人乳頭瘤病毒HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在宮頸病變?cè)\斷中的價(jià)值

徐　多,何蓮芝

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院　婦產(chǎn)科，安徽　蕪湖　241001)

?

·臨床醫(yī)學(xué)·

人乳頭瘤病毒HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在宮頸病變?cè)\斷中的價(jià)值

徐多,何蓮芝

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽蕪湖241001)

【摘要】目的：評(píng)估HPV E6/E7 mRNA在宮頸病變?cè)\斷中的價(jià)值。方法：選取弋磯山醫(yī)院2014年9月～2015年9月HPV DNA陽(yáng)性且TCT檢測(cè)為慢性宮頸炎患者197例，行HPV E6/E7 mRNA及陰道鏡下宮頸組織病理學(xué)檢測(cè)。結(jié)果：197例HPV陽(yáng)性患者中，HPV E6/E7 mRNA的陽(yáng)性率為62.44%，敏感度為91.18%，特異度為52.17%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為50.14%，陰性預(yù)測(cè)值為91.89%。不同組織學(xué)分級(jí)中，HPV E6/E7 mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率在宮頸炎組與CINⅠ組、宮頸炎組與Ⅱ組、宮頸炎組與Ⅲ組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)與病理學(xué)診斷符合率為90%。結(jié)論：HPV E6/E7mRNA的表達(dá)與宮頸病變密切相關(guān)，可用于評(píng)估宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在早期或低級(jí)別病變中，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)預(yù)測(cè)高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生有著重要作用。

【關(guān)鍵詞】人乳頭瘤病毒；HPV E6/E7 mRNA；子宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.03.007

宮頸癌是目前女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，且是目前所有癌癥中唯一病因明確、可以早期預(yù)防和治療、并能根除的癌癥[1]。研究表明，高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的必要因素[2]。HPV是一組雙鏈DNA病毒，其基因組可分為早期轉(zhuǎn)錄區(qū)(E區(qū))、晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)及上游調(diào)節(jié)區(qū)，其中早期轉(zhuǎn)錄區(qū)的E6和E7為病毒的癌基因，可干擾細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡，與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。E6 蛋白通過(guò)招募E6AP 泛素酶[4]，與E6 相關(guān)蛋白(E6 associated protein，E6-AP) 結(jié)合到 p53 ，使p53失活，E7蛋白通過(guò)與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白pRb結(jié)合，使停止分裂的細(xì)胞重新進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[5]。目前臨床上較多采用HPV DNA 聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢測(cè)篩查宮頸癌，然而此類方法均以病毒DNA為檢測(cè)目標(biāo)，以此判定病毒類型及負(fù)荷量。實(shí)際上宮頸細(xì)胞病變并不僅與病毒類型及負(fù)荷量有關(guān)，更與致癌基因的活動(dòng)程度關(guān)系密切。HPV E6/E7蛋白作為病毒活動(dòng)指標(biāo)，對(duì)HPV的致癌活動(dòng)程度具有非常重要的臨床輔助診斷價(jià)值[6]。本文采用支鏈DNA(b-DNA)技術(shù)檢測(cè)HPV E6/E7 mRNA,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，探討HPV E6/E7 mRNA在宮頸病變?cè)\斷中的價(jià)值。

1資料與方法

1.1一般資料選取弋磯山醫(yī)院2014年9月～2015年9月HPV DNA陽(yáng)性且TCT檢測(cè)為慢性宮頸炎患者197例，排除有免疫抑制、慢性疾病、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)治療史者。所有患者同時(shí)行HPV E6/E7 mRNA及陰道鏡下宮頸組織活檢，以組織學(xué)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較分析。根據(jù)宮頸組織病理學(xué)結(jié)果分為CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組。

1.2方法

1.2.1樣本采集患者檢查前3 d不使用陰道內(nèi)藥物，不做陰道沖洗，24 h內(nèi)禁止性生活，并在非經(jīng)期檢查。窺陰器暴露宮頸后，使用宮頸細(xì)胞專用采樣刷插入宮頸口旋轉(zhuǎn)3～5周，停留10 s,將刷頭放入裝有專用保存液的瓶?jī)?nèi)并編號(hào)。

1.2.2HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)將采集樣本倒入15 mL離心管，3000 r/min離心5 min后倒掉上清液，用2 mL蒸餾水清洗后再次離心，去上清液，加入300 μL裂解劑和3 μL蛋白酶K，放入65℃恒溫箱30 min,取出后收集上清液，采用高危HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)讀取HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)值。

1.2.3病理組織學(xué)檢查所有197例患者均行陰道鏡檢查，先用低倍鏡觀察宮頸外觀、顏色、血管及有無(wú)白斑。3%醋酸棉球浸濕宮頸表面，3 min后觀察上皮血管，再用復(fù)方碘溶液棉球浸濕宮頸。在陰道鏡圖像異常區(qū)或碘實(shí)驗(yàn)陰性區(qū)取多點(diǎn)活檢，若鏡下為正常轉(zhuǎn)化區(qū)，則分別在3、6、9、12點(diǎn)處取活檢。

1.3診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1組織學(xué)診斷按照世界衛(wèi)生組織2004年病理組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)細(xì)胞異型性程度和范圍的不同，依次診斷為：慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)Ⅰ級(jí)(CINⅠ)、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變Ⅱ級(jí)(CIN Ⅱ)、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變Ⅲ 級(jí)(CIN Ⅲ)及鱗癌(SCC)。

1.3.2HPV E6/E7 mRNA的檢測(cè)結(jié)果由計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)讀取，將拷貝值≥1為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。低危風(fēng)險(xiǎn)(1～4000拷貝)；中危風(fēng)險(xiǎn)(4000～10 000拷貝)；高危風(fēng)險(xiǎn)(﹥10 000拷貝)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行運(yùn)算，不同病理級(jí)別E6/E7 mRNA檢出率差別采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)宮頸病變的診斷價(jià)值197例HPV DNA陽(yáng)性患者中，HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性共123例，陰性74例；組織病理結(jié)果為慢性宮頸炎129例，CIN 68例，其中HPV E6/E7 mRNA陰性，組織病理結(jié)果為CIN 6例。HPV E6/E7 mRNA的敏感度為91.18%(62/68)，特異度為52.17%(68/129)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為50.14%(62/123)，陰性預(yù)測(cè)值為91.89%(68/74)，相較于HPV DNA34.51%(68/197)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，HPV E6/E7 mRNA的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高于HPV DNA，且有較高的敏感度及陰性預(yù)測(cè)值。

圖1HPV E6/E7 mRNA在正常宮頸組織中的陰性表達(dá)(Elivision染色)

圖2HPV E6/E7 mRNA在CIN組織中的陽(yáng)性表達(dá)(Elivision染色)

2.2HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)與宮頸上皮內(nèi)瘤變之間的關(guān)系197例宮頸組織標(biāo)本中，檢測(cè)出 HPV E6 /E7 mRNA陽(yáng)性標(biāo)本123例，陽(yáng)性率62． 44%，其中宮頸炎組61例(47.29%)，CINⅠ組21例(87.50%)，CINⅡ組18例(94．74%)，CINⅢ組23例(92．00%)。見(jiàn)表1。

表1各組宮頸病變中HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)率

病理分型例數(shù)陽(yáng)性數(shù)陽(yáng)性率/%炎癥組1296147.29CINⅠ組242187.50CINⅡ組191894.74CINⅢ組252392.00

由表1可知，炎癥組分別與CIN各組陽(yáng)性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值依次為11.59、13.14、15.11,P均<0． 01)；而CIN各組兩兩之間陽(yáng)性率差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。

2.3HPV E6/E7 mRNA風(fēng)險(xiǎn)程度與宮頸病變之間的關(guān)系197例HPV DNA陽(yáng)性患者中，根據(jù)組織病理結(jié)果，上皮內(nèi)瘤樣病變Ⅰ級(jí)(CIN Ⅰ)為低級(jí)別病變，上皮內(nèi)瘤樣病變Ⅱ級(jí)(CIN Ⅱ)及以上為高級(jí)別病變。根據(jù)HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)拷貝值 ，低危風(fēng)險(xiǎn)103例(其中病理組織學(xué)正常60例，低級(jí)別病變 20例，高級(jí)別病變23例)，中危風(fēng)險(xiǎn)組 13例(病理組織學(xué)結(jié)果低級(jí)別病變1例，高級(jí)別病變12例)，高危風(fēng)險(xiǎn)組7 例(病理組織學(xué)結(jié)果正常1例，高級(jí)別病變6例)陽(yáng)性率85.71%。其中病理診斷為高級(jí)別病變20例，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)為中危組以上為18例，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)與病理學(xué)診斷符合率為90%。

3討論

宮頸病變的主要原因是HPV感染，研究發(fā)現(xiàn)，99.7%的宮頸癌患者均具有HPV的感染[6]。然而從HPV感染進(jìn)展到宮頸癌需經(jīng)過(guò)很長(zhǎng)一段時(shí)間。HPV感染后可在體內(nèi)長(zhǎng)期處于潛伏狀態(tài)，90%的 HPV感染者可通過(guò)自身免疫功能進(jìn)行清除，只有5%～10%的高危持續(xù)感染者進(jìn)展為宮頸癌[7]。宮頸上皮內(nèi)瘤變反映了宮頸癌發(fā)生發(fā)展的連續(xù)過(guò)程，HPV 感染也是 CIN 進(jìn)展為宮頸癌的重要誘因[8]。高危型HPV可產(chǎn)生E6和E7兩種癌蛋白，E6蛋白使p53失活，從而使細(xì)胞轉(zhuǎn)向惡性增殖。同時(shí)E6 蛋白與PDZ 蛋白結(jié)合,介導(dǎo)PDZ 蛋白的降解，PDZ蛋白功能與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附等相關(guān)。PDZ蛋白水平的降低被認(rèn)為在宮頸癌的發(fā)展過(guò)程中起了重要作用。E6蛋白也可以直接激活端粒酶，導(dǎo)致細(xì)胞永生化，從而導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。E7蛋白可與pRb結(jié)合，降低抑癌基因的活性，使pRb/E2F 復(fù)合物分解，釋放E2F1，促進(jìn)細(xì)胞增殖[9]。

本研究采用b-DNA 技術(shù)檢測(cè)了HPV陽(yáng)性患者中HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，宮頸炎癥組的HPV E6/E7 mRNA 陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于宮頸病變組，在高級(jí)別病變中(CINⅡ及以上)的表達(dá)率也明顯高于低級(jí)別病變(CIN Ⅰ)。宮頸組織標(biāo)本病理分級(jí)與 HPV E6/E7 mRNA 表達(dá)量成正相關(guān)。由此可見(jiàn)，HPV E6/E7 mRNA能夠更好評(píng)估宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Ratnam等[10]研究發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率隨著宮頸病變的加重而增加，本研究中HPV E6/E7 mRNA在炎癥組、CINⅠ～ Ⅲ 組中的陽(yáng)性率分別為47.29%、87.50%%、94.74%、92.00%，炎癥組和CINⅠ組、CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組之間陽(yáng)性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且在陽(yáng)性預(yù)測(cè)值上，HPV E6/E7 mRNA優(yōu)于HPV DNA檢測(cè)，本文結(jié)論與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符[11]。HPV感染人群中，有80%的感染者兩年內(nèi)會(huì)自行消退，從HPV感染到宮頸病變的發(fā)生，需歷經(jīng)數(shù)年。HPV E6/E7 mRNA是病毒癌基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，表現(xiàn)癌基因活性，故相對(duì)于HPV DNA檢測(cè)，有更精準(zhǔn)更直接的意義。有研究表明，在鑒別短暫的宮頸異常與可能進(jìn)一步發(fā)展的宮頸病變中，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)相比HPV DNA檢測(cè)有著更高的特異度，可以降低HPV DNA檢測(cè)陽(yáng)性給患者所帶來(lái)的心理負(fù)擔(dān)[12]?？梢灶A(yù)見(jiàn)，經(jīng)過(guò)大規(guī)模樣本累計(jì)后，對(duì)于存在HPV感染的患者，而細(xì)胞學(xué)檢測(cè)正常時(shí)，HPV E6/E7 mRNA 表達(dá)量的高低對(duì)是否經(jīng)行陰道鏡檢查甚至宮頸組織活檢具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值，可以達(dá)到分流門診HPV感染及早期或低級(jí)別宮頸病變患者的目的。因此， HPV E6/E7 mRNA 表達(dá)量的定量檢測(cè)，對(duì)于早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)、預(yù)防、治療宮頸癌、協(xié)助臨床診斷、評(píng)估宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后有著重要的意義。

【參考文獻(xiàn)】

[1]郎景和．子宮頸上皮內(nèi)瘤變的診斷與治療[J]．中華婦產(chǎn)科雜志，2001，36(5)：261-263．

[2]SCHIFFMAN M，WENTZENSEN N．Human papillomavirus infection and the multistage carcinogenesis of cervical cancer[J]．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2013，22：553-560．

[3]GOLDBERG RM，MEROPOL NJ，TABERNERO J，etal．Ac-complishments in 2008 in the treatment of advanced metastatic colorectal cancer[J]．Gastrointest Cancer Res，2009，3(Suppl 2)：S23-S27.

[4]MASSIMI P,SHAI A,LAMBERT P,etal.HPV E6 degradat ion of p53and PDZ containingsubstrat es in anE6AP null background [J].Oncogene,2008,27(12):1800-1804.

[5]DARNELL GA,SCHRODER WA,ANTALIS TM,etal.Human papillomavirus E7 requires the protease calpain to degrade the retinoblastoma protein[J].J Biol Chem,2007,282(52):37492-34500.

[6]KRAUS I，MOLDEN T，HOLM R，etal．Presenee of E6 and E7 mRNA from human papillomavirus types 16，18，31，33 and 45 in the majority of cervical carcinomas [J]．J Clin Microbiol，2006，44：1310-1331.

[7]DOORBAR J.Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer[J].Clin Sc(Lond),2006,110(5):525-541.

[8]CASTLE PE，SHABER R，LA MERE BJ，etal．Human papillomavirus(HPV) genotypes in women with cervical precancer and cancer at Kaiser Permanente Northern California [J]．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2011，20(5):946-953．

[9]賈政軍，周玉春，胡蓉，等．HPV mRNA 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)及其與宮頸癌發(fā)生的關(guān)系[J]．實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，19(3):354 - 358．

[10] RATNAM S,C′OUTLEE F,FONTAINE D,etal.Clinical performance of the PreTect HPV-Proofer E6/E7 mRNA assay in comparison with that of the Hybrid Capture 2 test for identification of women at risk of cervical cancer[J].Journal of clinical microbiology,2010,48(8):2779.

[11] SPATIS A,KOTTARIDI C,CHRANIOTI A,etal.mRNA and DNA detection of human papillomaviruses in women of all ages attending two colposcopy clinics [J].PloS One,2012,7(11):e49205.

[12] M?CKEL J,QUASS J,MEISEL H,etal.Human papillomavirus E6/E7 mRNA testing has higher specificity than liquid-based DNA testing in the evaluation of cervical intraepithelial neoplasia[J].Anal Quant Cytol Histol,2011,33(6):311-315.

Value of human papillomavirus E6/E7 mRNA detection in diagnosis of cervical lesions

XU Duo,HE Lianzhi

Department of Gynecology & Obstetrics,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

【Abstract】Objective：To assess the value of human papilloma virus(HPV) E6/E7 mRNA detection in the diagnosis of cervical lesions.Methods:A total of 197 HPV positive cases confirmed as chronic cervicitis by Thin-prep liquid-based Cytology Test(TCT) were included from Yijishan Hospital of Wannan Medical College between September of 2014 and 2015,and all patients were given further detection of HPV E6/E7 mRNA as well as colposcopy and cervical biopsy.Results:In the 197 cases,positive HPV E6/E7 mRNA was 62.44%,and mRNA sensitivity was 91.18%; specificity,52.17%; positive predictive value,50.14%; negative predictive value,91.89%.By histological grading,the difference was significant regarding the positive rate of HPV E6/E7 mRNA between inflammatory group and cervical intraepithelial neoplasia(CIN)Ⅰ,CIN Ⅱor CIN Ⅲ(P<0.01).The result of HPV E6/E7 mRNA expression was consistent with that of pathological findings in 90% of the cases.Conclusion:HPV E6/E7 mRNA expression is closely correlated with cervical lesions,and can be a useful tool to assess the risks of malignancy.Particularly,HPV E6/E7 mRNA detection can competently predict high grade CIN from early or low grade cervical lesions.

【Key words】human papillomavirus; HPV E6/E7 mRNA; cervical intraepithelial neoplasia

文章編號(hào)：1002-0217(2016)03-0230-04

收稿日期：2015-12-06

作者簡(jiǎn)介：徐多(1989-)，女，2013級(jí)碩士研究生，(電話)13866372153，(電子信箱)xdwnyxy@163.com;

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】【中圖號(hào)】R 737.33A

何蓮芝，女，主任醫(yī)師，(電子信箱)429094335@qq.com，通訊作者.