干細(xì)胞因子在嚴(yán)重?zé)齻笫竽c組織中的表達(dá)

王永杰，嚴(yán)　珺，李　雷，尹　飛，盧日峰，郭　麗*

(1．吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春130021；2．吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科，吉林 長(zhǎng)春130033)

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干細(xì)胞因子在嚴(yán)重?zé)齻笫竽c組織中的表達(dá)

王永杰1，嚴(yán)珺1，李雷1，尹飛2，盧日峰1，郭麗1*

(1．吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春130021；2．吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科，吉林 長(zhǎng)春130033)

摘要：目的觀察嚴(yán)重?zé)齻蟛煌瑫r(shí)間大鼠小腸損傷情況以及干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)在受損小腸組織的表達(dá)。方法Wistar雄性大鼠按照隨機(jī)原則分為5組，燒傷前組、嚴(yán)重?zé)齻Ｐ?天組、2天組、4天組和對(duì)照組，每組6只。制備嚴(yán)重?zé)齻Ｐ秃?，每天觀察并記錄大鼠一般狀態(tài)和體質(zhì)量變化。HE染色觀察大鼠小腸組織病理組織變化，免疫組織化學(xué)和蛋白印跡法檢測(cè)SCF蛋白的表達(dá)。結(jié)果對(duì)照組體質(zhì)量逐漸上升，而燒傷組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，至燒傷后2天和4天燒傷組體重顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。HE染色結(jié)果顯示燒傷前小腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)正常；燒傷組有不同程度損傷，如間質(zhì)和固有層水腫，上皮細(xì)胞變性壞死，絨毛頂端囊狀間隙甚至脫落，燒傷后2天最嚴(yán)重。免疫組織化學(xué)和Western blot結(jié)果都顯示與燒傷前比較小腸組織燒傷后1天SCF表達(dá)減少，2天和4天有所回升(P<0.05)。結(jié)論嚴(yán)重?zé)齻梢詫?dǎo)致大鼠小腸組織損傷，SCF在燒傷導(dǎo)致的大鼠腸道損傷中發(fā)揮著一定的作用。

關(guān)鍵詞：燒傷；腸損傷；干細(xì)胞因子

(ChinJLabDiagn,2016,20:0875)

燒傷是一種由火焰、高溫液體、放射線等因素導(dǎo)致的常見的外傷性疾病。我國(guó)將總燒傷面積30%以上以及燒傷深度三度且面積10%以上的定義為重度燒傷，這類燒傷會(huì)引起體液滲出和全身應(yīng)激反應(yīng)，治療不當(dāng)會(huì)引發(fā)休克危及生命。目前臨床上以補(bǔ)充血容量，積極防治休克和繼發(fā)性感染，合理營(yíng)養(yǎng)為主，療效欠佳。嚴(yán)重?zé)齻麑?dǎo)致機(jī)體損傷的機(jī)制復(fù)雜，治療困難，死亡率高。研究者現(xiàn)在普遍認(rèn)為燒傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，血管通透性增加，導(dǎo)致有效血容量下降，機(jī)體維持心臟和大腦等重要臟器的血供，外周組織血供減少，胃腸道的血供下降最為明顯，損傷尤為嚴(yán)重[1]。干細(xì)胞因子在腸組織維持一定的濃度是保證胃腸道調(diào)控Cajal間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，繁殖和功能維持的基礎(chǔ)[2,3]。干細(xì)胞因子缺乏可能導(dǎo)致自主腸蠕動(dòng)障礙[4]，腸道T細(xì)胞增殖能力減少，免疫功能降低[5]。有研究報(bào)道干細(xì)胞因子在腎毒性血清性腎炎組織中表達(dá)有所增長(zhǎng)[6]，而增高干細(xì)胞因子的表達(dá)有助于腦缺血再灌注后行動(dòng)能力恢復(fù)[7]，改善糖尿病大鼠膀胱組織損傷[8]。干細(xì)胞因子在燒傷腸組織不同時(shí)間的表達(dá)情況仍不清楚，其在燒傷腸組織損傷中的作用機(jī)制尚未見報(bào)道。

本研究擬定通過檢測(cè)干細(xì)胞因子在嚴(yán)重?zé)齻笫笮∧c組織的表達(dá)，初步探討燒傷后腸道組織損傷與干細(xì)胞因子之間的關(guān)系，為后期研究提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠，體重在240-280 g，購(gòu)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1燒傷腸損傷動(dòng)物模型建立將實(shí)驗(yàn)大鼠按照隨機(jī)原則分為5組，燒傷前組，嚴(yán)重?zé)齻Ｐ?天組、2天組、4天組和對(duì)照組(未做燒傷處理，跟蹤體重和一般狀態(tài))，每組6只。用8%硫化鈉脫去大鼠背部被毛，溫水清洗干凈。12 h禁食不禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，燒傷組大鼠背部20%體表面積皮膚浸入97±1℃熱水中18 s制作燒傷模型，并立即補(bǔ)充生理鹽水40 ml/kg·bw，做好保溫處理并隨時(shí)觀察大鼠狀態(tài)和復(fù)蘇情況，燒傷前組與對(duì)照組不作處理，大鼠自由地飲水和進(jìn)食，每日觀察大鼠的一般狀態(tài)并記錄體質(zhì)量。

1.2.2動(dòng)物取材10%的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠，頸椎脫臼處死，迅速取出腸組織。

1.2.3病理組織學(xué)觀察大鼠小腸組織10%中性甲醛溶液中固定，脫水、透明，石蠟包埋、切片，HE染色，鏡下觀察。

1.2.4免疫組化石蠟切片脫蠟水化，98℃檸檬酸抗原修復(fù)液5 min，冷卻至室溫。加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育12 min，動(dòng)物非免疫血清封閉30 min，兔抗大鼠SCF抗體(1∶200稀釋)4℃孵育過夜，生物素標(biāo)記的羊抗兔的二抗，室溫作用30 min，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染后脫水透明，中性樹膠封片。

1.2.5蛋白印跡提取各組大鼠小腸組織總蛋白，上樣量30 μg，電泳、轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉，兔抗大鼠SCF(1∶2 000稀釋)4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000稀釋)室溫作用1 h，暗室中曝光顯影定影。Quantity One軟件分析SCF灰度值與內(nèi)參ACTB灰度值的比值代表定量值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1一般狀態(tài)和體質(zhì)量

造模結(jié)束后，對(duì)照組大鼠狀態(tài)良好；燒傷模型組大鼠皮膚創(chuàng)面早期呈現(xiàn)蒼白色，一天后變暗逐漸轉(zhuǎn)為焦黑色，脫水后局部變硬可形成焦痂，有的可見栓塞血管，皮下組織間隙積液。模型組大鼠精神不佳，進(jìn)水進(jìn)食和活動(dòng)減少。實(shí)驗(yàn)初始體質(zhì)量各組間無差異，對(duì)照組體質(zhì)量逐漸上升，而燒傷組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，至燒傷后2天和4天燒傷組體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(見圖1)。

注：*P<0.05，與對(duì)照組比較

2.2病理組織學(xué)觀察

燒傷前組大鼠皮膚組織層次清晰，結(jié)構(gòu)完整，燒傷組大鼠皮膚損傷累及全層，出現(xiàn)不同程度血管充血，角質(zhì)層脫落，細(xì)胞壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2)。證實(shí)嚴(yán)重?zé)齻Ｐ驮炷３晒Α?/p>

燒傷前組小腸細(xì)胞形態(tài)正常，絨毛結(jié)構(gòu)完整、排列整齊；燒傷模型組大鼠腸組織有不同程度損傷表現(xiàn)，間質(zhì)和固有層水腫，絨毛頂端囊狀間隙甚至脫落，上皮細(xì)胞變性壞死。2天損傷表現(xiàn)最為嚴(yán)重，4天有所改善(見圖3)。

2.3免疫組化結(jié)果

燒傷后一天時(shí)SCF表達(dá)量與燒傷前相比減少，第二天后表達(dá)量有些回升，且各組間比較差異顯著(P<0.05)(見圖4)。

2.4Western blot結(jié)果

與燒傷前比較，SCF蛋白在燒傷后1天組大鼠腸組織中表達(dá)量有所下降，2天組和4天組明顯增高，差異顯著(P<0.05)(見圖5)。

A燒傷前組 B 燒傷1天組 C燒傷2天組 D燒傷4天組

A燒傷前組 B 燒傷1天組 C燒傷2天組 D燒傷4天組

A燒傷前組 B 燒傷1天組 C燒傷2天組 D燒傷4天組

注：*P<0.05，與燒傷前組比較；#P<0.05，與燒傷后1天組比較

3討論

燒傷模型組大鼠皮膚蒼白，碰觸沒有疼痛反射，轉(zhuǎn)而變暗變硬形成焦痂，有的可見樹枝狀血管栓塞，HE結(jié)果顯示燒傷累及大鼠皮膚組織全層，結(jié)合燒傷范圍基本可以確定嚴(yán)重?zé)齻炷３晒?。腸組織HE染色可見于燒傷后1天大鼠小腸組織絨毛上皮細(xì)胞變性壞死，排列紊亂，絨毛頂端出現(xiàn)囊狀間隙甚至脫落，間質(zhì)和固有層水腫。2天損傷表現(xiàn)最為嚴(yán)重，4天有所改善。腸組織在嚴(yán)重?zé)齻麜r(shí)可有明顯病理損傷。小腸粘膜細(xì)胞生長(zhǎng)快，4天即可以完成一次自我更新?？紤]為燒傷后部分尚有功能干細(xì)胞更替受損上皮細(xì)胞[9]，故燒傷后4天可見有一些好轉(zhuǎn)。

干細(xì)胞因子是一種酸性糖蛋白，是骨髓基質(zhì)細(xì)胞在骨髓微環(huán)境中所產(chǎn)生的。有研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞因子可以改變骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的微管結(jié)構(gòu)[10]，促進(jìn)BMSCs定位到損傷的心肌和肝臟組織并分化成具有功能細(xì)胞在損傷局部發(fā)揮修復(fù)作用[11,12]。此外可以調(diào)控胃腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖、功能以及維持腸道免疫[2,3]。

我們的研究結(jié)果顯示相對(duì)于燒傷前，燒傷后1天SCF蛋白表達(dá)有所降低，2天開始回升，4天基本恢復(fù)至損傷前的狀態(tài)。以往的研究曾報(bào)道燒傷可以導(dǎo)致大鼠腸系膜微動(dòng)脈血管管徑減小，血液流速降低、流量減少[13]1天后逐漸回升[14]。大鼠腸在燒傷應(yīng)激時(shí)結(jié)腸組織干細(xì)胞因子SCF的編碼基因Kitl在損傷后表達(dá)降低，2天后開始有所回升[15]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究時(shí)間規(guī)律基本吻合?？赡転闊齻竽c組織損傷促使骨髓干細(xì)胞動(dòng)員，血液干細(xì)胞因子增多，而短期腸組織循環(huán)血量減少導(dǎo)致短暫低值。之后血運(yùn)逐漸恢復(fù)，干細(xì)胞因子隨之到達(dá)受損組織，此外干細(xì)胞因子可以進(jìn)一步刺激干細(xì)胞動(dòng)員至損傷部分[16]致使局部組織干細(xì)胞因子編碼基因表達(dá)增高。

干細(xì)胞因子在燒傷后小腸組織表達(dá)的增多具體是通過什么途徑完成，其對(duì)燒傷腸組織損傷是否具有修復(fù)作用和具體機(jī)制仍待進(jìn)一步證實(shí)。

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基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81573067)； 吉林省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助課題(20130413023GH)；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2015533)；吉林省衛(wèi)生計(jì)生科研計(jì)劃項(xiàng)目(2014Z046)

*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)06-0875-04

中圖分類號(hào)：R392

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

(收稿日期：2015-12-18)

Expression of stem cell factor in the intesines in the severely burned rats

WANGYong-jie1,YANJun1,LILei1,etal.

(1.DepartmentofToxicology,SchoolofPublicHealth,JilinUniversity,Changchun130021,China;2.DepartmentofOrthopedic,China-JapanUnionHospital,JilinUniversity,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the small intestinal injury and stem cell factor expression of the damaged intestinal tissues in rats at different time after severe burn.MethodsMale Wistar rats were randomly divided into 5 groups:group before burn,severe burn models on day 1,day 2,day 4,and control group,6 rats in each group.Severe burn models were prepared,rats body weights were recorded and general status were observed daily.Histopathological changes of small intestines of rats were observed by HE staining,detection of SCF expression was carried out by immunohistochemistry and Western blot.ResultsRats body weights increased gradually in the control group,body weights of model groups on the second and fourth days after severe burn were significantly lower than that in the control group (P<0.05).HE staining results showed that small intestines in the group before burn arranged neatly,cells presented normal morphology;in burn model groups,rats had varying degrees of burn injury,such as interstitial and propria edema,and epithelial cells degeneration and necrosis the top of villus fallen off.Pathological changes were most serious on the second day.Immunohistochemistry and Western blot results both showed SCF expression significantly reduced 1 day after burn compared with group before burn(P<0.05),rallied notablely on day 2 and day 4.ConclusionSevere burn can lead to intestinal injury of rats,SCF plays a role in burn-induced intestinal injury of rats.

Key words:burn;intestinal injury;stem cell factor