普拉康唑中四種光學(xué)異構(gòu)體的HPLC法測(cè)定

鄭曦孜

重慶涵虛閣制藥技術(shù)開發(fā)有限公司研發(fā)部，重慶　400064

普拉康唑中四種光學(xué)異構(gòu)體的HPLC法測(cè)定

鄭曦孜

重慶涵虛閣制藥技術(shù)開發(fā)有限公司研發(fā)部，重慶400064

目的建立同時(shí)測(cè)定普拉康唑中4種光學(xué)異構(gòu)體含量的方法。方法采用高效液相色譜法對(duì)普拉康唑中4種光學(xué)異構(gòu)體的含量進(jìn)行測(cè)定。色譜柱為Daice1 Chira1pak IC手性柱；流動(dòng)相為正己烷∶乙醇（80∶20），流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；柱溫為25℃。結(jié)果 4種光學(xué)異構(gòu)體間分離度均大于1.5，檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍均為0.5～120 μg/mL（r≥0.9992），方法回收率≥99.75%，RSD＜1.50%（n=3），檢測(cè)限為0.15 μg/mL，3批普拉康唑樣品中異構(gòu)體的含量分別為批號(hào)151001：99.90%、0.02%、0.04%、0.04%；批號(hào)151002：99.89%、0.03%、0.05%、0.03%；批號(hào)151003：99.87%、0.02%、0.05%、0.06%。結(jié)論建立的方法準(zhǔn)確、快速，實(shí)現(xiàn)了對(duì)普拉康唑光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)的有效控制。

普拉康唑；光學(xué)異構(gòu)體；含量測(cè)定；高效液相色譜法

［Abstract］Objective To estab1ish the method for determination of 4 kinds of enantiomers in Pramiconazo1e.Methods HPLC method was adopted to determine the content of 4 kinds of enantiomers in Pramiconazo1e.The determination was separated on Daice1 Chira1pak IC.The mobi1e phase was consisted of hexane-ethano1（80∶20）at a f1ow rate of 1.0 mL/ min and the co1umn temperature at 25℃.The detection wave1ength was 210 nm.Results The reso1ution of 4 kinds of enantiomers were greater than 1.5.The 1inear range of them were 0.5-120 μg/mL（r≥0.9992，n=8）with an recovery rate≥99.75%（RSD＜1.50%，n=3）.The detection 1imits was 0.15 μg/mL.The enantiomer content of Pramiconazo1e was batch No.151001∶99.90%，0.02%，0.04%，0.04%；batch No.151002∶99.89%，0.03%，0.05%，0.03%；batch No.151003∶99.87%，0.02%，0.05%，0.06%.Conclusion The method is accurate，rapid and suitab1e for qua1ity contro1 of enantiomers in Pramiconazo1e.

［Key words］Pramiconazo1e；Enantiomers；Content determination；HPLC method

普拉康唑（Pramiconazo1e，A），化學(xué)名為1-（4-｛4-［4-（｛（2S，4R）-4-（2，4-二氟苯基）-4-［（1H-1，2，4-三唑-1-基）甲基］-1，3-二氧戊環(huán)-2-基｝甲氧基）苯基］哌嗪-1-基｝苯基）-3-（丙烷-2-基）咪唑烷酮-2-烷，是由比利時(shí)Barrier Therapeutics公司開發(fā)研制的一種新型三唑類抗真菌藥，目前在歐盟尚處于Ⅱa期臨床試驗(yàn)階段，尚未上市，具有療效確切，耐受性好，不良反應(yīng)程度較輕的特點(diǎn)，是一種較有發(fā)展前途的廣譜抗真菌藥。該藥的抗菌機(jī)制除了抑制麥角固醇合成，還涉及到降低馬拉色菌對(duì)角質(zhì)細(xì)胞的黏附及與機(jī)體固有兔疫的協(xié)同作用。普拉康唑在抗念珠菌和馬拉色菌方面具有比較明顯的優(yōu)勢(shì)，在相同劑量下表現(xiàn)出較伊曲康唑更強(qiáng)的抗菌能力。該藥的前體分子是伊曲康唑，兩者都對(duì)表皮癬菌、酵母菌和其他許多真菌有明顯的抗菌作用。普拉康唑作為口服藥物用于治療淺部真菌感染，如皮膚、甲、口腔外陰黏膜療效明顯，不良反應(yīng)少且程度輕。不足之處是臨床應(yīng)用范圍不如伊曲康唑廣，目前僅用于治療淺部真菌感染［1-19］。

普拉康唑結(jié)構(gòu)中有2個(gè)手性碳，在合成過程中可能會(huì)產(chǎn)生4種光學(xué)異構(gòu)體，除了目標(biāo)化合物普拉康唑A外，還有（2R，4S）-構(gòu)型的B、（2R，4R）-構(gòu)型的C和（2S，4S）-構(gòu)型的D?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。按照研發(fā)立體異構(gòu)體新藥的相關(guān)技術(shù)要求［20］，有必要建立一套完善的分析方法對(duì)普拉康唑的光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制和產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)。由于普拉康唑還未上市，分析方法尚未公開，為此，本研究根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版二部附錄VD的相關(guān)要求［21］，建立了一套HPLC法來監(jiān)控4種光學(xué)異構(gòu)體。該色譜條件滿足對(duì)普拉康唑光學(xué)異構(gòu)體的分離要求，方法準(zhǔn)確、快速，重現(xiàn)性好，可為普拉康唑原料藥及制劑質(zhì)量分析等工作提供依據(jù)。

圖1　普拉康唑A化學(xué)結(jié)構(gòu)

1儀器與試藥

1　儀器與試藥

1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫）。對(duì)照品A（含量99.94%，批號(hào)151101）、B（含量97.45%，批號(hào)151102）、C（含量96.35%，批號(hào)151103）和 D（含量96.21%，批號(hào)151104），均為重慶涵虛閣制藥技術(shù)開發(fā)有限公司（以下簡(jiǎn)稱“本公司”）合成、精制、標(biāo)定（以峰面積歸一化法計(jì)主峰純度）；普拉康唑樣品（本公司自制，批號(hào)151001、151002、151003）；正己烷、乙醇均為色譜純，其他試劑為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液配制

對(duì)照品溶液：分別精密稱取普拉康唑?qū)φ掌稟～D各約10 mg，各置于100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容至刻度，搖勻，作為濃度為100 μg/mL的對(duì)照品溶液。

混合對(duì)照品溶液：將4種異構(gòu)體對(duì)照品溶液按1∶1∶1∶1的比例混合，作為濃度為25 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：精密稱取普拉康唑樣品100 mg，置于100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容至刻度，搖勻，作為濃度為1 mg/mL的供試品溶液。

2.2色譜條件

分別將A～D對(duì)照品溶液在190～400 nm進(jìn)行掃描，各異構(gòu)體均在210 nm處有較強(qiáng)吸收，故選定檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。色譜柱Daice1 Chira1pak IC手性柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相正己烷∶乙醇 （80∶20）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取普拉康唑A～D對(duì)照品溶液及其混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明，A～D的保留時(shí)間分別為8.18、11.15、7.78、9.12 min，普拉康唑及其光學(xué)異構(gòu)體基線達(dá)到完全分離，理論板數(shù)均大于10 000，分離度分別為1.72、2.96、5.92，拖尾因子均小于1.15，溶劑峰不干擾測(cè)定。色譜圖見圖2。

圖2　HPLC圖譜

2.4線性試驗(yàn)

分別精密稱取A～D異構(gòu)體對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并搖勻稀釋，配制成約0.5、5、10、20、50、80、100、120 μg/mL的系列濃度溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積A對(duì)濃度C作圖，進(jìn)行線性回歸，分別得到異構(gòu)體A、異構(gòu)體B、異構(gòu)體C和異構(gòu)體D的回歸方程，結(jié)果見表1。A～D均在0.5～120 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測(cè)限（LLOD）為0.15 μg/mL，最低定量限（LLOQ）為0.5 μg/mL。

表1　線性試驗(yàn)結(jié)果

2.5回收率試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下方法，精密稱取已知4種異構(gòu)體含量的供試品各9份，分別加入含4種異構(gòu)體為高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液各3份，作為回收率試驗(yàn)溶液，依法分析，計(jì)算回收率。普拉康唑4種異構(gòu)體A、B、C、D的回收率。結(jié)果RSD均小于1.5%，表明本方法回收率良好。見表2。

表2　回收率試驗(yàn)結(jié)果（%，n=3）

2.6精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果RSD均小于2.0%（n=6），表明本方法精密度良好。

分別取上述混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，于室溫放置，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果A～D的峰面積在8 h內(nèi)的RSD均小于2.0%（n= 5），表明混合對(duì)照品溶液室溫放置8 h穩(wěn)定。

2.7耐用性實(shí)驗(yàn)

分別采用不同實(shí)驗(yàn)人員，不同溫度，不同比例的流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，分離效果均符合要求，分離度大于1.5，可以用于普拉康唑光學(xué)異構(gòu)體的分離測(cè)定。

2.8樣品測(cè)定

取樣品適量，按“2.1”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中如有與各異構(gòu)體保留時(shí)間相同的雜質(zhì)峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各異構(gòu)體的含量。見表3。

表3　三批普拉康唑樣品中異構(gòu)體含量測(cè)定結(jié)果（%）

3　討論

3.1色譜柱的選擇

本研究在色譜條件摸索試驗(yàn)中先后測(cè)試了不同的手性色譜柱，包括蛋白質(zhì)型、手性多聚物型、5 μm硅膠表面共價(jià)鍵合纖維素-三（3，5-二氯苯基氨基）甲酸酯型（Daice1 Chira1pak IC）等。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)型手性色譜柱對(duì)4種光學(xué)異構(gòu)體難以實(shí)現(xiàn)基線分離，分離度小于1；手性多聚物型色譜柱可以滿足基線分離4種光學(xué)異構(gòu)體，但是如果異構(gòu)體A和C分離度要大于1.5以上，則異構(gòu)體B的出峰時(shí)間將超過50 min，且峰形較寬，不能快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行定量測(cè)定；而Daice1 Chira1pak IC手性色譜柱分離，普拉康唑4種光學(xué)異構(gòu)體的分離度均大于1.5，4種手性異構(gòu)體色譜峰的拖尾因子均小于1.15。出峰時(shí)間在15 min以內(nèi)，所以最終選擇Daice1 Chira1pak IC手性色譜柱測(cè)定普拉康唑4種光學(xué)異構(gòu)體。

3.2流動(dòng)相的選擇

以Daice1 Chira1pak IC手性色譜柱，先后篩選了正己烷-乙醇和正己烷-異丙醇系統(tǒng)。結(jié)果表明，使用正己烷-乙醇系統(tǒng)時(shí)，色譜峰形較差，拖尾嚴(yán)重；正己烷-異丙醇系統(tǒng)則可以實(shí)現(xiàn)良好的分離。通過調(diào)整一系列不同比例的正己烷-異丙醇流動(dòng)相，最終選擇以正己烷-異丙醇（80∶20）為流動(dòng)相，可以顯著地提高分離度和理論塔板數(shù)，優(yōu)化色譜峰的柱效、分離度及出峰時(shí)間。

3.3流速及柱溫的選擇

本研究還考察了儀器的流速及柱溫對(duì)異構(gòu)體分離度的影響，結(jié)果表明，改變流速和柱溫對(duì)異構(gòu)體的分離影響較小，綜合考慮，選擇流速為1.0 mL/min，柱溫25℃，試驗(yàn)表明此條件下普拉康唑4種異構(gòu)體能在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到基線分離，符合測(cè)定要求。

綜上所述，本研究先后測(cè)試了不同的手性色譜柱、不同的流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)普拉康唑4種光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行了色譜條件的摸索與驗(yàn)證，確定了同時(shí)準(zhǔn)確、快速測(cè)定4種光學(xué)異構(gòu)體含量的HPLC方法。本研究成功地將3個(gè)光學(xué)異構(gòu)體與普拉康唑進(jìn)行較好地分離。通過驗(yàn)證試驗(yàn)證明該方法分離度好、精密度高，各異構(gòu)體在此條件下呈良好線性，可以用于普拉康唑異構(gòu)體的檢測(cè)與質(zhì)量控制。

［1］Westerberg DP，Voyack MJ.Onychomycosis：Current trends in diagnosis and treatment［J］.Am Fam Physician，2013，88 （11）：762-770.

［2］Sig1e HC，Sch afer-Korting M，Korting HC.In vitro investigations on the mode of action of the hydroxypyridone antimycotics ri1opirox and piroctone on Candida a1bicans［J］. Mycoses，2006，49（3）：159-168.

［3］Lecha M，Effendy I.Treatment options-deve1opment of consensus guide1ines［J］.Eur Acad Dermato1 Venereo1，2005，19（S1）：S25-S33.

［4］E1ewski BE，Ghannoum MA，Mayser P.Efficacy，safety and to1erabi1ity of topica1 terbinafi ne nai1 so1ution in patients with mi1d-to-moderate toenai1 onychomycosis：resu1ts from three randomized studies using doub1e-b1ind vehic1e-contro11ed and open-1abe1 active-contro11ed designs［J］.Eur Acad Dermato1 Venereo1，2013，27（3）：287-294.

［5］Donders G，Ausma J，Wouters L，et a1.Efficacy of a sing1e ora1 dose of 200 mg pramiconazo1e in vu1vovagina1 yeast infections：an exp1oratory phaseIIatria1.ActaDerm Venereo1［J］.2008，88（5）：462-466.

［6］Gupta AK，Skinner AR.Cic1opirox for the treatment of superficia1 funga1 infections：a review［J］.Int J Dermato1，2003，42（1）：3-17.

［7］Faergemann J，Todd G，Pather S，et a1.A doub1e-b1ind. Randomized，p1acebo-contro11ed，dose-finding study of ora1 pramiconazo1e in the treatment of pityriasis versico1or. J Am Acad Dermato1［J］.2009，61（6）：971-976.

［8］Pierard GE，Ausma J，Henry F，et a1.A pi1ot study on seborrheic dermatitis using pramiconazo1e as a potent ora1 anti-Ma1assezia agent［J］.Dermato1ogy，2007，214（2）：162-169.

［9］Loo DS.Systemic antifunga1 agents：an update of estab1ished and new therapies［J］.Adv Dermato1，2006，22：101-124.

［10］Decroix J，Ausma J，Cauwenbergh G，et a1.The efficacy of ora1 treatment with pramiconazo1e in tinea pedis and tinea cruris/corpofis：two exp1oratory phase IIa tria1s.Br J Dermato1［J］.2008，158（4）：854-856.

［11］Zaitz C，Ruiz LRB，Souza VM.Dermatosis associated with yeasts from Ma1assezia genus［J］.An Bras Dermato1，2000，75：129-142.

［12］Crespo Erchiga V，De1gado F1orencio V.Ma1assezia species in skin diseases［J］.Curr Opin Infect Dis，2002，15（2）：133-142.

［13］O1iveiraJR，MazoccoVT，SteinerD.PityriasisVersico1or［J］. An Bras Dermato1，2002，77：611-618.

［14］Odds F，Ausma J，Van Gerven F，et a1.In vitro and in vivo activities of the nove1 azo1e antifunga1 agent r126638［J］. Antimicrob Agents Chemother，2004，48（2）：388-391.

［15］Zaitz C，Sampaio SAP.An eva1uation of the effectiveness and torerabi1ity of intraconazo1e in the treatment of pityriasis versico1or［J］.An Bras Dermato1，1995，70：195-198. ［16］Geria AN，Scheinfe1d NS.Pramiconazo1e，a triazo1e compound for the treatment of funga1 infections［J］.Idrugs，2008，11（9）：661-670.

［17］Mi11ikan LE.Current concepts in systemic and topica1 therapy for superficia1 mycoses［J］.C1in Dermato1，2010，28（2）：212-216.

［18］Bonifaz A，Ramírez-Tamayo T，Saú1 A.Tinea barbae（tinea sycosis）：experience with nine cases［J］.Dermato1，2003，30 （12）：898-903.

［19］Roberts BJ，F(xiàn)ried1ander SF.Tinea capitis：a treatment update［J］.Pediatr Ann，2005，34（3）：191-200.

［20］黃曉龍.美國(guó)FDA關(guān)于開發(fā)立體異構(gòu)體新藥的政策簡(jiǎn)介［J］.中國(guó)新藥雜志，2000，9（9）：650.

［21］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典［S］.二部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社：附錄29-31.

Determination of four Enantiomers in Pramiconazole by HPLC method

ZHENG Xizi
Department of R&D，Chongqing Hanxuge Pharmaceutica1 Co.Ltd.，Chongqing400064，China

R927.2

A

1673-7210（2016）04（c）-0143-04

鄭曦孜（1976-），男，碩士，主要從事新藥質(zhì)量研究。

2016-01-15本文編輯：趙魯楓）