慢性應(yīng)激大鼠海馬DG區(qū)牛磺酸在空間學(xué)習(xí)記憶過程中的變化

張兆一，任美玲，楊　朋，李　靜，吳建龍，陳靜伊，金清華*

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1.2012級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè);2.2012級(jí)麻醉學(xué)專業(yè);3.生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室;4.2013級(jí)麻醉學(xué)專業(yè)，吉林 延吉133002)

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慢性應(yīng)激大鼠海馬DG區(qū)牛磺酸在空間學(xué)習(xí)記憶過程中的變化

張兆一1，任美玲2，楊朋2，李靜2，吳建龍3，陳靜伊4，金清華3*

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1.2012級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè);2.2012級(jí)麻醉學(xué)專業(yè);3.生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室;4.2013級(jí)麻醉學(xué)專業(yè)，吉林 延吉133002)

摘要：目的觀察海馬齒狀回(Dentate Gyrus,DG)區(qū)的?；撬?Taurine，Tau)在慢性應(yīng)激模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶過程中的變化，初步探討慢性應(yīng)激影響大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的部分機(jī)制。方法SD雄性大鼠16只，隨機(jī)分為對(duì)照組和慢性應(yīng)激組。以多種刺激隨機(jī)應(yīng)用的方法制備慢性應(yīng)激大鼠模型，并利用腦部微量透析法和HPLC法實(shí)時(shí)觀察慢性應(yīng)激大鼠海馬DG區(qū)細(xì)胞外液中Tau的含量。其次，利用Morris水迷宮(Morris Water Maze，MWM)觀察大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，并觀察海馬DG區(qū)Tau含量在MWM訓(xùn)練過程中的變化。結(jié)果1)慢性應(yīng)激組大鼠海馬DG區(qū)細(xì)胞外液中的Tau含量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。2)MWM的定位航行實(shí)驗(yàn)中，兩組大鼠的逃避潛伏期均隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加而減少，而慢性應(yīng)激組大鼠訓(xùn)練第4天的逃避潛伏期明顯小于對(duì)照組(P<0.05)；MWM的空間探索實(shí)驗(yàn)中，慢性應(yīng)激組的穿越原站臺(tái)區(qū)次數(shù)顯著多于對(duì)照組(P<0.05)。3)MWM訓(xùn)練過程中，慢性應(yīng)激組大鼠海馬DG區(qū)的Tau含量出現(xiàn)明顯的增加(P<0.05)，而對(duì)照組大鼠海馬DG區(qū)的Tau含量未出現(xiàn)明顯變化(P>0.05)，兩組間有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論慢性應(yīng)激可以提高大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，這可能與海馬DG區(qū)的Tau含量增加有關(guān)。

關(guān)鍵詞：慢性應(yīng)激；海馬齒狀回；?；撬幔豢臻g學(xué)習(xí)和記憶；大鼠

(ChinJLabDiagn,2016,20:0871)

應(yīng)激是機(jī)體對(duì)有害或有潛在威脅的體內(nèi)外刺激所做出的非特異性防御反應(yīng)，它在整體功能全面動(dòng)員的基礎(chǔ)上提高機(jī)體對(duì)有害刺激的耐受能力，減輕各種不良反應(yīng)[1]。雖然應(yīng)激對(duì)維持機(jī)體生命活動(dòng)具有極其重要的意義，但持續(xù)而嚴(yán)重的應(yīng)激會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生負(fù)面影響，成為許多疾病的重要病因和誘因[1]，因此，關(guān)于應(yīng)激對(duì)各種生理功能的作用及其機(jī)制的研究得到學(xué)術(shù)界普遍的關(guān)注。眾所周知，學(xué)習(xí)記憶是機(jī)體改變自身行為或產(chǎn)生新行為以適應(yīng)環(huán)境的必要過程，而海馬在學(xué)習(xí)記憶，尤其在空間學(xué)習(xí)和記憶中扮演著重要的角色[2]。日常生活中人們所處的應(yīng)激多數(shù)為慢性應(yīng)激 (chronic stress,CS)，在CS的情況下，機(jī)體將加大對(duì)糖皮質(zhì)激素的釋放，而海馬是血漿糖皮質(zhì)激素作用的主要靶區(qū)[3]，研究報(bào)道，CS可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元樹突形態(tài)學(xué)的改變和抑制神經(jīng)元的發(fā)生，進(jìn)而影響海馬依賴性的學(xué)習(xí)和記憶功能[4]。

哺乳動(dòng)物的海馬一般可分為CA1、CA3和齒狀回(dentate gyrus,DG)等，這3個(gè)亞區(qū)在學(xué)習(xí)記憶過程中各自起不同作用，其中DG區(qū)是新信息進(jìn)入海馬的傳入點(diǎn)，它把進(jìn)來的信息進(jìn)行編碼和加工，對(duì)學(xué)習(xí)記憶至關(guān)重要[2]。本課題組先前的研究表明，海馬DG區(qū)的天冬氨酸、谷氨酸(glutamate,Glu)和?；撬?taurine，Tau)在主動(dòng)回避學(xué)習(xí)過程中明顯增加[5]，而且黃芪改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力可能與DG區(qū)Tau增加相關(guān)[6]。Tau分布在大腦皮質(zhì)、海馬、小腦等腦區(qū)，可作為神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)起作用。雖然已有研究報(bào)道，CS可通過影響DG區(qū)神經(jīng)再生而改變海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶功能[4]，但關(guān)于CS對(duì)海馬DG區(qū)Tau的含量是否有影響未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)利用Morris水迷宮(Morris water maze，MWM)觀察CS大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的過程中，利用腦部微量透析和HPLC法觀察了DG區(qū)的Tau含量的變化。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和慢性應(yīng)激模型的制備

16只健康雄性SD大鼠(體重為200±20 g)由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供)隨機(jī)分成兩個(gè)組，即對(duì)照組和CS組，每組各8只，均單籠飼養(yǎng)。應(yīng)激刺激選用束縛2 h、夾尾1 min、冰水浴5 min、潮濕墊料24 h、噪音和足底電刺激。將上述6種刺激隨機(jī)安排，每日1 種刺激，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，共刺激30 d，使動(dòng)物無法預(yù)料刺激。對(duì)照組大鼠自由飲食、攝水，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中不接受任何刺激。

1.2海馬DG區(qū)細(xì)胞外液中的Tau含量的測(cè)定

CS模型制備成功后第2天，大鼠進(jìn)行腹腔麻醉(10%的水合氯醛，300 mg/kg)后固定于腦立體腦定位儀上，參考Paxinos和Watson大鼠腦圖譜，將透析用外套管插入到DG上方1 mm處(定位坐標(biāo)為前囟后3.4 mm ,正中線左2.2 mm,深 2.5 mm),并用牙托水泥固定于顱骨表面。術(shù)后第二天，在動(dòng)物清醒狀態(tài)下，通過透析用外套管將微量透析探針插入到DG區(qū)并固定在外套管上，探針超出外套管1.5 mm，其前端乙酸纖維素半透膜(DM-22，Eicom,日本)，可濾過分子量小于5×104的物質(zhì)。微量透析探針和微量泵(ESP-64，日本Eicom公司)連接，灌流改良Ringer’s液(147 mM NaCl，4 mM KCl，2.3 mM CaCl2，pH 6.5)，流速為1.5 μl/min,穩(wěn)定30 min后,用自動(dòng)收集器收集微量透析樣本,每管收集10 min,每次收集3個(gè)管,將其放入-80℃冰箱，以備測(cè)定Tau濃度。大鼠回籠飼養(yǎng)24 h后開始進(jìn)行MWM訓(xùn)練，每天訓(xùn)練后，經(jīng)透析探針收集海馬DG區(qū)微量透析樣本。

取12 μl的解凍后的樣本，加入3 μl的OPA溶液(4 mM)，在室溫下反應(yīng)2.5 min,然后抽取10 μl反應(yīng)液注入到生物活性物質(zhì)微量分析系統(tǒng) (HTEC-300，日本Eicom公司),通過其高效液相色譜分離柱和電化學(xué)檢測(cè)器分析出Tau的含量。

1.3MWM實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用MWM進(jìn)行空間學(xué)習(xí)和記憶能力的檢測(cè)，包括定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)時(shí)，水面高約45 cm，室溫及水溫均保持在22±2℃，站臺(tái)(直徑10 cm)任意放置于某一象限的中心位置并淹沒于水面下約2 cm處；每只大鼠按東西南北4個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池，每次游泳時(shí)限為120 s，若在120 s內(nèi)大鼠找到并爬上站臺(tái)，需讓其在站臺(tái)上站立5 s，若120 s以內(nèi)未找到站臺(tái)，需由測(cè)試者引領(lǐng)其找到并爬上站臺(tái)，此時(shí)的潛伏期記錄為120 s；每天訓(xùn)練1次，連續(xù)4 d?？臻g探索實(shí)驗(yàn)在MWM訓(xùn)練開始第5 d進(jìn)行，除了撤去站臺(tái)，其他條件不變，從同一個(gè)入水點(diǎn)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放入水中，測(cè)量它在120 s內(nèi)穿越原站臺(tái)區(qū)的次數(shù)。

1.4組織學(xué)鑒定

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物過量麻醉處死，取腦固定于10%的福爾馬林溶液中，進(jìn)行冠狀面的冰凍切片(厚度約60 μm)、中性紅染色，光學(xué)顯微鏡下確定透析探針的位置是否在海馬DG區(qū)，透析探針沒有進(jìn)入DG區(qū)者不計(jì)入統(tǒng)計(jì)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1CS對(duì)大鼠海馬DG區(qū)Tau含量的影響

CS組進(jìn)行慢性應(yīng)激刺激30 d后，每只大鼠收集三個(gè)管的海馬DG區(qū)微量透析樣本，高效液相色譜法測(cè)定每個(gè)管的Tau的含量，取平均值。結(jié)果顯示，CS組海馬DG區(qū)細(xì)胞外液中的Tau含量為1.39±0.24 μM，與對(duì)照組的0.41±0.09 μM相比，顯著增加(P<0.05，圖1)。

*P<0.05，與對(duì)照組相比。

2.2CS對(duì)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

兩組大鼠在為期4 d的水迷宮定位航行訓(xùn)練中，隨訓(xùn)練次數(shù)的增加，其逃避潛伏期均有不同程度的縮短：對(duì)照組大鼠訓(xùn)練第3和第4 d的逃避潛伏期分別為30.95±6.96 s、31.15±4.80 s,與第1 d(55.59±5.72 s)相比顯著降低(均為P<0.05，圖2)；CS組大鼠第3、第4 d的逃避潛伏期分別為20.22±4.70 s和17.14±2.84 s，與第1 d(44.97±8.29 s)相比顯著降低(均為P<0.05，圖2)。CS組大鼠第4 d的逃避潛伏期明顯短于對(duì)照組(P<0.05，圖2)，提示CS可促進(jìn)大鼠的空間學(xué)習(xí)功能。

訓(xùn)練第5 d移除站臺(tái)，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，慢性應(yīng)激組120 s內(nèi)穿越原平臺(tái)區(qū)次數(shù)為11.00±5.36次，與對(duì)照組的5.17±1.94次相比，明顯增加(P<0.05，圖3)，提示CS可以提高大鼠的空間記憶能力。

2.3海馬DG區(qū)Tau含量在大鼠空間學(xué)習(xí)記憶過程中的變化

為了探討CS是否通過影響海馬DG內(nèi)的Tau含量來調(diào)節(jié)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，本實(shí)驗(yàn)還觀察了MWM訓(xùn)練過程中的DG區(qū)Tau含量的變化。在 MWM訓(xùn)練過程中，CS組大鼠海馬DG區(qū)的Tau含量逐漸增加，訓(xùn)練第3 d和訓(xùn)練開始前相比有顯著性差異(P<0.05)，其后逐漸回降，與之相比，對(duì)照組大鼠海馬DG的Tau含量在訓(xùn)練過程中未出現(xiàn)明顯變化(均為P>0.05)，兩組間有顯著性差異(P<0.05)(圖4)。

#P<0.05，與第一天相比；*P<0.05，與對(duì)照組相比。

*P<0.05，與對(duì)照組相比。

以訓(xùn)練前的Tau含量作為100%，計(jì)算出每天訓(xùn)練后的Tau含量百分比。#P<0.05，與訓(xùn)練前相比；*P<0.05，與對(duì)照組相比。

圖4海馬DG區(qū)Tau含量在MWM訓(xùn)練過程中的變化

3討論

應(yīng)激是生活中不可避免的事件，人們?yōu)榱诉m應(yīng)日益強(qiáng)烈的競(jìng)爭，需要承受來自不同方面的種種壓力，常常處于應(yīng)激，尤其是慢性應(yīng)激(CS)狀態(tài)，而由它引起的問題也隨之而來。輕度的刺激多數(shù)情況下會(huì)提高個(gè)體的學(xué)習(xí)記憶能力，如果是刺激頻率大、刺激時(shí)間延長或者刺激程度加強(qiáng)的CS則多會(huì)引發(fā)生理功能的異常。制備CS模型大鼠時(shí)用的刺激方法種類較多，常見的有：光照刺激、晝夜交替、無墊料或潮濕墊料、鼠籠震蕩、鼠籠傾斜、冷熱刺激、束縛刺激、電刺激、噪聲刺激、禁食水等，根據(jù)CS相關(guān)文獻(xiàn)[7]，以及本實(shí)驗(yàn)室的條件，我們選擇束縛、夾尾、冰水浴、足底電擊、噪音、潮濕墊料等六種刺激，每天隨機(jī)給予一種刺激，共30 d，制備了慢性不可預(yù)見性應(yīng)激模型，并利用MWM觀察了這種CS對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。本實(shí)驗(yàn)中CS組大鼠找到隱藏站臺(tái)的逃避潛伏期明顯縮短，而且撤去站臺(tái)后120 s內(nèi)穿越原站臺(tái)區(qū)的次數(shù)顯著增加，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CS可以提高大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶的能力。

學(xué)習(xí)和記憶是多種腦高級(jí)功能的基礎(chǔ)，而海馬在哺乳類動(dòng)物學(xué)習(xí)和記憶的形成中扮演主要角色。文獻(xiàn)報(bào)道，海馬內(nèi)的氨基酸類物質(zhì)，如Glu、γ-氨基丁酸、甘氨酸、Tau等，參與海馬的學(xué)習(xí)記憶功能的調(diào)節(jié)中[8]。如在前言所述，海馬DG區(qū)在新信息的處理和編碼中起關(guān)鍵作用[2]，而本課題組先前的研究證明，在大鼠的主動(dòng)回避條反射過程中伴有DG內(nèi)氨基酸類物質(zhì)的增加[5]，且黃芪改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力可能與DG區(qū)Tau增加相關(guān)[6]。為探討CS的改善空間學(xué)習(xí)記憶的作用是否與海馬內(nèi)的Tau有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)利用腦部微量透析法和高效液相色譜法測(cè)定了海馬DG區(qū)細(xì)胞外液中的Tau的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CS可明顯增加大鼠海馬DG區(qū)Tau基礎(chǔ)含量，同時(shí)也增強(qiáng)Tau在空間學(xué)習(xí)記憶過程中的反應(yīng)。研究表明，Tau不僅促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶功能和神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育，而且還可通過抑制Glu活性來減輕腦缺血時(shí)的Glu的神經(jīng)毒性作用[9,10]。另外，Tau對(duì)學(xué)習(xí)記憶的促進(jìn)作用可能還與增加海馬內(nèi)Fos蛋白、β-內(nèi)啡肽，加壓素的含量有關(guān)[11，12]。因此，我們推測(cè)CS促進(jìn)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能，可能與海馬DG區(qū)Tau含量增加有關(guān)，但其具體的下游機(jī)制有待于進(jìn)一步探究。

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基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31560278)；延邊大學(xué)本科生科研項(xiàng)目(ydbksky201577)

*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)06-0871-04

中圖分類號(hào)：Q427

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

作者簡介：張兆一(1993-)，男，臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生，研究方向?yàn)樯窠?jīng)生理學(xué)。

(收稿日期：2016-01-15)

Change of taurine in hippocampal dentate gyrus during spatiallearning and memory in a rat model of chronic stress

ZHANGZhao-yi1,RENMei-ling2,YANGPeng2,etal.

(1.Grade2012StudentsMajorinClinicalMedicine;2.Grade2012StudentsMajorinAnaesthesia;3.DepartmentofPhysiologyandPathophysiology;4.Grade2013StudentsMajorinAnaesthesia,YanbianUniversityCollegeofMedicine,Yanji133002,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the changes of extracellular level of taurine (Tau) in the hippocampal dentate gyrus (DG) in a rat model of chronic stress during Morris water maze (MWM) test,and primarily investigate the neurochemical mechanism responsible for effect of chronic stress on spatial learning and memory.MethodsTotally 16 SD rats were randomly divided into two groups,control group and chronic stress (CS) group.The rat model of CS was prepared by random application of varied stressors,and then the extracellular concentration of Tau in the DG was determined by in vivo microdialysis and HPLC.Next,the spatial learning and memory abilities of rats were assessed by Morris water maze (MWM),and the extracellular concentration of Tau in the DG was simultaneously observed.Results1) Compared with the control group,the extracellular concentration of Tau in hippocampal DG was significantly increased in CS group (P<0.05).2) In the place navigation trial of MWM test,the escape latency decreased in both control and CS groups over the course of the training days,however,on the 4th day,escape latency was significantly shorter in CS group compared with control group (P<0.05); in the spatial prove trial of MWM test,the number of platform crossings was markedly increased in CS group compared with control group(P<0.05).3) During MWM test,Tau level in the DG was significantly increased in CS group (P<0.05),while it was not changed in control group(P>0.05).ConclusionChronic stress facilitates the spatial learning and memory in rats,which may be related to the increase of Tau in hippocampal DG region.

Key words:chronic stress; dentate gyrus;taurine;spatial learning and memory;rats