馬錢苷抑制人惡性黑色素瘤細(xì)胞的作用及機(jī)制研究

黨文軍　　陳景華　　張　寧　　王加志　　黃昕紅

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱　150040

馬錢苷抑制人惡性黑色素瘤細(xì)胞的作用及機(jī)制研究

黨文軍陳景華張寧王加志黃昕紅

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040

目的探索馬錢苷抑制人惡性黑色素瘤細(xì)胞的作用和機(jī)制。 方法將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、不同干預(yù)濃度（10、20、40、60、80 ng/mL）的馬錢苷組，分別作用24、48、72 h，采用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活性；依據(jù)藥物作用48 h時(shí)的IC50濃度［（74.96±7.92）ng/mL］，選取馬錢苷20、40、60 ng/mL分別干預(yù)48 h，并采用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bc1-2、Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平的變化；用Western b1ot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bc1-2、Bax和Caspase-3蛋白水平的變化。 結(jié)果馬錢苷具有抑制A375細(xì)胞增殖的作用，并呈時(shí)間和劑量依賴性。與空白對(duì)照組比較，馬錢苷組細(xì)胞抑制凋亡因子Bc1-2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），促凋亡因子Bax和Caspase-3的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論馬錢苷能抑制A375細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞Bc1-2 mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)，上調(diào)Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

馬錢苷；人惡性黑色素瘤；A375細(xì)胞；凋亡；Bcl-2；Bax；Caspase-3

［Abstract］Objective To investigate the inhibitory effect and mo1ecu1ar mechanism of 1oganin on human ma1ignant me1anoma ce11s in vitro.Methods The experiment was divided into b1ank contro1 group and different concentrations （10，20，40，60，80 ng/mL）of 1oganin groups，dea1t for 24，48，72 h，the ce11s activity was detected by MTT method；according to the ha1f-inhibitory concentration（IC50）for 48 h［（74.96±7.92）ng/mL］，20，40，60 ng/mL of 1oganin were se-1ected for 48 h intervention.The mRNA expressions of Bc1-2，Bax and Caspase-3 were detected by RT-PCR；the protein expressions of Bc1-2，Bax and Caspase-3 were detected by Western b1ot.Results Loganin has a most effective1y inhibitory effect on A375 ce11s pro1iferation in a time and dose dependent manner.Compared with b1ank contro1 group，the mRNA and protein expression 1eve1s of apoptosis inhibiting factor Bc1-2 in the 1oganin group were down-regu1ated significant1y（P＜0.05 or P＜0.01），and the mRNA and protein expression 1eve1s of pro-apoptotic factors Bax and Caspase-3 were a11 up-regu1ated，respective1y（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Loganin can significant1y inhibit the pro1iferation of A375 ce11s，which may be associated with inhibiting the mRNA and protein expressions of Bc1-2，improving the mRNA and protein expressions of Bax，Caspase-3，thus inducting apoptosis.

［Key words］Loganin；Human ma1ignant me1anoma；A375 ce11s；Apoptosis；Bc1-2；Bax；Caspase-3

人惡性黑色素瘤細(xì)胞是一種始于黑素細(xì)胞的皮膚惡性腫瘤，其進(jìn)展快，惡性程度高，極易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅人群生命健康。據(jù)2012年統(tǒng)計(jì)顯示，全球發(fā)病232 130例，死亡55 849例，且其發(fā)病率正逐年升高。針對(duì)該病的治療方法多樣，早期發(fā)現(xiàn)可手術(shù)切除，對(duì)于已經(jīng)轉(zhuǎn)移的黑色素瘤患者，傳統(tǒng)的放化療、兔疫療法均對(duì)其不敏感［1］。中藥山茱萸具有多種生物活性，表現(xiàn)出抗炎、降血糖、抗心律失常、雙向調(diào)節(jié)兔疫、促進(jìn)白細(xì)胞介素-2（IL-2）生成［14］的作用?，F(xiàn)代藥理研究提示［2-3］，山茱萸對(duì)乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、艾氏腹水癌細(xì)胞（EAC）、人肺癌細(xì)胞（A549）等細(xì)胞有明顯的抗腫瘤活性，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的抗癌藥。本課題組前期研究提示，高濃度的山茱萸水提取物環(huán)烯醚萜苷類成分馬錢苷，能顯著抑制人黑色素瘤A375細(xì)胞的生長(zhǎng)［4］，但其作用機(jī)制不明確。本研究從細(xì)胞及分子水平上探討了馬錢苷抑制人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞的效應(yīng)和強(qiáng)度及可能的作用機(jī)制，為抗腫瘤新藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株

人皮膚黑色素瘤細(xì)胞A375細(xì)胞由中國科學(xué)院細(xì)胞中心提供。

1.2主要藥物及試劑

馬錢苷（批號(hào)：111640-200502）購于中國食品藥品檢定研究院；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG（批號(hào)：BST08k13B）、HRP羊抗兔（批號(hào)：BA1054），博士德；rabbit ant-Bax（批號(hào)：15120902）、rabbit ant-Bc1-2（批號(hào)：15120901）、rabbit ant-Caspase-3（批號(hào)：15120903）、小鼠抗人β-actin單克隆抗體（批號(hào)：140925），中杉金橋。

1.3主要儀器

IX-71-21PH型倒置顯微鏡（日本O1ympus株式會(huì)社）；Tprofessiona1 PCR擴(kuò)增儀（德國Biometra公司）；MK3型酶標(biāo)儀（上海熱電儀器有限公司）；Cham1Ge 15000凝膠成像儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。

1.4細(xì)胞分組及處理

將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A375細(xì)胞，以5000個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔加200 μL DMEM完全培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。把培養(yǎng)基棄掉，分別加入含馬錢苷藥物6種濃度（0、10、20、40、60、80 ng/mL）培養(yǎng)基200 μL，各組細(xì)胞均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。將另一部分細(xì)胞以105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，每組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔，每孔加2 mL DMEM完全培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，把培養(yǎng)基棄掉，分別加入含馬錢苷藥物4種濃度（0、20、40、60 ng/mL）培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

細(xì)胞培養(yǎng)分別在24、48、72 h至結(jié)束前4 h每孔加20 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加150 μL DMSO溶解，將96孔板置于37℃恒溫震蕩培養(yǎng)器內(nèi)震蕩10 min，使紫色結(jié)晶完全溶解。酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.6RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞 Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)

1.6.1總RNA提取細(xì)胞總RNA的提取按照試劑盒說明操作。引物設(shè)計(jì)合成：由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成設(shè)計(jì)與合成，以β-actin為內(nèi)參，引物序列信息見表1。

表1　引物序列

1.6.2PCR擴(kuò)增 在冰浴離心管中依次加入樣品cDNA 1.5 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP 2.5 μL、MgC121.3 μL、Taq酶0.1 μL、上游引物和下游引物各0.5 μL、ddH2O 16.1 μL，使管中終體積達(dá)到25 μL，將離心管放入PCR擴(kuò)增儀上，PCR擴(kuò)增程序如下：條件：94℃變性30 s（β-actin 50℃、Bc1-2 46℃、Bax 45℃、Caspase-3 48℃）、退火40 s，72℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.6.3結(jié)果分析 采用ge1-pro凝膠分析軟件對(duì)電泳譜帶進(jìn)行積分光密度（IOD）分析，得出各條帶IOD值，用校正值 （Bc1-2/β-action、Bax/β-action、Caspase-3/ β-action）表示mRNA水平。

1.7Western blot檢測(cè)馬錢苷對(duì)Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)

1.7.1蛋白樣品制備 當(dāng)細(xì)胞呈80%以上融合時(shí)，WIP組織細(xì)胞裂解液（PMSF終濃度為1 mmo1/L）提取總蛋。SDS-PAGE電泳：按照BIO-RAD公司說明書安裝SDS聚丙烯酰氨凝膠玻璃板，加樣照實(shí)驗(yàn)分組將預(yù)染蛋白Marker和等體積的蛋白樣品30 μL注入到對(duì)應(yīng)的膠孔中，連接電泳儀，100 V，電泳90 min。轉(zhuǎn)膜封閉：接通電源10 V，30 min將蛋白轉(zhuǎn)至經(jīng)甲醇5 min和去離子水2 min浸泡后的PVDF膜，室溫置搖床封閉2 h。一抗孵育反應(yīng)，1∶300稀釋小鼠抗β-actin單克隆抗體，1∶100稀釋Bax、Bc1-2 Caspase-3兔抗人單克隆抗體，脫色搖床上室溫孵育PVDF膜1 h后，4℃過夜。1∶10 000稀釋HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗和HRP標(biāo)記羊抗兔二抗，搖床孵育PVDF膜1 h后，顯影：ECL顯影液顯影。

1.7.2結(jié)果分析采用Lane ID凝膠分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行IOD分析，得到各條帶的灰度值，以靶條帶的灰度值與內(nèi)參的灰度值的比值來反映目的蛋白的表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1馬錢苷對(duì)A375細(xì)胞活性的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，馬錢苷對(duì)A375細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，在同一處理?xiàng)l件下，馬錢苷組對(duì)A375細(xì)胞活性的抑制影響與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）（圖1A）；另外，其抑制率分別在24、48、72 h時(shí)隨劑量依次增大，在一定程度上存在時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)（圖1B）。計(jì)算得出，馬錢苷在作用48 h時(shí)的IC50為（74.96± 7.92）ng/mL。

圖1　馬錢苷對(duì)A375細(xì)胞活性和增殖的影響

2.2馬錢苷對(duì)Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，馬錢苷能下調(diào)A375細(xì)胞Bc1-2 mRNA的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bax和Caspase-3 mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）（表2）；另外，藥物作用48 h時(shí)，隨藥物劑量依次增大，其對(duì)Bc1-2、Bax、Caspase-3 mRNA的調(diào)節(jié)作用越明顯，在一定程度上存在劑量效應(yīng)（圖2）。

表2 不同組別的A375細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量（±s，n=4）

表2 不同組別的A375細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量（±s，n=4）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　Bc1-2/β-actin Bax/β-actin　Caspase-3/β-actin空白對(duì)照組馬錢苷組（20 ng/mL）馬錢苷組（40 ng/mL）馬錢苷組（60 ng/mL）0.654±0.061 0.622±0.048*0.506±0.047**0.396±0.036**0.253±0.018 0.288±0.042*0.389±0.046**0.486±0.036**0.236±0.019 0.303±0.038**0.418±0.030**0.515±0.065**

圖2　馬錢苷對(duì)A375細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的影響

2.3馬錢苷對(duì)Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，馬錢苷能下調(diào)A375細(xì)胞Bc1-2蛋白的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）（表3）；另外，藥物作用48 h時(shí)，隨藥物劑量依次增大，其對(duì)Bc1-2、Bax、Caspase-3蛋白的調(diào)節(jié)作用越明顯，在一定程度上存在劑量效應(yīng)（圖3）。

圖3　馬錢苷對(duì)A375細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

表3　不同組別的A375細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量（±s，n=4）

表3　不同組別的A375細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量（±s，n=4）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　Bc1-2/β-actin　Bax/β-actin　Caspase-3/β-actin空白對(duì)照組馬錢苷組（20 ng/mL）馬錢苷組（40 ng/mL）馬錢苷組（60 ng/mL）0.554±0.045 0.506±0.011*0.450±0.030**0.320±0.009**0.215±0.016 0.264±0.011*0.363±0.017**0.434±0.015**0.251±0.024 0.335±0.015**0.644±0.023**0.750±0.011**

3　討論

凋亡是細(xì)胞的程序性死亡，是由基因調(diào)控的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)是由細(xì)胞增殖與凋亡的比例決定的。細(xì)胞凋亡是由多種信號(hào)蛋白通過多種途徑傳導(dǎo)的復(fù)雜過程，目前主要是通過死亡受體途徑（外部途徑）和線粒體途徑（內(nèi)部途徑）實(shí)現(xiàn)的［5］。凋亡因子Bax、Bc1-2、Caspase-3與線粒體凋亡途徑密切相關(guān)［6-8］。Bax是Bc1-2家族促凋亡亞家族的代表，定位于細(xì)胞漿中，可提高凋亡敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)較多時(shí)，Bax能自身形成同源二聚體［9］，其能不斷引起線粒體的膜電位降低，進(jìn)一步促進(jìn)cyt-c 和AIF的釋放，cyt-c與凋亡酶激活因子（Apaf-1）、ATP 及pro-Caspase-9形成凋亡復(fù)合體，通過pro-Caspase-9的自身酶切活化，激活Caspase-9，進(jìn)一步活化Caspase-3，引起細(xì)胞DNA裂解而凋亡［10-11］。Bc1-2是Bc1-2家族抗凋亡亞家族的代表［12］，主要定位于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及核膜上，其主要功能為延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，研究提示Bc1-2基因在腫瘤組織中過量表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［13］，當(dāng)Bc1-2表達(dá)增多時(shí)，Bc1-2與Bax形成異源二聚體，引起細(xì)胞核谷胱甘肽積聚，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，阻止胞內(nèi)Ca2+流動(dòng)，導(dǎo)致線粒體膜的通透性改變，干擾了線粒體膜釋放cyt-c，抑制Caspase-3依賴的線粒體蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而起到抑制細(xì)胞調(diào)亡的作用［14-15］，可見Bc1-2和Bax蛋白均位于線粒體上游，是Caspase-3依賴的線粒體途徑的重要調(diào)控因素［16-19］。部分機(jī)制雖是如此，但只有當(dāng)Bax/Bc1-2值升高，才可認(rèn)為是Bax真正意義上的表達(dá)增多，才是Bax形成同源二聚體促使凋亡的條件［20］。

本研究顯示，馬錢苷能顯著下調(diào)Bc1-2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，并且隨著給藥濃度的增大，Bax/Bc1-2值愈大，對(duì)A375的抑制作用愈強(qiáng)，與空白對(duì)照組比較，具有顯著性差異。因此推斷，馬錢苷可能通過下調(diào)Bc1-2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，上調(diào)Bax mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，提高Bax/Bc1-2值，促進(jìn)cyt-c釋放，激活Caspase-3依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡。這可能是馬錢苷抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞A375增殖的作用機(jī)制，這將為治療人惡性黑色素瘤新藥的開發(fā)提供一種可能。

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Study on the inhibitory effect and molecular mechanism of loganin on human malignant melanoma cells

DANG WenjunCHEN JinghuaZHANG NingWANG Jiazhi HUANG Xinhong
Hei1ongjiang University of Chinese Medicine，Hei1ongjiang Province，Harbin150040，China

R739.5

A

1673-7210（2016）04（c）-0015-05

黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（D201275）。

黨文軍（1986-），男，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院2013級(jí)中醫(yī)外科學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：中醫(yī)外科學(xué)中醫(yī)藥美容。

陳景華（1965-），女，碩士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)外科學(xué)中醫(yī)藥美容研究。

2016-01-02本文編輯：張瑜杰）