應(yīng)激性胃潰瘍大鼠前爪不同區(qū)域黑色素變化的ghrelin-POMC通路研究

秦培潔　　王柳青　　程志立　　狄　穎　　刻劍鋒

中國中醫(yī)科學(xué)院中國醫(yī)史文獻(xiàn)研究所，北京　100700

應(yīng)激性胃潰瘍大鼠前爪不同區(qū)域黑色素變化的ghrelin-POMC通路研究

秦培潔王柳青程志立狄穎刻劍鋒▲

中國中醫(yī)科學(xué)院中國醫(yī)史文獻(xiàn)研究所，北京100700

目的探討應(yīng)激性胃潰瘍大鼠前爪手掌不同區(qū)域黑色素變化及其機(jī)制。 方法采用隨機(jī)數(shù)字表法將20只SD雄性大鼠分為空白對(duì)照組、模型組，每組各10只，利用無水乙醇灌胃復(fù)制應(yīng)激性胃潰瘍模型后，利用多巴氧化酶檢測(cè)兩組大鼠前爪皮膚黑色素變化；用ELISA法檢測(cè)兩組大鼠血清ghre1in水平；用RT-PCR法檢測(cè)兩組大鼠胃黏膜組織ghre1in mRNA、垂體和前爪皮膚組織POMC mRNA水平。結(jié)果模型組大鼠5區(qū)的黑色素細(xì)胞明顯增多；與空白對(duì)照大鼠比較，模型組大鼠的血清ghre1in水平及ghre1in mRNA降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；模型組大鼠的垂體和前爪皮膚組織POMC mRNA水平顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論應(yīng)激性胃潰瘍大鼠的病理變化可以在手掌特定區(qū)域通過黑色素的變化反映出來，初步推測(cè)其內(nèi)在機(jī)制可能是通過作用于ghre1in-POMC通路實(shí)現(xiàn)的。

手診；大鼠前爪；黑色素含量；腦腸肽；阿黑皮素原

［Abstract］Objective To investigate the change and the mechanism of me1anin in forepaw skin of rats with irritab1e u1cer.Methods 20 rats were divided into two groups by random number tab1e∶b1ank contro1 group and mode1 group，each group had 10 rats.Acute gastric mucosa1 injury mode1 was estab1ished by intragastric administration of 75% ethano1.The me1anin 1eve1s of forepaw skin in the two groups were detected by dopa oxidase.Serum ghre1in 1eve1s in the two groups were detected by ELISA method.Ghre1in mRNA of Gastric mucous tissue，POMC mRNA of pituitary and forepaw skin tissues were detected by RT-PCR method.Results The me1anin in 5-zone were significant1y increased in the mode1 group.Compared with the b1ank contro1 group，the ghre1in 1eve1 and ghre1in mRNA in the mode1 group significant1y decreased（P＜0.05）.The POMC mRNA 1eve1s in the pituitary and forepaw skin tissues of the mode1 group were significant1y higher than those in the b1ank contro1 group（P＜0.05）.Conclusion The patho1ogica1 changes of rats with irritab1e u1cer can be ref1ected by me1anin in particu1ar area of forepaw，pre1iminary specu1ation that the interna1 mechanism may be rea1ized by ghre1in-POMC pathway.

［Key words］Hand diagnosis；Rat forepaw；Me1anin content；Ghre1in；POMC

氣色形態(tài)手診是由劉劍鋒教授首次提出的創(chuàng)新中醫(yī)診斷方法，是在中醫(yī)望色診病理論基礎(chǔ)上結(jié)合臨床實(shí)踐建立起來的。在經(jīng)過多年臨床實(shí)證的基礎(chǔ)上，近年來課題組致力于尋找氣色形態(tài)手診的機(jī)制，以期為中醫(yī)“司內(nèi)揣外”理論提供研究方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在前期的工作中，課題組發(fā)現(xiàn)急性胃損傷大鼠的前爪特定部位皮膚黑色素細(xì)胞增多，本研究在前期研究基礎(chǔ)上探討其內(nèi)在機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠20只，周齡為8周，體重為（250± 10）g，由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，批號(hào)：0019089。

1.2主要試劑

75%乙醇（上海利康消毒高科技有限公司），甲醛溶液、10 mg/mL溴化己錠、硫酸鋁（Sigma公司），血清腦腸肽（ghre1in）檢測(cè)ELISA試劑盒（Ad1itteram Diagnostic Laboratories公司），Trizo1試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑、Taq DNA聚合酶和DNA Marker（美國Fer-mentas公司），瓊脂糖凝膠（英國OXOID公司），多巴胺氧化酶DopA（Cayman公司），磷酸氫二鈉（Biotopped公司），磷酸氫二鉀（福晨化學(xué)）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物分組

20只SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組和應(yīng)激性胃潰瘍模型組（模型組），各10只。

1.3.2模型建立

模型組：大鼠腹腔注射0.9%NaC1溶液2 mL/kg，1 h后以1 mL/100 g 75%乙醇灌胃誘導(dǎo)急性胃黏膜損傷模型；空白對(duì)照組：腹腔注射0.9%NaC1溶液2 mL/kg。1.3.3觀察指標(biāo)

1.3.3.1形態(tài)學(xué)觀察肉眼觀察兩組大鼠的胃大體標(biāo)本。

1.3.3.2胃潰瘍指數(shù)大鼠胃組織用4%甲醛溶液固定，然后沿胃大彎剪開，顯微鏡下觀察出血性病灶，采用測(cè)微尺計(jì)算胃黏膜損傷面積。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：正常胃黏膜；1分：點(diǎn)狀損傷；2分：病損＜1 mm；3分：病損1～＜2 mm；4分：病損2～＜3 mm，以此類推，胃潰瘍指數(shù)=全胃評(píng)分的總和［1］。

1.3.3.3組織病理學(xué)檢查 取大鼠胃竇部組織，石蠟切片，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠胃壁4層結(jié)構(gòu)是否清晰、胃黏膜表面是否光滑、上皮是否完整、腺體排列是否整齊。

1.3.4大鼠前爪特定部位黑色素變化測(cè)定方法［2-5］

1.3.4.1試劑配制 0.0056 mo1/L DopA液的配制：稱取DopA 1.10 g，溶解于1000 mL蒸餾水。0.1 mo1/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）配制：A液為0.1 mo1/L磷酸氫二鈉35.8 g溶解于1000 mL蒸餾水；B液為磷酸二氫鉀13.6 g溶解于1000 mL蒸餾水；取A液9份與B液1份混合，pH調(diào)至7.4。孵育液配制法：0.1 mo1/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）溶入0.0056 mo1/L的DopA內(nèi)。將配制好的孵育液保存于冰箱內(nèi)備用。

1.3.4.2操作步驟 取大鼠5區(qū)［6］皮膚作為標(biāo)本（圖1），用10%甲醛固定組織1 h（22℃）或4～8 h（4℃），修切已固定的組織塊，厚3～5 mm，流水沖洗3 min，組織塊浸于孵育液中1 h（37℃），流水沖洗2～6 h，在Bouin液中重新固定24 h。各級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度8 μm，用5%硫酸鋁水溶液配制的0.1%核固紅復(fù)染10 min，流水沖洗片刻至核深紅色、胞質(zhì)帶紅色為止。最后脫水、透明，中性樹膠封片。

圖1 大鼠前爪分區(qū)

1.3.5大鼠血清腦腸肽水平

應(yīng)用ELISA方法測(cè)定各組動(dòng)物血清中腦腸肽（ghre1in）水平。檢測(cè)方法按試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行。

1.3.6大鼠胃組織ghrelin mRNA和垂體、前爪皮膚組織POMC mRNA表達(dá)

按Trizo1試劑盒所示方法提取總RNA，檢查其濃度和純度后，在PCR熱循環(huán)儀中逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性25 s，退火30 s，60℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。引物序列見表1。凝膠掃描分析儀計(jì)算目的條帶吸光度值，目的基因mRNA表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度=目的基因條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

表1　ghrelin和POMC引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1肉眼形態(tài)學(xué)觀察

空白對(duì)照組大鼠胃表面較為光滑，胃黏膜完好，色淡紅，覆蓋有大量黏液，無潰瘍、糜爛及出血現(xiàn)象；模型組大鼠胃表面有白色覆蓋物，呈紅色及黑褐色條索狀，有點(diǎn)狀出血點(diǎn)，潰瘍?cè)畋憩F(xiàn)明顯，有胃出血現(xiàn)象，部分潰瘍穿孔。見圖2，封三。

2.2光學(xué)顯微鏡下觀察

光學(xué)顯微鏡下觀察顯示，空白對(duì)照組胃黏膜各層光整完好，無炎癥細(xì)胞浸潤，胃黏膜完整，胃小凹結(jié)構(gòu)和黏膜腺體排列整齊；模型組部分胃黏膜中斷，潰瘍可深及肌層，有炎癥細(xì)胞浸潤，胃黏膜不完整，肌層變薄部分?jǐn)嗔?，纖維蛋白壞死，漿膜層部分?jǐn)嗔选?/p>

2.3胃潰瘍指數(shù)

空白對(duì)照組無胃潰瘍，模型組的胃潰瘍指數(shù)為（79.19±11.18），與空白對(duì)照組比較，胃潰瘍指數(shù)顯著升高（P＜0.01），提示造模成功。

2.4大鼠前爪特定部位黑色素變化

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠前爪特定部位黑色素細(xì)胞增多。見圖3（箭頭所示）。

圖3　大鼠前爪皮膚黑色素細(xì)胞分布

2.5大鼠血清ghrelin水平

相較于對(duì)照組［（159.23±15.17）ng/L］，模型組血清ghre1in水平［（94.23±11.02）ng/L］明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.6大鼠胃組織ghrelin mRNA和垂體、前爪皮膚組織POMC mRNA表達(dá)

模型組大鼠胃組織ghre1in mRNA表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組大鼠垂體和前爪皮膚組織POMC mRNA表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2　兩組大鼠胃組織ghrelin mRNA和垂體、前爪皮膚組織POMC mRNA表達(dá)比較（±s）

表2　兩組大鼠胃組織ghrelin mRNA和垂體、前爪皮膚組織POMC mRNA表達(dá)比較（±s）

注：ghre1in：腦腸肽；POMC：阿黑皮素原

組別　　只數(shù)　ghre1in mRNA　POMC mRNA垂體　　前爪空白對(duì)照組模型組P值10 9 1.25±0.79 0.91±1.01 0.032 0.35±0.29 0.51±0.92 0.041 0.21±0.68 0.39±1.71 0.021

3　討論

氣色形態(tài)手診已在臨床實(shí)踐中得到了大量的驗(yàn)證和推廣［7］。在氣色形態(tài)手診理論中，胃區(qū)位于手掌的正中心，呈正圓形，向左不超過生命線，向右不超過無名指豎直平分線，而在病理狀態(tài)下，該區(qū)的氣色形態(tài)將發(fā)生一定的改變［8］。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，引起交感神經(jīng)興奮和下丘腦垂體腎上腺功能反應(yīng)是胃損傷應(yīng)激效應(yīng)的機(jī)制，其中起關(guān)鍵作用的是促皮質(zhì)激素釋放因子，該因子由下丘腦釋放，即四十一肽酰胺的中樞效應(yīng)所致［9］。近年的研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激期間ghre1in作為中樞的某些神經(jīng)肽也參與了應(yīng)激過程的調(diào)控［10-12］。ghre1in具有調(diào)節(jié)胃酸分秘、胃腸運(yùn)動(dòng)和能量代謝等功能，主要由胃黏膜的A/X細(xì)胞產(chǎn)生［13］。同時(shí)ghre1in樣兔疫活性細(xì)胞也分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)［14-16］。

POMC是一種29 kD的蛋白質(zhì)，可以在垂體前部釋放對(duì)黑色素生成有重要作用的α-MSH。這種作用是通過與黑素細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)受體（MCIR）結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。結(jié)合后，細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量增加，酪氨酸酶活性增強(qiáng)，進(jìn)而刺激黑色素細(xì)胞分化、增殖，促進(jìn)黑色素的生物合成。ghre1in通過旁分泌、自分泌和內(nèi)分泌作用來調(diào)節(jié)胃腸道和中樞。這種調(diào)節(jié)作用不是孤立的，而是受到中樞前POMC的影響［17］。Ho1m等［18］第一次證明了ghre1in受體的變化的與下丘腦POMC mRNA表達(dá)的變化有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，急性胃黏膜損傷大鼠的前爪5區(qū)（胃區(qū)）黑色素增加，而與黑色素形成息息相關(guān)的POMC mRNA在前爪皮膚組織表達(dá)也增加，胃組織的ghre1in mRNA、垂體的POMC mRNA也發(fā)生變化。一方面驗(yàn)證了ghre1in的表達(dá)受POMC的影響，另一方面提示前爪5區(qū)黑色素的變化可能與POMC、ghre1in的變化有關(guān)，具體明確關(guān)系有待進(jìn)一步的研究去發(fā)現(xiàn)、證實(shí)。

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Research on the ghrelin-POMC pathway of blood melanin change in different areas of forepaw in rats with irritable ulcer

QIN PeijieWANG LiuqingCHENG Zhili DI YingLIU Jianfeng▲
Institute of Chinese Medica1 History Literature，China Academy of Chinese Medica1 Sciences，Beijing100700，China

R573.1

A

1673-7210（2016）04（c）-0012-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81173197）▲

2016-01-24本文編輯：程銘）