DC-SIGN誘導(dǎo)的信號通路在HIV-1前病毒活化中的作用

李杰，靳昌忠，程林芳，劉福民，吳南屏Δ

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 感染內(nèi)科，浙江 溫州 325027；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310003)

DC-SIGN誘導(dǎo)的信號通路在HIV-1前病毒活化中的作用

李杰1，靳昌忠2，程林芳2，劉福民2，吳南屏2Δ

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 感染內(nèi)科，浙江 溫州 325027；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310003)

目的 研究HIV-1 gp120蛋白與DC-SIGN結(jié)合對HIV-1前病毒的活化作用及其信號通路機(jī)制。方法 將DC-SIGN表達(dá)質(zhì)粒和HIV-1 5’末端重復(fù)序列(5’LTR)報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以HIV-1 gp120蛋白、野生型HIV-1、VSV-G-pNL4.3假病毒分別刺激，檢測HIV-1 5’LTR的活性。慢性感染HIV-1的CEM-Bru 細(xì)胞轉(zhuǎn)染DC-SIGN表達(dá)質(zhì)粒，以HIV-1 gp120蛋白刺激, 檢測HIV-1 Tat mRNA和HIV-1 p24蛋白表達(dá)水平。特異性抑制ERK、P38 和NF-κB信號通路，再用gp120刺激DC-SIGN(+)CEM-Bru 細(xì)胞，檢測HIV-1前病毒的活化。結(jié)果 在DC-SIGN(+) 293T細(xì)胞中，HIV-1 5’LTR可以被HIV-1 gp120激活。HIV-1 gp120蛋白及DC-SIGN刺激DC-SIGN(+) CEM-Bru后，HIV-1 Tat mRNA和HIV-1 p24蛋白表達(dá)水平明顯升高，提示其早期和晚期HIV-1前病毒復(fù)制，用抗體阻斷DC-SIGN可抑制潛伏HIV-1活化。HIV-1 gp120/DC-SIGN通過NF-κB信號通路在激活潛伏HIV-1前病毒。結(jié)論 HIV-1 gp120可通過結(jié)合DC-SIGN激活NF-κB信號通路介導(dǎo)HIV-1前病毒活化。

HIV-1；DC-SIGN；病毒潛伏；信號通路；NF-κB

高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active anti-retroviral treatment，HAART)是目前治療艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的唯一有效的手段，但僅使患者外周血病毒載量降至目前檢測不到的水平，不能完全清除病毒，患者體內(nèi)仍有低水平的病毒復(fù)制[1]。其主要原因是HIV-1可以在特定的靶細(xì)胞內(nèi)基因沉默，形成潛伏性感染，不表達(dá)任何特征性蛋白，難以檢測和識別[2-4]。一旦停止藥物治療，病毒會迅速反彈，這是目前HIV-1難以在體內(nèi)被完全清除的一個重要原因[4]。HIV-1的主要潛伏儲藏庫是靜息CD4+T淋巴細(xì)胞，此外，淋巴結(jié)中的樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)細(xì)胞也被認(rèn)為是HIV-1的儲藏庫[5]。作為粘膜中首先抵御HIV-1的固有免疫細(xì)胞，在HIV-1的感染、傳染以及病毒本身長期存活有至關(guān)重要的作用[6-8]，因此，清除DCs儲藏庫是根治艾滋病的重要手段之一。

樹突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子-3-非整合素(Dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin，DC-SIGN)是一種表達(dá)于DCs表面的C型凝集素，與1型人類免疫缺陷病毒糖蛋白120(human immune deficiency virus-1 glycoprotein 120，HIV-1 gp120)有高親和力，在外周循環(huán)中捕獲HIV-1，并促進(jìn)靶細(xì)胞感染[9-10]。DC-SIGN識別多種病原體，包括1型人類免疫缺陷病毒(human immune deficiency virus-1，HIV-1)，并誘導(dǎo)多種信號通，如胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-related kinase，ERK)和活化B細(xì)胞的核因子κB輕鏈增強(qiáng)子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB)信號通路，從而調(diào)節(jié)各種細(xì)胞因子分泌和免疫反應(yīng)[11]。潛伏性HIV-1再活化涉及多個信號通路，例如ERK和NF-κB信號通路[12-13]。HIV-1再活化及DC-SIGN信號傳遞均涉及上述信號通路，因此我們推測DC-SIGN誘導(dǎo)的信號通路可能參與HIV-1前病毒活化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：293T細(xì)胞購自ATCC，HIV-1慢性感染的CEM-SS細(xì)胞(感染了HIV-1Bru)及HIV-1毒株(HXB2)和VSV-G-pNL4.3假病毒由上海巴斯德研究所周Paul教授贈送。熒光素酶報告質(zhì)粒pGL-3/Basic、內(nèi)對照質(zhì)粒pRL-TK和雙熒光素酶活性檢測試劑盒均購自Promega公司。熒光定量PCR檢測試劑盒購自TAKARA公司，重組HIV-1 gp120蛋白、HIV-1 p24 ELISA檢測試劑盒購自R&D公司，抗DC-SIGN單克隆抗體、抗CCR5單克隆抗體、NF-κB、p38 MAPK和MEK1/2及其磷酸化抗體購自Abcam公司。NF-κB抑制劑Helenalin、p38 MAPK信號通路阻斷劑SB202190、MEK1/2抑制劑PD98059購自Merck公司，使用濃度分別為1 μM(Helenalin)、5 μM(SB202190)、50 μM(PD98059)。

1.1.2 儀器：ABI-2720 PCR儀(美國ABI公司)，電熱恒溫水槽JXH-308D(廣州市金鉉映電子科技開發(fā)有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)Gel DocTM XR(美國BIO-RAD)，GloMax96微孔板發(fā)光檢測儀E6501(美國Promega公司)；Amaxa Nucleofector電轉(zhuǎn)儀Nucleofector II Manual(德國lonza公司)，BD流式細(xì)胞儀FACSAria III(美國BD公司)，Western bloting儀器(Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra 1658001，美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染：從健康人外周血和HIV-1培養(yǎng)細(xì)胞中提取全基因組DNA作為模板，用表1中所示引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增DC-SIGN和HIV-15’LTR基因片段，表格中下劃線為酶切識別點(diǎn)。所用反應(yīng)體系為：模板1 μL，10 mM引物各2 μL，2×PCR混合液25 μL，加去離子水至50 μL，反應(yīng)條件均為：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。將測序正確的DC-SIGN和HIV-1 5’LTR PCR片段分別用Bam HI/Xba I和Mlu I/Xho I雙酶處理，得到相應(yīng)的酶切片段，分別克隆入pCDNA3.1(+)真核表達(dá)質(zhì)粒和pGL-3熒光素酶報告質(zhì)粒的BamHI/XbaI和MluI/XhoI酶切位點(diǎn)之間，得到DC-SIGN的真核表達(dá)質(zhì)粒和HIV-1 5’LTR的熒光素酶報告質(zhì)粒。將兩種質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染進(jìn)培養(yǎng)好的293T細(xì)胞，將DC-SIGN的真核表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染至HIV-1慢性感染的CEM-SS細(xì)胞。使用Amaxa Nucleofector電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)，所用細(xì)胞量為6×106，質(zhì)粒用量為0.3 μg，pRL-TK質(zhì)粒為0.03 μg。將轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染DC-SIGN質(zhì)粒的293T細(xì)胞及CEM-SS細(xì)胞在以下試驗(yàn)中按需設(shè)為對照組。

DC-SIGN F：5’-CTCGGATCCATGAGTGACTCCAAGGAAC-3’

DC-SIGN R：5’-GCTCTAGATGAAGTTCTGCTACGCAGGA-3’

HIV-1 5’LTR F：5’-TATTACGCGTTGGAAGGGCTAATTTGGTC-3’

HIV-1 5’LTR R：5’-GTGCTCGAGTGCTAGA-GATTTTCCACACT-3’

HIV-1 Tat F：5’-ATGGCAGGAAGAAGCGGAG-3’

HIV-1 Tat R：5’-ATTCCTTCGGGCCTGTCG-3’

GAPDH F：5’-CCATGTTCGTCATGGGTGTG-3’

GAPDH R：5’-GGTGCTAAGCAGTTGGTGGTG-3’

限制酶識別點(diǎn)：BamHI:GGATCC;XbaI:TCTAGA;MluI:ACGCGT;XhoI:CTCGAG

1.2.2 熒光素酶活性檢測：將轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒的293T細(xì)胞分別用10 μg/mL的HIV-1 gp120蛋白、2倍TCID50的HIV-1毒株和VSV-G-pNL4.3假病毒(不表達(dá)HIV-1包膜蛋白，gp120蛋白陰性)刺激，以單獨(dú)轉(zhuǎn)染HIV-1 5’LTR熒光素酶報告質(zhì)粒的293T細(xì)胞做對照，48 h后檢測熒光素酶活性。用雙熒光素酶活性檢測試劑盒，在GloMax96微孔板發(fā)光檢測儀上檢測熒光素酶活性，按照試劑盒說明書和儀器使用說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 HIV-1復(fù)制檢測：將轉(zhuǎn)染好DC-SIGN真核表達(dá)質(zhì)粒的HIV-1慢性感染的CEM-SS細(xì)胞用HIV-1 gp120蛋白刺激24h，濃度為10 μg/mL。提取細(xì)胞中的總RNA，采用PrimeScipt逆轉(zhuǎn)試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit RR037A，TaKaRa)和SYBR Green定量檢測試劑(SYBR Premix Ex Taq RR420A，TaKaRa)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，檢測HIV-1 Tat mRNA表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參，所用引物見表1所示。采用R&D公司HIV-1 p24蛋白ELISA檢測試劑盒檢測HIV-1 p24蛋白的表達(dá)水平，按照說明書所述步驟操作。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測：將收取的細(xì)胞用PBS緩沖液清洗2遍，每管加入10 μL,25～50 μg/mL DC-SIGN一抗孵育1 h，用PBS緩沖液清洗2遍，加入兔抗鼠熒光二抗ALEX488孵育1 h，再用PBS緩沖液清洗2遍，用BD流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 Western blot檢測：將收取的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解，測定蛋白濃度后，按照每孔相同蛋白量上樣，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，用5%的脫脂牛奶封閉后，加入1～2 μg/mL的鼠抗人DC-SIGN一抗孵育4 ℃過夜，用HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育2 h后進(jìn)行顯色曝光。提取的胞漿蛋白和核蛋白同法檢測，同時檢測β-Actin和Tubulin作為包漿蛋白和核蛋白的參照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析，所有細(xì)胞培養(yǎng)和熒光素酶檢測數(shù)據(jù)均來自3次以上獨(dú)立試驗(yàn)，熒光素酶活性以相對于內(nèi)對照質(zhì)粒pRL-TK的倍數(shù)表示，分組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC-SIGN誘導(dǎo)HIV-1 5’LTR激活 轉(zhuǎn)染了DC-SIGN質(zhì)粒的293T細(xì)胞株可以高水平表達(dá)DC-SIGN，見圖1A。相對于DC-SIGN(-)293T細(xì)胞株(對照組)，HIV-1 gp120和野生型HIV-1可提高DC-SIGN(+)的293T細(xì)胞株HIV-1 5’LTR分子的活性(前者刺激前平均熒光素酶活性為8.16(1.31，刺激后為59.83±7.31；后者刺激前平均熒光素酶活性為6.16±1.31，刺激后為42.13±6.82，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而VSV-G-pNL4.3假病毒(不表達(dá)gp120)刺激前平均熒光素酶活性為1.67±1.02，刺激后為2.96±1.87不能激活HIV-1 5’LTR分子，見圖1B。通過特異性阻斷gp120或野生型HIV-1同DC-SIGN結(jié)合后，發(fā)現(xiàn)HIV-1 5’LTR不能被gp120或野生型HIV-1激活(前者gp120組刺激前平均熒光素酶活性為7.52±1.55，刺激后為10.62±2.12；后者野生型HIV-1組刺激前平均熒光素酶活性為4.36±0.31，刺激后為12.52±2.35)，見圖1C。

圖1 DC-SGIN誘導(dǎo)的HIV-15’LTR活化A：轉(zhuǎn)染或不轉(zhuǎn)染表達(dá)DC-SIGN質(zhì)粒于293T細(xì)胞株(Actin作為內(nèi)參；MFI：平均熒光強(qiáng)度)；B：轉(zhuǎn)染表達(dá)HIV-1 5’LTR質(zhì)粒的293T細(xì)胞株，分別被gp120、野生型HIV-1(HXB2)和VSV-G-pNL4.3刺激；C：用特異性DC-SIGN中和性抗體預(yù)處理各組293T細(xì)胞株后，分別gp120、野生型HIV-1(HXB2)和VSV-G-pNL4.3刺激，其轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達(dá)的HIV-1 5 ’LTR活化對比DC-SIGN(+)：轉(zhuǎn)染了表達(dá)DC-SIGN質(zhì)粒的293T細(xì)胞株；DC-SIGN(-)：未轉(zhuǎn)染DC-SIGN表達(dá)質(zhì)粒的293T細(xì)胞株**P<0.01，與DC-SIGN(-)組對比Fig.1 DC-SGIN induced HIV-15’LTR activationA:transfected or non-transfected 293T cell line expressing DC-SIGN plasmid in 293T cell line (Actin as internal reference; MFI: mean fluorescence intensity); B: transfected 293T cell line expressing HIV-1 5’LTR plasmid was transfected with gp120, HIV-1 (HXB2) and VSV-G-pNL4.3, respectively; C:After pretreatment of 293T cells with specific DC-SIGN neutralizing antibody, gp120, wild-type HIV-1 and VSV- G-pNL4.3 stimulated its transfected plasmid to express the HIV-1 5 ’LTR activating contrast DC-SIGN(+): 293T cell line expressing DC-SIGN plasmid was transfected;DC-SIGN(-): 293T cell line not transfected with DC-SIGN expression plasmid;**P<0.01, compared with DC-SIGN(-) group

2.2 DC-SIGN誘導(dǎo)的HIV-1前病毒重活化作用 HIV-1 gp120蛋白刺激轉(zhuǎn)染DC-SIGN表達(dá)質(zhì)粒的CEM-SS細(xì)胞后，HIV-1早期活化指標(biāo)Tat mRNA的表達(dá)水平和晚期活化指標(biāo)p24蛋白的表達(dá)水平均顯著升高[Tat mRNA表達(dá)水平，DC-SIGN(+)mock組為(9.31±1.10)%，DC-SIGN(+)+gp120組為(28.55(5.53)%；p24蛋白表達(dá)水平DC-SIGN(+)mock組為(0.41(0.11)log(1/trans)，DC-SIGN(+)+gp120組為(2.35±0.75)log(1/trans)，(P<0.01)，見圖2A。

圖2B為對HIV-1 p24蛋白水平的影響，表明存在HIV-1的完整復(fù)制；而未轉(zhuǎn)染DC-SIGN的CEM-SS細(xì)胞兩個指標(biāo)表水平均無顯著升高[Tat mRNA表達(dá)水平，DC-SIGN(-)mock組為(7.41±1.11)%，DC-SIGN(-)+gp120組為(16.22±1.51)%，p24蛋白表達(dá)水平DC-SIGN(-)mock組為(0.46±0.13)log(1/trans)，DC-SIGN(-)+gp120組為(1.26±0.21)log(1/trans)]；用抗體阻斷DC-SIGN與HIV-1 gp120蛋白的結(jié)合以后，HIV-1的復(fù)制顯著降低[Tat mRNA 表達(dá)水平DC-SIGN(+)+gp120組為(28.55±5.53)%，DC-SIGN(+)+DC-SIGN抑制劑+gp120組(18.45±2.83)%，p24表達(dá)水平DC-SIGN(+)+gp120組為(2.35±0.75)log(1/trans)，DC-SIGN(+)+DC-SIGN抑制劑+gp120組為(1.35±0.21)log(1/trans)]，表明HIV-1的激活是由DC-SIGN介導(dǎo)的；用CCR5抗體阻斷CCR5與HIV-1 gp120蛋白的結(jié)合以后，再用HIV-1 gp120蛋白刺激，發(fā)現(xiàn)HIV-1的復(fù)制仍然可以被顯著激活[Tat mRNA于mock DC-SIGN(+)組為(9.31±1.10)%，DC-SIGN(+)+gp120+CCR5抑制劑組為(25.21±3.31)%，HIV-1 p24于mock DC-SIGN(+)組0.41±0.09(1/trans)，DC-SIGN(+)+gp120+CCR5抑制劑組為(2.12±0.21)log(1/trans)]，(P<0.01)，病毒復(fù)制水平與未阻斷CCR5細(xì)胞相比無顯著差異。

圖2 DC-SIGN信號通路對HIV-1前病毒的活化作用A:對HIV-1 tat mRNA相對表達(dá)水平的影響，以GAPDH作為內(nèi)參；B:對HIV-1 p24蛋白水平的影響**P<0.01,與DC-SIGN(-)+gp120組或DC-SIGN(-)+gp120+CCR5抑制劑組比較；△△P<0.01，與DC-SIGN(+)+gp120+ DC-SIGN抑制劑組比較Fig.2 Activation of HIV-1 provirus by DC-SIGN signaling pathwayA:on the relative expression of HIV-1 tat mRNA, GAPDH as the internal reference;B:on HIV-1 p24 protein levels**P<0.01, compared with DC-SIGN(-)+gp120 group or compared with DC-SIGN(-)+gp120 group+CCR5 inhibitor;△△P<0.01, compared with DC-SIGN(+)+gp120+DC-SIGN inhibitor group

2.3 DC-SIGN介導(dǎo)HIV-1前病毒重活化的信號通路機(jī)制 DC-SIGN介導(dǎo)的信號通路主要包括ERK、p38 MAPK和NF-κB等信號通路，先用3種信號通路的阻斷劑處理HIV-1慢性感染的CEM-SS細(xì)胞(轉(zhuǎn)染DC-SIGN質(zhì)粒)，再用gp120刺激。HIV-1慢性感染的CEM-SS細(xì)胞為mock組(對照組，設(shè)定值1)，其它分組見圖3A、3B，檢測各分組Tat mRNA、HIV-1 p24表達(dá)水平，結(jié)果見圖3A，對HIV-1 tat mRNA相對表達(dá)水平的影響。

圖3 不同信號通路阻斷劑對DC-SIGN誘導(dǎo)的HIV-1前病毒活化的影響**P<0.01，與DC-SIGN(-)組相比；△△P<0.01，與加gp120組比較；▲▲P<0.01，與加gp120及NF-κB抑制劑組相比Fig.3 Effects of Different Signal Pathway Blockers on Activation of HIV-1 Previrus by DC-SIGN**P<0.01, compared with DC-SIGN(-) group；△△P<0.01, compared with gp120 group；▲▲P<0.01, compared with NF-kB inhibitor+gp120 group

NF-κB信號通路阻斷劑能夠顯著阻斷DC-SIGN介導(dǎo)的HIV-1前病毒活化，包括早期復(fù)制和晚期復(fù)制(P<0.05)，其它信號通路阻斷劑效果不明顯[mock組、gp120組、NF-κB抑制劑+gp120組、ERK抑制劑+gp120組、p38抑制劑+gp120組的HIV-1 Tat mRNA及p24表達(dá)水平分別為1.03±0.01、3.11±1.01、1.82±0.55、2.35±0.73、2.83±0.75；(82±21)、(490±181)、(253±83)、(429±125)、(433±126)pg/mL]。進(jìn)一步檢測gp120刺激DC-SIGN介導(dǎo)的信號通路蛋白活化情況，發(fā)現(xiàn)gp120刺激DC-SIGN可以引起磷酸化NF-κB p65蛋白的顯著升高(P<0.05)，其它信號通路蛋白磷酸化不明顯，表明NF-κB信號通路被激活，見圖4。

圖4 gp120刺激DC-SIGN介導(dǎo)的信號通路蛋白磷酸化Fig.4 Gp120 stimulates DC-SIGN mediated phosphorylation of signaling pathways

3 討論

目前清除HIV-1感染者體內(nèi)潛伏感染的細(xì)胞的方法多數(shù)是利用激活劑誘導(dǎo)靜息CD4+T細(xì)胞活化，例如促細(xì)胞分裂劑、細(xì)胞因子/趨化因子、抗CD45RO抗毒素等；或者通過上調(diào)基因表達(dá)的藥物來促進(jìn)病毒基因的復(fù)制，如組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑[14]。然而這些治療方法缺乏特異性，會引起很強(qiáng)的副作用[15]。此外，這些研究主要是針對靜息CD4+T細(xì)胞中前病毒的活化，目前對于DCs中前病毒的活化機(jī)制研究甚少。HIV-1對DC等髓系細(xì)胞的感染率很低，DCs儲藏庫數(shù)量更是有限，缺乏DCs細(xì)胞系和研究模型，這些因素可能是導(dǎo)致DCs儲藏庫研究較少的原因[16]。本研究采用了HIV-1慢性感染細(xì)胞CEM-SS細(xì)胞轉(zhuǎn)染DC-SIGN表達(dá)質(zhì)粒作為DCs模型。

非HIV病原體的協(xié)同感染可能是一種影響HIV復(fù)制的重要的外在因素[17]，DCs表達(dá)的DC-SIGN可結(jié)合多種病原體，包括HIV-1 gp120，然后可能通過誘導(dǎo)Raf-1參與的NF-κB亞單位p65和MEK/ERK的磷酸化，進(jìn)而引起免疫應(yīng)答[18]。DC-SIGN誘導(dǎo)的信號通路是否可以激活HIV-1前病毒尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)HIV-1 gp120與DC-SIGN結(jié)合后可誘導(dǎo)HIV-1 5’LTR的活化以及前病毒的復(fù)制，并且是通過gp120與DC-SIGN結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，排除了其它病原體成分及CCR5等其它受體的可能性。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1 gp120與DC-SIGN結(jié)合后通過誘導(dǎo)NF-κB信號通路來激活HIV-1前病毒，NF-κB信號通路阻斷劑可以阻斷HIV-1前病毒的活化和復(fù)制。NF-κB信號通路同時在DC-SIGN的表達(dá)中有重要作用。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)IL-4通過多種信號通路，包括ERK, JAK-STAT和NF-κB等信號通路，促進(jìn)DC-SIGN表達(dá)[19]。此外，DC-SIGN的表達(dá)水平可被多種微生物調(diào)節(jié)，其機(jī)制可能也是通過微生物感染引起的免疫應(yīng)答和NF-κB信號通路活化實(shí)現(xiàn)的。假設(shè)DC-SIGN的表達(dá)和潛伏性HIV-1的再活化可被共同的信號通路誘導(dǎo)，比如NF-κB信號通路。當(dāng)HIV-1前病毒再次活化，DC-SIGN表達(dá)也會上調(diào)，后者可促進(jìn)HIV-1復(fù)制和感染。DC-SIGN誘導(dǎo)NF-κB信號通路，從而活化DCs儲存庫中HIV-1前病毒活。但從HIV-1感染和傳播方面看，DC-SIGN的表達(dá)和潛伏HIV再活化之間關(guān)聯(lián)密切，兩者形成惡性循環(huán)。這可能是部分HAART治療艾滋病患者存在HIV-1持續(xù)低水平復(fù)制和耐藥的原因之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HIV-1通過gp120蛋白與DC-SIGN結(jié)合，引起NF-κB信號通路的活化，進(jìn)而誘導(dǎo)HIV-1前病毒的復(fù)制。這種活化機(jī)制在維持DCs儲藏庫中的作用有待進(jìn)一步研究，為制定清除HIV-1儲藏庫的策略提供思路。

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(編校：師維康)

Role of DC-SIGN induced signaling pathway in the activation of HIV-1 virus

LI jie1, JIN Chang-zhong2, CHENG Lin-fang2, LIU Fu-min2, WU Nan-ping2Δ

(1.Department of Infectious Disease, The Second Affiliated Hospitlal (Yuying Children’s Hospital) of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325027 China; 2.State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, the First Affiliated Hospital, College of Medicine of Zhejiang University, Hangzhou 310003, China)

ObjectiveTo explore the mechanism of latent human immunodeficiency ciency virus type 1 (HIV-1) infection is unclear, especially in dendritic cells (DC). We hypothesized that DC-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin (DC-SIGN) binds with HIV-1 may activate HIV-1 provirus.MethodsWe generated a model by transfecting 293T cells with a DC-SIGN expression plasmid and a HIV-1 5’ long terminal repeat (LTR) reporter plasmid, and then stimulated the 293T cells with HIV-1 gp120 protein, wild-type HIV-1 and VSV-G-pNL4.3 pseudotype virus (without gp120 protein). CEM-Bru cells were transfected with the DC-SIGN expression plasmid and stimulated by HIV-1 gp120 protein. Then HIV-1 replication was detected. The involvement of the ERK, p38 and NF-κB pathways signaling in this response were determined by inhibiting the pathways specifically and detecting the phosphorylation of the signaling kinase.ResultsThe HIV-1 5’ LTR was reactivated by HIV-1 gp120 in DC-SIGN-expressing 293T cells. After HIV-1 gp120 protein stimulation of the mold of CEM-Bru cells, the increasing expression of HIV-1 Tat mRNA and HIV-1 p24，which implies early and late HIV-1 provirus replication was reactivated by the HIV-1 gp120/DC-SIGN stimulation. HIV-1 gp120/DC-SIGN stimulation reactivates latent HIV-1 provirus via the NF-κB signal pathway.ConclusionHIV-1 gp120/DC-SIGN stimulation reactivates latent HIV-1 provirus via the NF-κB signal pathway.

HIV-1; DC-SIGN; viral latency; signaling pathways; NF-κB

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.010

國家自然科學(xué)基金(81402726)；浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃(2015C33183)

李杰，男，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：感染肝病，E-mail：jaly1111@126.com；吳南屏，通信作者，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：干擾素調(diào)控宿主限制因子SAMHD1表達(dá)的機(jī)制及其在HIV-1感染固有免疫應(yīng)答中的作用，E-mail：flwnp2013@163.com。

R322.2+5；R512.91

A