yàn)科醫(yī)師，研究方向：臨床免疫學(xué)與分子生物學(xué)診斷，E-mail：Soner2008@qq.com；馬杰，通信作者，女，碩士生導(dǎo)師，檢驗(yàn)科主任，研究方向：臨床免疫學(xué)與分子生物學(xué)檢驗(yàn)，E-mail：majie588@126.com。

R378.91+1；R825.2

A