右美托咪定可能通過(guò)抑制TLR4通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠急性肺損傷起保護(hù)作用

劉海萍，郭　紅*， 王東偉，高騫皓， 晉學(xué)飛

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科， 黑龍江 佳木斯154002；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 泌尿外科， 吉林 長(zhǎng)春130033)

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右美托咪定可能通過(guò)抑制TLR4通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠急性肺損傷起保護(hù)作用

劉海萍1，郭紅1*， 王東偉1，高騫皓1， 晉學(xué)飛2

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科， 黑龍江 佳木斯154002；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 泌尿外科， 吉林 長(zhǎng)春130033)

摘要：目的研究右美托咪定(Dex)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的膿毒癥(Sep)小鼠急性肺損傷(ALI)起保護(hù)作用的分子機(jī)制。方法將100只清潔級(jí)成年雄性BALB/c小鼠隨機(jī)平均分為高濃度右美托咪定組(A組)、低濃度右美托咪定組(B組)、膿毒癥組(C組)和空白對(duì)照組(D組)。A、B兩組小鼠分別于建模前30 min經(jīng)腹腔注射Dex 12.5 μg/kg和25 μg/kg ，A、B、C三組小鼠均用腹腔內(nèi)注射LPS建立ALI模型，建模后0、12 h用Western blot法檢測(cè)各組小鼠肺組織中TLR-4水平，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)各組小鼠肺組織中MyD88、NF-κB和IL-6水平，并檢測(cè)肺組織濕/干質(zhì)量比(W/D)。結(jié)果建模后，A、B、C三組小鼠肺組織中MyD88、NF-κB和IL-6水平均隨時(shí)間延長(zhǎng)而提高，且均顯著高于D組(P<0.05)。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)A、B、C三組MyD88、NF-κB和IL-6水平存在顯著差異，C組顯著高于A組(P<0.05)，A組顯著高于B組(P<0.05)。結(jié)論TLR-4信號(hào)通路可能參與了膿毒癥大鼠肺損傷過(guò)程，Dex可能通過(guò)抑制TLR-4通路來(lái)實(shí)現(xiàn)膿毒癥大鼠的肺保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：右美托咪定； 肺； 膿毒癥； 炎癥反應(yīng)

(ChinJLabDiagn,2016,20:0887)

膿毒癥(Sepsis)是機(jī)體對(duì)于感染所形成的超強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，常發(fā)生于大手術(shù)術(shù)后、休克、燒傷等患者，其病死率較高[1]。肺組織在膿毒癥中極易受損，形成急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)，患者出現(xiàn)呼吸窘迫，血氧進(jìn)行性下降，是造成膿毒癥患者死亡的主要原因。目前研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體-4(TLR-4)信號(hào)傳導(dǎo)通路在ALI中起到重要作用[2]，通過(guò)阻斷或抑制TLR-4信號(hào)傳導(dǎo)通路成為預(yù)防和治療ALI的新方向。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是α2受體激動(dòng)劑，且具有較高的選擇性，臨床上主要用于對(duì)手術(shù)患者圍術(shù)期的鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛。新近研究發(fā)現(xiàn)Dex具有器官保護(hù)作用[3]，但機(jī)制尚不明了。此次研究擬通過(guò)觀察Dex對(duì)ALI小鼠模型非組織中TLR4的影響，探討Dex對(duì)ALI患者肺保護(hù)的機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：scxk(黑)2013-001]提供的清潔級(jí)BALB/c雄性小鼠100只，體重20-24 g。鹽酸右美托咪定注射液(Dex)購(gòu)自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；脂多糖(LPS)購(gòu)自哈藥集團(tuán)三精加濱藥業(yè)有限公司，來(lái)自于靈桿菌；Toll樣受體4(TLR-4)、髓樣分化因子88(MyD88)、核因子κB (NF-κB)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。采用隨機(jī)數(shù)表法將100只小鼠分為4組：高濃度右美托咪定組(A組)、低濃度右美托咪定組(B組)、膿毒癥組(C組)和空白對(duì)照組(D組)，每組各25只。所有小鼠建模前均禁食12 h，飲水不限制。

1.2方法

1.2.1模型建立A、B組小鼠建模前30 min，經(jīng)腹腔注入Dex 12.5 μg/kg和25 μg/kg。30 min后，將A、B、C三組小鼠經(jīng)腹腔注射LPS，濃度為20 mg/kg，D組小鼠經(jīng)腹腔注射生理鹽水0.2 ml。建模小鼠出現(xiàn)呼吸細(xì)速、抱團(tuán)取暖、口唇發(fā)紺、抓取時(shí)無(wú)力反抗等狀態(tài)，表示建模成功。每組分別于建模后0、2、6、12小時(shí)，采用隨機(jī)數(shù)表法選取5只小鼠斷頸處死取右肺。將右肺上葉和中葉在生理鹽水中制成組織勻漿，5 000 r/min離心20 min，取上層清液置于-80℃冰箱中保存。將建模后12 h處死的小鼠右肺下葉取出后立刻用電子天平稱重，記為濕重，后置于70℃烘干箱中烘干72 h。

1.2.2觀察指標(biāo)將凍存的小鼠肺組織用1 ml裂解液裂解，4℃恒溫，8 000r/min離心20 min，取上層清液0.5 ml，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)TLR-4水平。TLR-4蛋白定量后，用10%濃度的聚丙烯胺凝膠對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行凝膠電泳，此次電泳選用β-actin為內(nèi)參。電泳結(jié)束后，將凝膠轉(zhuǎn)膜、封閉、加入一抗，在4℃環(huán)境中孵育12 h后加入二抗，37℃恒溫孵育2 h后加入顯色液顯色，避光脫色至條帶出現(xiàn)，終止顯色。應(yīng)用Quantity One軟件對(duì)條帶光密度值進(jìn)行定量測(cè)定。此次研究以TLR-4/β-actin比值作為TLR-4的相對(duì)表達(dá)水平。用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)肺組織上清液中MyD88、NF-κB和IL-6水平。所有操作均嚴(yán)格按照相應(yīng)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將建模后12 h處死的小鼠右肺下葉標(biāo)本烘干后再次用電子天平測(cè)量重量，記為干重，據(jù)此計(jì)算干濕比(W/D)。

1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均數(shù)比較采用單因素方差分析；組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組肺組織中TLR-4表達(dá)情況建模后(0 h)，四組小鼠肺組織中TLR-4水平無(wú)明顯差異(P>0.05)；建模12 h后，A、B、C三組小鼠肺組織中TLR-4水平顯著升高，C組顯著高于A、B、D組(P<0.05)，A組顯著高于B組(P<0.05)。見(jiàn)圖1、2。

圖1　建模后0 h

圖2　建模12 h后

2.2各組肺組織中MyD88和NF-κB表達(dá)情況建模成功后(0 h)，四組小鼠肺組織中MyD88和NF-κB水平無(wú)顯著差異(P<0.05)，建模2 h至12 h，A、B、C三組小鼠肺組織中MyD88和NF-κB水平均逐漸升高，且均顯著高于D組(P<0.05)，但組間存在顯著差異(P<0.05)，C組顯著高于A組，A組顯著高于B組。見(jiàn)表1。

表1　各組肺組織中MyD88和NF-κB表達(dá)情況

2.3各組肺組織中IL-6表達(dá)情況建模成功后(0 h)，四組小鼠肺組織中IL-6水平無(wú)顯著差異(P<0.05)，建模2 h至12 h，A、B、C三組小鼠肺組織中IL-6水平均逐漸升高，且均顯著高于D組(P<0.05)，但組間存在顯著差異(P<0.05)，C組顯著高于A組，A組顯著高于B組。見(jiàn)表2。

表2　各組肺組織中IL-6表達(dá)情況(pg/ml)

2.4建模12 h各組小鼠肺組織W/D情況建模12 h后，D組小鼠W/D為(4.3±0.5)，A組小鼠W/D為(4.8±0.9)，B組小鼠W/D為(4.5±0.8)，C組小鼠W/D為(6.7±1.2)，C組顯著高于另外三組(P<0.05)。

3討論

膿毒癥導(dǎo)致急性肺損傷的病理生理基礎(chǔ)是大量炎癥因子的釋放，導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，致使肺組織嚴(yán)重水腫，氧合作用下降，血氧急性進(jìn)行性降低，故抑制炎癥反應(yīng)，治療急性肺損傷是降低膿毒癥病死率的重要一環(huán)[4-6]。

龔小衛(wèi)等人在研究中發(fā)現(xiàn)，脂多糖(LPS)注入小鼠腹腔后，LPS結(jié)合蛋白與之結(jié)合，繼而激活Toll樣受體4(TLR4)信號(hào)通路[7]。TLR-4是TLR家族跨膜受體蛋白的一員，是機(jī)體內(nèi)非特異性免疫過(guò)程中重要的蛋白之一。目前研究發(fā)現(xiàn)，TLR-4主要在巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面[8]。當(dāng)外源性LPS突破機(jī)體物理屏障后，TLR-4識(shí)別LPS，并與之結(jié)合，進(jìn)而釋放大量炎性因子，這些炎性因子通過(guò)刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧簇，造成肺組織毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，形成肺水腫，于健認(rèn)為這可能是形成ALI的原因之一[9]。石計(jì)朋在一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ALI大鼠肺組織中IL-6和TNF-α水平顯著升高[10]。而IL-6和TNF-α是ALI中啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的起始因子。有研究證實(shí)[11,12]，TLR-4可以通過(guò)激活MyD88非依賴型TRIL信號(hào)通路，激活TRL-4胞內(nèi)尾狀結(jié)構(gòu)，使之與MyD88蛋白分子結(jié)構(gòu)中的TLR受體結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)刺激信號(hào)的傳導(dǎo)，啟動(dòng)蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)。楊晶的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這個(gè)過(guò)程中，NF-κB結(jié)構(gòu)中的IκB被磷酸化，并從NF-κB中解離，實(shí)現(xiàn)NF-κB的激活，從而促進(jìn)致炎因子的大量釋放[13]。

此次研究發(fā)現(xiàn)，Sep模型建立2 h后，A、B、C三組小鼠肺組織中TLR-4、MyD88、NF-κB和IL-6水平均顯著升高，且顯著高于D組；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，A、B、C三組TLR-4、MyD88、NF-κB和IL-6水平逐漸升高，這與蔣海弦的研究結(jié)果相似，提示TLR4通路可能參與了ALI的形成[14]。此次研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，A、B兩組小鼠肺組織中TLR-4、MyD88、NF-κB和IL-6水平在除建模0 h外各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于C組，且B組顯著低于A組。Dex在臨床中主要用于圍術(shù)期患者的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛，并可以通過(guò)激活突觸前α2受體來(lái)抑制交感神經(jīng)產(chǎn)生沖動(dòng)，且對(duì)呼吸作用影響較小。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定具有抗炎作用，在膿毒癥小鼠模型中可以保護(hù)肝、肺等器官[15]。此次研究結(jié)果證實(shí)，Dex對(duì)Sep小鼠有較明顯的抗炎、減輕炎癥導(dǎo)致的肺損傷的作用，且抗炎效果與濃度有關(guān)，25 μg/kg濃度的抗炎效果顯著優(yōu)于12.5 μg/kg濃度。這提示Dex可能抑制了Sep小鼠肺組織中TLR-4的表達(dá)，從而降低了MyD88和NF-κB的合成，同時(shí)下調(diào)了炎癥肺組織中炎癥因子的水平。

綜上，TLR-4信號(hào)通路可能參與了膿毒癥大鼠肺損傷過(guò)程，Dex可能通過(guò)抑制TLR-4通路來(lái)實(shí)現(xiàn)膿毒癥大鼠的肺保護(hù)作用。

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*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)06-0887-04

中圖分類號(hào)：R614

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

(收稿日期：2015-11-27)

Dexmedetomidine may inhibit the TLR4 pathway play a protective effect on the acute lung injury in sepsis mice induced by LPS

LIUHai-ping，GUOHong,WANGDong-wei,etal.

(DepartmentofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi154002,China)

Abstract:ObjectiveStudy on the molecular mechanism of protective effect of dexmedetomidine on acute lung injury in sepsis mice induced by lipopolysaccharide.MethodsPut randomly 100 clean grade adult male BALB/c mice into high concentrations of dexmedetomidine group (group A),low concentrations of dexmedetomidine group (group B),sepsis sepsis group (Group C) and blank control group (Group D).A and B group of mice were injected DEX 12.5 mu g / kg and 25 g/kg before 30 min of modeling.A,B and C group of mice were intraperitoneal injection of LPS to establish the model of ALI.Detecting the level of TLR-4 in lung tissue of mice with Western blot after modeling 0 and 12 hours.Using enzyme linked immunosorbent method (ELISA) to detected MyD88,NF-κB and IL-6 levels in the lung tissue of the mice,and detection of lung tissue wet/dry weight ratio (W/D).ResultsAfter modeling,level of MyD88,NF-κB and IL-6 in A,B and C group were increaseing with time,and were significantly higher than D group (P<0.05).Level of MyD88,NF- three groups of NF-κB in C group were significantly higher than that of group A (P<0.05),and those in A group was significantly higher than that of group B (P<0.05).ConclusionTLR-4 signaling pathway may be involved in the process of lung injury in septic rats,Dex may inhibit the TLR-4 pathway to achieve lung protective effect in septic rats.

Key words:Dexmedetomidine;lung;sepsis;inflammatory reaction